王媛媛,曹杰楠,夏夢瑩,嚴國俊,潘金火

(南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023)

山楂葉為薔薇科植物山里紅CrataeguspinnatifidaBge. var. major N. E. Br.或山楂CrataeguspinnatifidaBge的干燥葉,具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂的功效[1],臨床上,常用于心腦血管疾病的治療。山楂葉中主要含有黃酮類成分、有機酸類成分、微量元素和含氮化合物等,其中黃酮類化合物主要為牡荊素鼠李糖苷、牡荊素葡萄糖苷等,對缺血再灌注損傷(腦缺血、心肌缺血、肺缺血、腎缺血)有保護作用,具有抗動脈粥樣硬化、保肝、降糖、降脂、降壓作用等[2-3]。但由于山楂葉提取物具有高水溶性與低滲透性的特點,口服生物利用度較低,有必要制備高效制劑改善山楂葉提取物的溶解性,提高其臨床應用和價值。

磷脂復合物是藥物和磷脂通過電荷遷移作用而形成的較為穩(wěn)定的化合物,磷脂具有親水性和親脂性的特點,與人體生理系統(tǒng)具有相似性。黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中電負性較強的部位在一定條件下與磷脂帶正電荷的極性端通過氫鍵或分子間作用力結(jié)合形成多層囊狀磷脂復合物,改善黃酮類藥物的脂溶性[4]。本實驗將山楂葉提取物制備成磷脂復合物,優(yōu)化其制備方法,對其理化性質(zhì)進行研究,以期增強其脂溶性,進一步提高口服生物利用度。

1 材料

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀(美國Waters公司);MS-105DU型電子分析天平(梅特勒-托利多國際股份有限公司);Biosafer SB25-12DTD超聲波清洗機(賽飛中國有限公司);ZEISS SUPRA 40型掃描電子顯微鏡(德國蔡司公司);Nicolet-iS 10型傅里葉變換紅外光譜儀(美國賽默飛公司);Bruker D8型X射線衍射儀(德國布魯克公司);UV-2401PC型紫外可見分光光度計(日本島津公司);85-2型恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);DKZ-2型恒溫水浴振蕩器(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 試藥

山楂葉提取物(批號:FY20S0309,以蘆丁計總黃酮>80%)購自南通飛宇生物科技有限公司;大豆磷脂(批號:RH233191,純度90.0%)購自上海易恩化學技術(shù)有限公司;牡荊素葡萄糖苷對照品(批號:20042305,純度99.79%),牡荊素鼠李糖苷對照品(批號:20042304,純度99.80%),牡荊素對照品(批號:18052906,純度≥98%),蘆丁對照品(批號:20200803,純度97.0%),金絲桃苷對照品(批號:19103001,純度98.35%)均購自南京金益柏生物科技有限公司;乙腈、四氫呋喃為色譜純,乙酸為分析純,實驗用水為怡寶純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 山楂葉提取物磷脂復合物含量測定方法的建立

2.1.1 混合對照品溶液的制備 取牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷對照品適量,精密稱定,加60%乙醇制成含141、311、9.68、10.9、10.6 μg·mL-1的溶液,即得混合對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取山楂葉提取物磷脂復合物50 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,加60%乙醇溶解并稀釋至刻度,充分溶解,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱:Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL·min-1;流動相:乙腈(A)-0.5%乙酸水溶液(B)-四氫呋喃(C);分析時間:50 min;進樣量:10 μL;檢測器:Waters 2998二極管陣列檢測器;檢測波長:330 nm;梯度洗脫:0～5 min,10%～12%A,90%～88%B;5～15 min,12%～12%A,88%～88%B;15～20 min,12%～12%A,88%～84%B,0～4%C;20～35 min,12%～12%A,84%～84%B,4%～4%C;35～40 min,12%～30%A,84%～66%B,4%～4%C;40～45 min,30%～10%A,66%～90%B,4%～0C;45～50 min,10%～10%A,90%～90%B?；旌蠈φ掌?、供試品及大豆磷脂HPLC圖見圖1。

注：1.牡荊素葡萄糖苷;2.牡荊素鼠李糖苷;3.牡荊素;4.蘆丁;5.金絲桃苷圖1 供試品(A)、混合對照品(B)和大豆磷脂(C)HPLC圖Fig. 1 HPLC chart of test sanple(A), mixed reference (B) and soybean phospholipid (C)

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品儲備液,逐級稀釋,按“2.1.3”項下色譜條件測定記錄峰面積,以進樣濃度(μg·mL-1)為橫坐標(X),以峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸,得到牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷回歸方程及線性范圍,結(jié)果見表1。

表1 各成分的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equation, linear range and correlation coefficient of each component

2.1.4.2 精密度試驗 取混合對照品溶液,按“2.1.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,結(jié)果顯示牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁和金絲桃苷峰面積的RSD分別為0.45%、0.24%、1.01%、1.06%、0.79%,表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗 取山楂葉提取物磷脂復合物供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣,結(jié)果顯示牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁和金絲桃苷峰面積的RSD分別為0.38%、0.47%、4.56%、4.07%、5.48%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4.4 重復性試驗 取山楂葉提取物磷脂復合物6份,精密稱定,分別按“2.1.2”項下供試品溶液制備方法制備供試液,再按“2.1.3”項下色譜條件各進樣1次,結(jié)果顯示牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁和金絲桃苷含量的RSD分別為1.06%、1.44%、1.97%、1.71%、4.56%,表明該方法重復性良好。

2.1.4.5 加樣回收率試驗 取已知含量的山楂葉提取物磷脂復合物6份,每份供試品中加入各成分含量100%的對照品,按“2.1.2”項下供試品制備方法制備溶液,再按“2.1.3”項下色譜條件各進樣1次,計算加樣回收率。結(jié)果為牡荊素葡萄糖苷的平均回收率為96.19%,RSD為2.83%;牡荊素鼠李糖苷的平均回收率為94.53%,RSD為2.90%;牡荊素的平均回收率為107.49%,RSD為3.37%;蘆丁的平均回收率為109.90%,RSD為1.55%;金絲桃苷的平均回收率為94.64%,RSD為2.36%。

2.2 質(zhì)量權(quán)重系數(shù)的計算方法

質(zhì)量權(quán)重系數(shù)是指各代表性成分在總成分中的重要程度。山楂葉提取物中黃酮組分各成分之間存在特定的量比關(guān)系,直接影響黃酮組分的理化性質(zhì)和生物藥劑學特性?？偝煞种懈鞔硇猿煞值馁|(zhì)量權(quán)重系數(shù)可以看作各成分在總成分中所占的比例[5-6],即:

δi=Wi/W總(δi為某代表性成分的質(zhì)量權(quán)重系數(shù);Wi為總成分中某代表性成分的質(zhì)量分數(shù);W總為總成分的質(zhì)量分數(shù))。

總成分某一理化性質(zhì)綜合值(如藥物油水分配系數(shù)的綜合值):

根據(jù)山楂葉提取物含量測定結(jié)果,山楂葉提取物黃酮組分中的牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷的質(zhì)量分數(shù)Wi分別為2.38%、9.42%、0.16%、0.17%、0.18%,總成分的質(zhì)量分數(shù)為W總=12.31%,則各成分的質(zhì)量權(quán)重系數(shù)δi依次為0.193 3、0.765 2、0.013 0、0.013 8、0.014 6。

2.3 磷脂復合物的制備及復合率的測定

2.3.1 山楂葉提取物磷脂復合物的制備 取山楂葉提取物與大豆磷脂置于圓底燒瓶中,加入復合溶劑,置于恒溫磁力攪拌器上,在一定溫度下復合一定時間,減壓回收復合溶劑,收集沉淀物,減壓干燥,即得山楂葉提取物磷脂復合物。

2.4 單因素考察

2.4.1 復合溶劑的考察 選定山楂葉提取物與大豆磷脂的藥脂比1∶3,藥物的質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1,在50 ℃溫度下復合2 h。以組分復合率為評價指標,對無水乙醇、甲醇、四氫呋喃、三氯甲烷、乙酸乙酯進行考察,結(jié)果分別為64.38%、37.86%、8.05%、8.94%、5.13%;以質(zhì)量復合率為評價指標,則考察結(jié)果分別為71.98%、56.22%、30.05%、32.51%、21.08%。結(jié)果表明,無水乙醇作為復合溶劑時,組分復合率和質(zhì)量復合率較高,且差異顯著,故選用無水乙醇作為復合溶劑。

2.4.2 藥脂比的考察 選定山楂葉提取物與大豆磷脂的復合溶劑為無水乙醇,藥物的質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1,在50 ℃溫度下復合2 h。以組分復合率為評價指標,對山楂葉提取物與大豆磷脂的藥脂比為1∶1、1∶3、1∶5、1∶7進行考察,結(jié)果分別為40.02%、62.42%、59.99%、29.90%;以質(zhì)量復合率為評價指標,則考察結(jié)果分別為61.84%、76.19%、73.45%、69.19%。結(jié)果表明,隨著磷脂的增加,復合率增高,但過多的磷脂則會導致復合率低。

2.4.3 復合溫度的考察 選定山楂葉提取物與大豆磷脂的復合溶劑為無水乙醇,藥脂比為1∶3,藥物的質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1,復合時間2 h。以組分復合率為評價指標,對復合溫度30、40、50、60 ℃進行考察,結(jié)果分別為49.05%、64.83%、66.37%、63.43%;以質(zhì)量復合率為評價指標,則考察結(jié)果分別為62.75%、70.65%、71.96%、72.86%。結(jié)果表明隨著復合溫度的升高,復合率增高,超過40 ℃后復合率變化不大。

2.4.4 藥物質(zhì)量濃度的考察 選定山楂葉提取物與大豆磷脂的復合溶劑為無水乙醇,藥脂比為1∶3,在50 ℃溫度下復合2 h。以組分復合率為評價指標,對藥物質(zhì)量濃度1、2、3、4 mg·mL-1進行考察,結(jié)果分別為67.69%、66.37%、54.57%、57.77%;以質(zhì)量復合率為評價指標,則考察結(jié)果分別為80.80%、71.96%、65.78%、65.33%。結(jié)果表明隨著藥物質(zhì)量濃度的提高,復合率降低。

2.4.5 復合時間的考察 選定山楂葉提取物與大豆磷脂的復合溶劑為無水乙醇,藥脂比為1∶3,藥物的質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1,在50 ℃溫度下復合一定時間。以組分復合率為評價指標,對復合時間1、2、3、4 h進行考察,結(jié)果分別為57.60%、60.06%、57.73%、60.22%;以質(zhì)量復合率為評價指標,則考察結(jié)果分別為68.16%、73.74%、73.60%、75.00%。結(jié)果表明復合時間對復合率影響較小,超過1 h后復合率變化不大。

2.5 正交法優(yōu)化山楂葉提取物磷脂復合物制備方法

根據(jù)單因素試驗考察結(jié)果,選擇最佳復合溶劑為無水乙醇,復合1.5 h,復合率受山楂葉提取物與大豆磷脂的比例(A)、復合溫度(B)、藥物質(zhì)量濃度(C)的影響較大。因此,采用L9(34),對ABC做三因素三水平的正交試驗,以組分復合率和質(zhì)量復合率為評價指標,綜合評分=組分復合率×50%+質(zhì)量復合率×50%(評分選擇依據(jù)制備過程中評價指標的重要性差異經(jīng)驗確定),因素水平見表2,試驗設計及結(jié)果見表3～5。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels

表3 正交試驗各成分復合率結(jié)果(%)Table 3 The results of the compound rate of each component in the orthogonal test (%)

結(jié)果表明,C因素(藥物質(zhì)量濃度)對復合率有顯著性影響,各因素對復合率影響次序分別為藥物質(zhì)量濃度(C)、藥脂比(A)、復合溫度(B),結(jié)合直觀分析,最佳制備方法為A3B3C1。為節(jié)約輔料,最終確定山楂葉提取物與大豆磷脂的投料比例為1∶4,山楂葉提取物的濃度為1 mg·mL-1,于60 ℃溫度下復合1.5 h為最佳制備方法。

表4 正交試驗直觀分析結(jié)果Table 4 Intuitive analysis results of orthogonal test

表5 方差分析Table 5 Variance analysis

2.6 驗證試驗

對最佳制備方法進行驗證試驗,重復3次,結(jié)果得到山楂葉提取物磷脂復合物的平均組分復合率為68.32%,RSD為0.29%;平均質(zhì)量復合率為86.31%,RSD為1.30%,表明制備方法穩(wěn)定合理。結(jié)果見表6。

表6 正交驗證試驗復合率結(jié)果(%)Table 6 Compound rate results of orthogonal verification test (%)

2.7 山楂葉提取物磷脂復合物的表征

2.7.1 掃描電子顯微鏡分析 分別取山楂葉提取物、大豆磷脂、物理混合物和磷脂復合物適量于導電膠上,真空鍍金后于掃描電子顯微鏡下分別觀察樣品的表面形態(tài)。結(jié)果見圖2,山楂葉提取物原料藥表面光滑,呈條狀或塊狀,具有一定的晶體形態(tài);大豆磷脂表面光滑,呈球狀或類球狀,為無定形狀態(tài);物理混合物表面凹凸不平,也呈球狀或類球狀;而磷脂復合物表面光滑,呈無規(guī)則的塊狀,其形態(tài)發(fā)生了明顯的變化,顯然不同于其他三者,山楂葉提取物和大豆磷脂作用成為無定形狀態(tài)。

2.7.2 紫外吸收光譜分析 分別取山楂葉提取物、大豆磷脂、物理混合物、磷脂復合物適量,加60%乙醇定容至一定體積,以60%乙醇溶液為空白,于190～400 nm波長范圍內(nèi)測定吸光度并繪制曲線。結(jié)果見圖3,山楂葉提取物、物理混合物和磷脂復合物均在約330、270、210 nm處有吸收峰,且光譜圖相似,而磷脂在此處幾乎沒有吸收,表明山楂葉提取物和大豆磷脂在復合過程中沒有形成新的發(fā)色團,即未形成新的物質(zhì)。

注：A.山楂葉提取物;B.大豆磷脂;C.物理混合物;D.磷脂復合物圖2 不同樣品掃描電鏡圖Fig. 2 Scanning electron micrographs of different samples

2.7.3 紅外吸收光譜分析 分別取山楂葉提取物、大豆磷脂、物理混合物、磷脂復合物適量,加入溴化鉀后進行研磨和壓片,在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進行紅外掃描。結(jié)果見圖4,物理混合物圖譜具備山楂葉提取物和大豆磷脂的圖譜特征,磷脂復合物圖譜與物理混合物大體相似。大豆磷脂、物理混合物、磷脂復合物中均在2 925、2 854、1 740、1 379 cm-1處有特征峰,說明大豆磷脂中脂肪酸鏈的亞甲基C—H鍵、脂肪酸酯的C=O鍵并未參與復合過程;4種樣品均在1 064 cm-1處有吸收峰,即大豆磷脂和山楂葉提取物中的C—O鍵均未參與復合過程;大豆磷脂的P=O表現(xiàn)在1 234 cm-1,磷脂復合物的P=O表現(xiàn)在1 216 cm-1處,即向低波數(shù)位移,山楂葉提取物的OH表現(xiàn)在3 379 cm-1,磷脂復合物的OH表現(xiàn)在3 361 cm-1,即向低波數(shù)位移,原因可能在于大豆磷脂的P=O與山楂葉提取物的OH發(fā)生作用[8-9]。磷脂復合物中山楂葉提取物與大豆磷脂的基本化學結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生根本的改變,既未生成新的化合物,也非物理混合,表明磷脂復合物中山楂葉提取物與大豆磷脂可能以分子間作用力結(jié)合形成無定形態(tài)。

注：A.山楂葉提取物；B.大豆磷脂；C.物理混合物；D.磷脂復合物圖4 不同樣品紅外光譜圖Fig. 4 Infrared spectra of different samples

2.7.4 X射線衍射分析 分別取山楂葉提取物、大豆磷脂、物理混合物、磷脂復合物適量,平鋪于石英槽,輕輕壓平,以Cu靶為發(fā)射器,在電壓40 kV,電流40 mA,步距0.02°,衍射角度為5°～90°的條件下進行分析。結(jié)果見圖5,山楂葉提取物在掃描范圍5°～90°中存在多個尖銳的衍射峰。大豆磷脂無衍射峰,表明大豆磷脂主要以無定形狀態(tài)存在。物理混合物中存在少量衍射峰且具有無定形特征,其圖譜是兩者圖譜的疊加,但衍射峰的強度降低,表明物理混合過程中藥物和磷脂無相互作用發(fā)生。磷脂復合物無衍射峰,以無定形態(tài)存在,可能由于成分與磷脂結(jié)合后山楂葉提取物的晶型特征受到抑制。

注：A.物理混合物；B.大豆磷脂；C.山楂葉提取物；D.磷脂復合物圖5 不同樣品X-衍射分析圖譜Fig. 5 X-Diffraction analysis patterns of different samples

2.8 山楂葉提取物磷脂復合物的表觀油水分配系數(shù)研究

取山楂葉提取物和磷脂復合物適量,精密稱定,置于10 mL容量瓶中,加正辛醇飽和的水、不同pH水溶液定容至刻度,配制成初始水溶液,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后,取續(xù)濾液進樣檢測各成分濃度(C0)。取上述水溶液2 mL,置于10 mL具塞試管中,分別加入水及不同pH緩沖液飽和的正辛醇溶液2 mL,放入水浴恒溫振蕩器在(37±1)℃下振搖24 h至平衡。分取下層水相,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后,取續(xù)濾液進樣檢測各成分濃度(C)。按P=(C0V0-CV)/CV計算山楂葉提取物中各成分的表觀油水分配系數(shù)P,結(jié)果見表7～8。

表7 山楂葉提取物各成分的油水分配系數(shù)Table 7 Oil-water partition coefficient P of each component of hawthorn leaf extract

表8 山楂葉提取物磷脂復合物各成分的油水分配系數(shù)Table 8 Oil-water partition coefficient P of each component of hawthorn leaf extract phospholipid complex

根據(jù)各成分在正辛醇-水及不同pH的磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)的表觀油水分配系數(shù),按照“2.2”項下公式計算山楂葉提取物和磷脂復合物黃酮組分的表觀油水分配系數(shù)綜合值,如山楂葉提取物黃酮組分在正辛醇-pH5.0磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)中的表觀油水分配系數(shù)C=0.193 3×0.107 6+0.765 2×0.189 5+0.013 0×0.708 2+0.013 8×2.414 2+0.014 6×3.280 0=0.256 2,其他以此類推,結(jié)果見圖6。結(jié)果表明,在pH5.0、pH5.8、pH6.8、pH7.0和水的條件下,磷脂復合物的表觀油水分配系數(shù)明顯高于山楂葉提取物,說明山楂葉提取物制備成磷脂復合物后脂溶性得到了改善。

圖6 質(zhì)量權(quán)重系數(shù)法所得油水分配系數(shù)比較Fig. 6 Comparison of oil-water distribution coefficient obtained by mass weight coefficient method

3 討論

黃酮類化合物大量存在于植物界中,且具有廣泛的藥理作用,但有些黃酮類化合物具有的理化性質(zhì)(溶解性或滲透性差)導致其口服生物利用度較低,限制其療效的發(fā)揮,通過中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)改善藥物性質(zhì)顯得尤為重要。磷脂復合物能通過改善水溶性藥物的脂溶性從而增加藥物在胃腸道的吸收[10],本實驗基于磷脂復合物與黃酮類化合物較好的親和力,制備山楂葉提取物磷脂復合物以改善母體藥物的理化性質(zhì)。

課題組前期溶解度試驗結(jié)果表明山楂葉提取物水溶性較好,能溶解于水、甲醇、乙醇、四氫呋喃等極性較大的溶劑中,在乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷等極性較小的溶劑中幾乎不溶,故期望通過制劑學手段改善其理化性質(zhì)。本實驗采用單因素考察和正交設計試驗將山楂葉提取物制備成磷脂復合物,制備工藝合理可靠,總體復合率較高。對于單個成分,蘆丁和牡荊素鼠李糖苷的復合率較其他成分高,原因可能在于蘆丁結(jié)構(gòu)中羥基較多,更容易和大豆磷脂的極性端形成氫鍵,而牡荊素鼠李糖苷是山楂葉提取物中含量最高的成分,與大豆磷脂結(jié)合的機會更多,且有較多羥基,故復合率較高。本實驗采用掃描電鏡、紅外光譜、紫外光譜、X-衍射和表觀油水分配系數(shù)法對山楂葉提取物磷脂復合物進行理化性質(zhì)研究,結(jié)果表明磷脂復合物為無定形狀態(tài),表觀油水分配系數(shù)較山楂葉提取物得到提高,脂溶性得到了改善,為后期口服生物利用度實驗奠定了基礎。

國內(nèi)外多以單體黃酮類成分制備磷脂復合物,由于中藥成分的復雜性,中藥有效部位的制劑構(gòu)建需要新的思路與方法。本研究以中藥組分為核心,采用質(zhì)量權(quán)重系數(shù)法表征山楂葉提取物中黃酮組分的整體性質(zhì),避免單一成分的獨立性質(zhì)和多成分性質(zhì)簡單加和的缺陷，以期為中藥組分生物藥劑學性質(zhì)研究和中藥提取物劑型改善研究提供研究思路與參考[5]。