仇雅嵐,高靜東,劉敏,張蕾,宋卿

(南京中醫(yī)藥大學附屬蘇州醫(yī)院,江蘇 蘇州 215000)

網(wǎng)絡(luò)藥理學是一種從系統(tǒng)水平分析藥物多靶點治療疾病機制的新興研究方法,它能夠?qū)λ幬锇悬c進行有效定位,并建立“藥物-靶點-疾病”生物網(wǎng)絡(luò),以高通量方式揭示小分子的調(diào)控原理[1-2]。由于腫瘤是具有復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)疾病,運用網(wǎng)絡(luò)藥理學分析中藥復(fù)方的抗腫瘤作用機制,有效地彌合了現(xiàn)代醫(yī)學與傳統(tǒng)中醫(yī)藥之間的鴻溝,使藥物研究模式從“單一目標,一種藥物”轉(zhuǎn)變?yōu)椤熬W(wǎng)絡(luò)目標,多組分治療”模式[3-4]。健脾解毒方是蘇州市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科針對消化系統(tǒng)腫瘤的常用方劑,該方以健脾法為主,結(jié)合清熱解毒等治法,組成包括黃芪、炒白術(shù)、山慈菇、白花蛇舌草,臨床效果顯著,但其抗腫瘤機制尚未明確。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接的方法,篩選健脾解毒方有效成分,以期分析其抗腫瘤作用靶點以及相關(guān)信號通路,為進一步實驗探究其作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 篩選健脾解毒方有效化學成分及作用靶點

利用中藥成分數(shù)據(jù)庫TCMSP(http://www.tcmspw.com/tcmsp.php)[5],TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)[6],ETCM(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)[7]數(shù)據(jù)庫,檢索健脾解毒方組成藥物(黃芪、白術(shù)、白花蛇舌草、山慈菇)的化學成分信息及藥理學信息?？诜锢枚?Oral bioavailability, OB)是指藥物經(jīng)口服給藥被吸收進入人體循環(huán)的速度與程度,類藥性(Drug-likeness, DL)是指化合物與已知藥物的相似性。OB、DL是篩選中藥復(fù)方有效成分的關(guān)鍵參數(shù),OB、DL值越高,則該化合物越具有成為藥物的可能。

將以上3個中藥成分數(shù)據(jù)庫中獲得的健脾解毒方組成藥物的化學成分信息匯總后與DrugBank(https://go.drugbank.com/)[8]數(shù)據(jù)庫里所有已知藥物進行相似程度比較,篩選滿足OB≥30%,且DL≥0.18的化學成分作為健脾解毒方的有效成分,并利用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選健脾解毒方有效成分作用靶點。

1.2 收集腫瘤相關(guān)靶點并匹配藥物-疾病靶點

利用GeneCards(http://www.genecards.org/)[9]數(shù)據(jù)庫,以“Cancer”“Tumor”為關(guān)鍵詞,檢索與腫瘤相關(guān)的疾病靶點,以相關(guān)性分數(shù)為參考,刪除重復(fù)靶點后取并集,得到腫瘤相關(guān)靶點。利用R 3.6.3軟件[10]將藥物與疾病的靶點進行匹配,得到健脾解毒方有效成分抗腫瘤的作用靶點。

1.3 構(gòu)建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)并篩選關(guān)鍵靶點

將匹配后得到的健脾解毒方有效成分靶點與腫瘤相關(guān)疾病靶點之間的重合靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)[11],構(gòu)建健脾解毒方有效成分-腫瘤靶點網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點以不同的形狀或顏色分別代表有效成分和靶點,邊表示有效成分與靶點的作用關(guān)系。節(jié)點度為某一節(jié)點所連邊的條數(shù),節(jié)點度越高,說明該節(jié)點在復(fù)方中所起的作用越關(guān)鍵。為了篩選出健脾解毒方抗腫瘤作用的關(guān)鍵靶點,對1.2中獲得的健脾解毒方的藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)進行節(jié)點度分析,分別計算有效成分、靶點的節(jié)點度,以節(jié)點度為參數(shù)篩選,我們選擇大于平均節(jié)點度位列前3位的靶點作為健脾解毒方的關(guān)鍵靶點。并利用Bisogenet插件[12]構(gòu)建關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,并進行藥物、成分、靶點、信號通路之間的網(wǎng)絡(luò)拓撲分析。

1.4 基因功能注釋和通路富集分析

利用R 3.6.3軟件及相關(guān)軟件包[13-16]對“1.2項”中獲得的健脾解毒方有效成分抗腫瘤的作用靶點進行基因本體(GO)生物學過程富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,將顯著富集的前20個基因或通路繪制成GO分析圖和KEGG氣泡圖。

1.5 有效成分與關(guān)鍵靶點基因分子對接

在RSCB PDB數(shù)據(jù)庫[17]中下載關(guān)鍵靶點基因的分子結(jié)構(gòu),在TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載健脾解毒方有效成分的2D結(jié)構(gòu),利用AutoDock4.2軟件[18]對基因分子結(jié)構(gòu)進行移除水分子、加氫處理,對有效成分結(jié)構(gòu)加氫處理,并進行半柔性結(jié)合分子對接驗證,運用遺傳算法(Genetic algorithm)進行分子對接計算,每次對接50次,最大運行300個,對接參數(shù)使用默認值。若結(jié)合能小于0,表明配體與受體之間存在結(jié)合活性,小于-5 kJ·mol-1則兩者對接良好。最后使用Pymol 2.4及插件PyMod3[19]對對接分子結(jié)合能最低的位點進行圖像可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 健脾解毒方有效成分及作用靶點

在以上3個中藥成分數(shù)據(jù)庫中共獲得黃芪87種、白術(shù)55種、白花蛇舌草化學成分37種、山慈菇18種,匯總?cè)ブ睾蟮玫浇∑⒔舛痉交瘜W成分共193種。以O(shè)B≥30%,且DL≥0.18為條件篩選收集到黃芪17種、白術(shù)4種、白花蛇舌草5種、山慈菇3種,去重后共25種有效成分,其中白花蛇舌草與山慈菇共有成分為豆甾醇(Stigmasterol)、β-谷甾醇(β-Sitosterol),與黃芪共有槲皮素(Quercetin),黃芪和白術(shù)共有成分為(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-Dimethyl-17-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopentaphenanthren-3-ol,見表1。利用TCMSP獲得健脾解毒方共730個靶點,與有效成分匹配去重后得到197個健脾解毒方有效成分靶點。

2.2 腫瘤疾病靶點及共同靶點

利用GeneCards獲得腫瘤相關(guān)靶點共26 170個基因靶點,以相關(guān)性分數(shù)為參數(shù)進行取中位數(shù)篩選后得到相關(guān)性分數(shù)>11.585 12的818個腫瘤相關(guān)基因靶點。將818個腫瘤相關(guān)靶點與健脾解毒方有效成分靶點匹配,取交集得到健脾解毒方共24個有效成分作用于86個腫瘤相關(guān)靶點。黃芪的有效成分Isomucronulatol-7,2'-di-O-glucosiole無相關(guān)作用靶點。見圖1。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選

將匹配后得到健脾解毒方有效成分及其抗腫瘤作用靶點導(dǎo)入Cytoscape(http://www.cytoscape.org/),構(gòu)建健脾解毒方的藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)(圖1)。圖中不同顏色、形狀的節(jié)點分別代表健脾解毒方有效成分和抗腫瘤作用靶點,有效成分節(jié)點的形狀大小代表節(jié)點度的大小,邊代表有效成分與作用靶點的作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)中共有110個節(jié)點,其中24個為有效成分,86個為抗腫瘤靶點,共有213條邊。為了篩選出健脾解毒方抗腫瘤作用的關(guān)鍵靶點,對網(wǎng)絡(luò)中有效成分及靶點分別進行節(jié)點度分析。健脾解毒方24個有效成分的節(jié)點度平均值為8.54,大于均值的有效成分節(jié)點為8個;86個抗腫瘤靶點的節(jié)點度平均值為2.48,大于均值的靶點有19個。其中健脾解毒方有效成分中槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempgerol)的節(jié)點度大于20,是發(fā)揮抗腫瘤作用的主要有效成分;前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)、熱休克蛋白90α家族A類成員1(Heat shock protein 90 alpha family class A member 1, HSP90AA1)、絲氨酸蛋白酶1(Serine protease 1, PRSS1)3個抗腫瘤靶點的節(jié)點度大于10,在網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度位列前3位,我們預(yù)測PTGS2、HSP90AA1、PRSS1為健脾解毒方抗腫瘤作用的關(guān)鍵靶點。將PTGS2、HSP90AA1、PRSS1 3個關(guān)鍵靶點導(dǎo)入Cytoscape利用Bisogenet插件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包含852個節(jié)點,12 149條邊,進一步以中心性(DC)>60為條件,篩選得到102個節(jié)點,2 093條邊。見圖2。

注：綠色菱形.白花蛇舌草有效成分;紫色菱形.白術(shù)有效成分;黃色菱形.黃芪有效成分;棕色菱形.山慈姑有效成分;紅色菱形.共有有效成分;藍色圓形.抗腫瘤靶點圖1 健脾解毒方的有效成分-抗腫瘤靶點網(wǎng)絡(luò)Fig. 1 Interaction network of effective ingredients of JPJDD-antitumor targets

圖2 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig. 2 PPI network of the key targets

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將“2.2項”中得到的健脾解毒方抗腫瘤的86個作用靶點導(dǎo)入R軟件中,進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析包括細胞成分(圖3)、分子功能(圖4)、生物過程(圖5),分別選取其中富集程度最高的前20條。GO富集結(jié)果顯示健脾解毒方有效成分主要作用于核染色質(zhì),轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物,高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等顆粒性分泌囊腔,細胞膜區(qū)、微膜區(qū)、膜筏,外膜、細胞器外膜,蛋白激酶復(fù)合物等;分子功能包括調(diào)控泛素蛋白結(jié)合、RNA結(jié)合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、細胞黏附分子結(jié)合、生長因子受體結(jié)合,調(diào)節(jié)泛素樣蛋白連接酶、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激酶、激酶調(diào)控因子、細胞因子等活性;共參與了1 770個生物學過程,包括氧化應(yīng)激、細胞凋亡、肽基絲氨酸磷酸化、上皮細胞增殖、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子以及功能調(diào)節(jié)等。

圖3 GO富集分析細胞成分柱狀圖Fig. 3 CC barplot of GO enrichment

圖4 GO富集分析分子功能柱狀圖Fig. 4 MF barplot of GO enrichment

圖5 GO富集分析生物過程柱狀圖Fig. 5 BP barplot of GO enrichment

KEGG通路富集分析共得到153條富集信息,顯示共同靶點主要富集于前列腺癌、胰腺癌、肝癌,也可作用于結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肺癌,主要信號通路涉及PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、腫瘤蛋白多糖、腫瘤微小核糖核酸、IL-17、細胞衰老等,選取富集程度最高的前20條見圖6。

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig. 6 KEGG bubble

2.5 分子對接驗證

健脾解毒方有效成分中槲皮素、山柰酚的節(jié)點度大于20,是發(fā)揮抗腫瘤作用的主要有效成分。將槲皮素、山柰酚與“2.3”項下獲得的關(guān)鍵靶點基因進行分子對接,結(jié)果顯示PTGS2、HSP90AA1、PRSS1與槲皮素、山柰酚的結(jié)合能均小于-5 kJ·mol-1,關(guān)鍵靶點與槲皮素、山柰酚均具有良好對接活性。見表2。分子對接選擇結(jié)合能最低的位點進行圖像可視化處理,見圖7。

表2 健脾解毒方活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接結(jié)果Table 2 The dock results of the active ingredients of JPJDD and the key targets

圖7 健脾解毒方主要有效成分與關(guān)鍵靶基因分子對接圖Fig. 7 Molecular docking diagram of the active ingredients of JPJDD and the key targets

3 實驗驗證

3.1 材料

3.1.1 細胞 人結(jié)腸癌細胞株HCT-116購自中國科學院上海細胞研究所。細胞株用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,置于37 ℃、5%CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.1.2 藥物 健脾解毒方由黃芪、炒白術(shù)、白花蛇舌草、山慈菇組成,醇提物由蘇州市中醫(yī)醫(yī)院制備及質(zhì)量控制。Matrigel基質(zhì)膠(貨號：356234)購自美國BD公司;Transwell小室(貨號：3422)購自美國Corning公司;RIPA裂解液(貨號：P0013C)、蛋白磷酸酶抑制劑(貨號：P1046)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(貨號：P0012A)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：P0012)、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(貨號：P0018S)均購自碧云天科技有限公司；兔源PTGS2抗體(貨號：12282)、兔源p38MAPK抗體(貨號：8690)、GAPDH抗體(貨號:5174)、HRP標記的羊抗兔IgG(貨號：7074)均購自美國CST公司。TRIzol試劑(貨號:R401-01)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:R323-01)、qPCR定量試劑盒(貨號:P213-01)購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

3.1.3 主要儀器 SVE-6A1垂直流超凈工作臺,新加坡ESCO公司;TS-1000脫色搖床,江蘇其林貝爾儀器制造有限公司;HERAcell 240i型CO2恒溫培養(yǎng)箱,美國Thermo公司;CKX41-F32FL熒光倒置顯微鏡,日本Olympus公司;CPA225D電子天平,德國Sartorious Stedim Biotech公司;7500型全自動熒光定量PCR儀,美國ABI公司;680型酶標儀、Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳儀、Trans-Blot?Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、Chemidox化學發(fā)光成像儀,美國Bio-Rad公司。

3.2 實驗方法

3.2.1 CCK-8法檢測HCT-116細胞增殖與活性 取對數(shù)生長期的HCT-116細胞以每孔5 000個的濃度接種于96孔板中,待細胞完全貼壁,換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。之后加入健脾解毒方醇提物,設(shè)置終濃度分別為12.5、25、50、100、200、300、400 μg·mL-1共7個劑量,并設(shè)不加藥對照組。

48 h后,每孔按10%比例加入CCK-8溶液,待其完全混勻,放入37 ℃,繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h。酶標儀于490 nm/630 nm(雙波長)處測定其吸光值。

根據(jù)健脾解毒方醇提物對HCT-116細胞作用48 h的細胞增殖與活性結(jié)果,確定半數(shù)抑制濃度(IC50),后續(xù)實驗分別采用健脾解毒方的低、中、高劑量進行體外細胞研究。

3.2.2 Western blot檢測HCT-116細胞中PTGS2和p38MAPK蛋白表達 取處于對數(shù)生長期的HCT-116細胞分為4組:對照組,健脾解毒方低、中、高劑量組。藥物干預(yù)48 h后抽提細胞總蛋白:預(yù)冷的PBS清洗細胞2次,加入含蛋白酶抑制劑的裂解液,轉(zhuǎn)移細胞懸液至離心管中,冰上裂解30 min,4 ℃離心12 000 r·min-1,5 min,取上清,可置于-80 ℃冰箱保存。BCA法測定蛋白的濃度后,取等量蛋白用10%SDS-PAGE分離,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜,將其置于5%BSA溶液中封閉1 h后加入PTGS2、p38 MAPK、GAPDH抗體4 ℃過夜。次日用TBST洗膜3次,每次10 min,再加入二抗,室溫孵育1 h后用同樣方法洗膜。最后按1∶1加入AB熒光底物,顯影,定影,分析結(jié)果。

3.2.3 qPCR法檢測HCT-116細胞中PTGS2和p38MAPK mRNA表達 上述細胞藥物干預(yù)48 h后,收集細胞,加入1 000 μL TRIzol試劑及200 μL氯仿提取總RNA,應(yīng)用Prime ScriptTMRT試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以GAPDH為內(nèi)參進行熒光定量PCR擴增,檢測各組細胞中PTGS2和p38MAPK mRNA的表達水平。擴增引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)條件:95 ℃持續(xù)10 s,95 ℃持續(xù)5 s,60 ℃持續(xù)31 s,運行40個循環(huán)。PTGS2、p38MAPK和GAPDH的正向和反向引物在最終濃度為200 nmol·L-1時使用。序列如下:p38MAPK:上游5'-GAGGTGCCCGAGCGATACCA-3',下游5'-CCGCAGCTCCCTGTAGGTCCT-3';PTGS2,上游5'-AATGAGTACCGCAAACGCTTCT-3',下游5'-ttctgcagccattccttctc-3';GAPDH,上游5'-CCATCCTCCACTTGAC-3',下游5'-ACCCTGTAGCCA-3'。

3.2.4 構(gòu)建PTGS2基因沉默的HCT-116細胞 慢病毒RNAi系統(tǒng)的質(zhì)粒購自上?；蚧瘜W有限公司。使用GenScript(Piscataway,NJ,USA)的siRNA靶標探測器設(shè)計了4種針對人類PTGS2 mRNA的小干擾RNA(siRNA)[國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)GenBank,NM 000963.2]。使用的靶序列如下:克隆1,5'-GCT GAATTTAACACCCCTAT-3'(1 230～1 250 bp);克隆2,5'-CCATTCTCCTTGAAGGACTT-3'(1 677～1 697 bp);克隆3,5'-GCAGATGAAATACCAGTCTTT-3'(1 463～1 483 bp);克隆4,5'-CATTCCCTTCCAAAT-3'(407 425 bp)。然后按照制造商的說明將克隆插入表達綠色熒光蛋白(GFP)的pFU-GW-RNAi載體。使用Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen life technologies)將pFU-GW-RNAi載體與pHelper 1.0和pHelper 2.0載體共轉(zhuǎn)染到293T細胞中。隨后在293T細胞中對病毒進行了分析和擴增。用適量的病毒感染HCT-116細胞72 h,抑制內(nèi)源性PTGS2的表達。

3.2.5 Transwell實驗檢測細胞遷移 取處于對數(shù)生長期的HCT-116細胞分為4組:對照組、健脾解毒方中劑量組、PTGS2基因沉默組、健脾解毒方中劑量組聯(lián)合PTGS2基因沉默組,干預(yù)48 h后,離心收集細胞,制成4×105mL-1細胞懸液,按照每室150 μL加入Transwell小室的上室,血清濃度為0.5%,將含10 μg·mL-1Fibronectin試劑和15%血清的RPMI-1640培養(yǎng)液600 μL加入Transwell細胞培養(yǎng)小室的下室。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi),孵育48 h后取出,以95%乙醇固定濾膜10 min,結(jié)晶紫染色15 min,用濕潤的棉簽輕輕拭去濾膜上室面的細胞。光學顯微鏡下觀察細胞遷移情況,測定遷移細胞數(shù)。每組平行設(shè)置3張濾膜。

3.2.6 PTGS2基因沉默的HCT-116細胞中的p38MAPK蛋白及mRNA表達 檢測對照組、健脾解毒方中劑量組、PTGS2基因沉默組、健脾解毒方中劑量組聯(lián)合PTGS2基因沉默組,干預(yù)48 h后p38MAPK蛋白及mRNA表達。

3.3 實驗結(jié)果

3.3.1 健脾解毒方對結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖的影響 CCK-8實驗表明,健脾解毒方醇提物對結(jié)腸癌HCT-116細胞有明顯的增殖抑制作用,并且呈劑量依賴性。健脾解毒方醇提物對HCT-116細胞作用48 h的IC50為200 μg·mL-1,故本研究后續(xù)實驗分別采用50、100、200 μg·mL-1作為健脾解毒方的低、中、高劑量進行體外細胞研究。見圖8。

圖8 不同濃度健脾解毒方對HCT-116細胞增殖的影響Fig. 8 The cell proliferation of HCT-116 with different doses of JPJDD

3.3.2 HCT-116細胞中PTGS2和p38MAPK蛋白表達 Western blot結(jié)果顯示,健脾解毒方低、中、高劑量各組均能夠抑制HCT-116細胞中PTGS2蛋白表達,并呈劑量依賴性(P<0.01,P<0.001)。健脾解毒方中、高劑量組能顯著降低p38MAPK蛋白表達(P<0.01)。PTGS2和p38MAPK二者表達呈同向變化。見圖9。

注：與對照組比較,**P<0.01,***P<0.001。圖9 不同濃度健脾解毒方對HCT-116細胞中PTGS2和p38MAPK蛋白表達的影響Fig. 9 The protein expressions of PTGS2 and p38MAPK in HCT-116 with different doses of JPJDD

3.3.3 HCT-116細胞中PTGS2和p38MAPK mRNA表達 qPCR結(jié)果顯示,健脾解毒方低、中、高劑量組均能夠抑制HCT-116細胞中PTGS2 mRNA表達,并呈劑量依賴性(P<0.01,P<0.001)。健脾解毒方中、高劑量組能顯著降低p38MAPK mRNA表達(P<0.01)。PTGS2和p38MAPK二者表達呈同向變化。見圖10。

3.3.4 健脾解毒方對沉默PTGS2基因的HCT-116細胞遷移能力的影響 Transwell實驗結(jié)果顯示,健脾解毒方能夠顯著抑制HCT-116細胞的遷移能力,其遷移細胞數(shù)較對照組明顯減少(P<0.001),且沉默PTGS2基因也可顯著抑制HCT-116細胞遷移(P<0.001);但PTGS2基因沉默聯(lián)合中藥組的細胞遷移較單純中藥組,或單純PTGS2基因沉默組無明顯差異。這表明PTGS2基因沉默后,健脾解毒方對HCT-116細胞的遷移能力無明顯影響,其抑制結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)移可能與下調(diào)PTGS2表達相關(guān)。見圖11。

注：與對照組相比,**P<0.01,***P<0.001。圖10 不同濃度健脾解毒方對HCT-116細胞中PTGS2和p38MAPK mRNA表達的影響Fig. 10 The mRNA expressions of PTGS2 and p38MAPK in HCT-116 with different doses of JPJDD

注：A.結(jié)晶紫染色觀察各組細胞遷移情況;B.各組遷移細胞數(shù)比較。與對照組比較,***P<0.001。圖11 各組細胞遷移情況比較Fig. 11 Cell migration in each group

3.3.5 健脾解毒方對PTGS2基因沉默的HCT-116細胞p38MAPK表達的影響 qPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,健脾解毒方能夠明顯抑制HCT-116細胞p38MAPK蛋白和mRNA的表達(P<0.001),且PTGS2基因沉默也可顯著抑制p38MAPK表達(P<0.001);PTGS2基因沉默聯(lián)合健脾解毒方對p38MAPK的表達均較對照組顯著降低(P<0.001),且低于單純中藥組,但與PTGS2基因沉默組比較無明顯差異。上述結(jié)果提示沉默PTGS2基因,健脾解毒方對HCT-116細胞p38MAPK表達無明顯影響,健脾解毒方可能是通過調(diào)節(jié)PTGS2介導(dǎo)的p38MAPK表達發(fā)揮抗結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的作用。見圖12。

注：與對照組比較,**P<0.01,***P<0.001。圖12 各組細胞p38MAPK mRNA和蛋白表達Fig. 12 The mRNA and protein expressions of p38MAPK in each group

4 討論

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學方法在多個中藥成分數(shù)據(jù)庫中篩選整合健脾解毒方25個有效成分,197個作用靶點,并通過GeneCards收集到腫瘤相關(guān)基因818條。將有效成分作用靶點與腫瘤相關(guān)基因靶點進行匹配后,得到健脾解毒方作用于86個腫瘤相關(guān)靶點的24個有效成分,其中槲皮素、山柰酚的節(jié)點度大于20,表明其可能為健脾解毒方主要抗腫瘤成分。

槲皮素、山柰酚都是天然的黃酮類化合物。槲皮素能夠調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)、細胞周期停滯以及腫瘤增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移,它的抗癌特性主要通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),P13K/Akt/mTOR,MAPK/ERK1/2和Wnt/β-Catenin信號通路實現(xiàn)的[20]。山柰酚對乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等均有抗腫瘤活性,在結(jié)直腸癌中山柰酚可以通過P13K/Akt信號通路抑制腫瘤細胞的增殖、促進凋亡[21-22]。

分析其86個作用靶點,發(fā)現(xiàn)PTGS2、HSP90AA1、PRSS1靶點的節(jié)點度大于10,說明在藥物-疾病作用網(wǎng)絡(luò)中均受到10個以上有效成分調(diào)控,PTGS2、HSP90AA1、PRSS1可能為健脾解毒方抗腫瘤的關(guān)鍵靶點。PTGS2,即環(huán)氧合酶2(COX-2)是前列腺素生物合成途徑中的一種關(guān)鍵酶,其在早期和晚期結(jié)直腸癌組織中過度表達,預(yù)示著預(yù)后不良[23]。抑制PTGS2過表達有利于減少結(jié)直腸癌風險[24],這提示PTGS2可能在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MAPK家族蛋白參與細胞分化、遷移、凋亡和自噬[25]。我們在健脾解毒方的藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)其也作用于MAPK14,即p38MAPKα,p38 MAPK是MAPK家族的關(guān)鍵成員,也是調(diào)節(jié)細胞對細胞因子和應(yīng)激反應(yīng)信號級聯(lián)的一部分。但PTGS2、p38MAPK在結(jié)直腸癌中的作用機制還有待闡明,于是我們設(shè)計并進行了實驗驗證。

利用AutoDock對槲皮素、山柰酚與關(guān)鍵靶點基因進行分子對接,驗證其結(jié)合能力,結(jié)果顯示均對接良好,進一步說明槲皮素、山柰酚可能是通過PTGS2、HSP90AA1、PRSS1發(fā)揮抗腫瘤作用。

GO富集分析發(fā)現(xiàn)健脾解毒方有效成分可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細胞凋亡、蛋白磷酸化、上皮細胞增殖等。KEGG通路富集分析顯示健脾解毒方有效成分作用顯著富集于前列腺癌、胰腺癌、肝癌,也可作用于結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等腫瘤中,主要涉及PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路、細胞衰老等。這與以上槲皮素、山柰酚、PTGS2、HSP90AA1、PRSS1的現(xiàn)代藥理學、生物學研究結(jié)果均一致。

在進一步實驗驗證中發(fā)現(xiàn),健脾解毒方能夠明顯下調(diào)HCT-116細胞PTGS2和p38MAPK的mRNA和蛋白表達水平,且呈一定的劑量依賴性。而在沉默PTGS2基因后,健脾解毒方對HCT-116細胞p38MAPK的mRNA和蛋白表達無明顯影響,提示PTGS2是健脾解毒方調(diào)節(jié)p38MAPK表達的關(guān)鍵靶點。研究結(jié)果初步表明,健脾解毒方通過調(diào)節(jié)PTGS2介導(dǎo)的p38MAPK表達,發(fā)揮抗結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學分析和分子對接技術(shù),從理論上初步驗證了健脾解毒方是通過“多藥物、多成分、多靶點、多途徑”協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用的,并進一步從實驗研究驗證了其抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的機制與PTGS2介導(dǎo)的p38MAPK信號通路相關(guān),這為研究中藥復(fù)方抗腫瘤作用機制提供了參考。