韓婷婷，王鳴梟，張玉剛，孫欣

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院／青島市園藝植物遺傳改良與育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109）

樹型結(jié)構(gòu)是影響果樹修剪、果實(shí)品質(zhì)和果園管理的一個(gè)重要農(nóng)藝性狀。矮化密植是世界上先進(jìn)蘋果產(chǎn)區(qū)普遍采用的一種栽培模式，也是我國(guó)現(xiàn)代化蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。柱型蘋果（Malus×domesticaBorkh.）樹體矮小，節(jié)間短，腋芽萌發(fā)為大量短枝，長(zhǎng)分枝少且分枝角度小，生長(zhǎng)緊湊，是進(jìn)行蘋果矮化育種的重要種質(zhì)資源［1－3］。自1960年在加拿大發(fā)現(xiàn)柱型突變體‘威賽克旭（Mc-Intosh Wijcik）’以來(lái)［4］，其獨(dú)特的樹形生長(zhǎng)特性一直備受關(guān)注。經(jīng)典遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，蘋果柱型性狀是由顯性單基因Co控制的質(zhì)量性狀［5］?；蚪M序列公布之前，AFLP、SSR、RAPD和SCAR等分子標(biāo)記的篩選與開發(fā)已將Co基因定位到了第10號(hào)染色體17.0～19.5 cM的范圍內(nèi)［6－11］。2010年蘋果基因組數(shù)據(jù)公布之后，各國(guó)研究者通過精細(xì)定位、RNA－seq和遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明了MdCoL（91071－gene／MdCo3l／dmr6－like）是調(diào)控蘋果柱型性狀最強(qiáng)有力的候選基因［12－17］。

脫落酸是能夠引起芽休眠和葉片脫落、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的一種倍半萜類化合物，高等植物中主要通過類胡蘿卜素途徑（也稱間接途徑）合成，即類胡蘿卜素經(jīng)玉米黃質(zhì)氧化酶（ZEP／ABA1）、9－順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）和醛氧化酶（AAO）裂解間接形成ABA，NCED是此過程中的關(guān)鍵限速酶［18，19］。近期又有研究發(fā)現(xiàn)了一種獨(dú)立于ZEP／ABA1而依賴于ABA2和ABA3的脫落酸合成支路，該途徑更為簡(jiǎn)潔、保守［20］。ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要以PYLPP2C－SnRK2－TFs通路為主，通過釋放被PP2C抑制的SnRK2激酶激活下游轉(zhuǎn)錄因子，從而增強(qiáng)植物對(duì)ABA信號(hào)的響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)其生理效應(yīng)［21－25］。研究發(fā)現(xiàn)，ABI4和OsAP2－39等轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物體內(nèi)脫落酸、赤霉素和細(xì)胞分裂素水平上發(fā)揮著重要作用，影響著種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)發(fā)育［24－26］。

前期研究發(fā)現(xiàn)，柱型蘋果中的ABA含量較普通型蘋果高［27］；轉(zhuǎn)MdCoL的蘋果‘王林’愈傷中的ABA含量也顯著高于野生型對(duì)照，其主要通過促進(jìn)MdNCED6和MdNCED9的表達(dá)來(lái)促進(jìn)ABA的生物合成［28］。為進(jìn)一步研究ABA與蘋果柱型基因MdCoL表達(dá)及柱型性狀的關(guān)系，本研究以柱型蘋果‘威賽克旭’和普通型蘋果‘旭（McIntosh）’的新梢和芽以及本實(shí)驗(yàn)室保存的轉(zhuǎn)MdCoL基因的T3代煙草為試材，設(shè)置外源ABA及其生物合成抑制劑氟啶酮噴施處理，分析各材料體內(nèi)MdCoL及ABA生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)量變化，同時(shí)分析外源ABA處理對(duì)轉(zhuǎn)MdCoL基因和野生型本生煙表型的影響，以探究柱型性狀與ABA的關(guān)系，為蘋果柱型性狀調(diào)控機(jī)制的完善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

9年生柱型蘋果‘威賽克旭’和普通型蘋果‘旭’的新梢和芽，取自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)膠州農(nóng)業(yè)科技示范園。野生型本生煙（Nicotiana benthamiana）及其轉(zhuǎn)MdCoL株系CoL－5和CoL－15，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外源ABA及其抑制劑氟啶酮處理柱型和普通型蘋果 選取長(zhǎng)勢(shì)相同的兩種類型的蘋果樹，從中隨機(jī)挑選新萌發(fā)的春梢，分別用0.1 mol／L ABA和10μmol／L氟啶酮噴施新梢和芽至表面充分濕潤(rùn)且無(wú)液滴凝聚下落，分別于噴施后1、3、6、12、24 h取樣，以噴施5%酒精做0 h對(duì)照。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取3個(gè)枝條作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取其新梢和芽，經(jīng)液氮速凍后于－80℃冰箱保存。

1.2.2 外源ABA處理轉(zhuǎn)MdCoL基因本生煙 選擇長(zhǎng)勢(shì)一致、具有6～8片葉的野生型和轉(zhuǎn)Md-CoL本生煙植株，整株噴施80 mmol／L ABA，每隔3 d噴施1次，連續(xù)噴施15 d，以噴施5%酒精為對(duì)照，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每次噴施前觀察記錄植株的表型變化，測(cè)量株高、節(jié)間長(zhǎng)、葉綠素含量和葉片數(shù)。其中，株高為煙草植株莖基部到生長(zhǎng)點(diǎn)的長(zhǎng)度，節(jié)間長(zhǎng)度為上數(shù)第3～6節(jié)間長(zhǎng)度的平均值，葉綠素含量為頂部3片葉的SPAD－502便攜式葉綠素儀檢測(cè)值的均值，葉片數(shù)為各植株的葉片總數(shù)。

1.2.3 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 總RNA提取參照原平皓（天津）生物技術(shù)有限公司的植物基因組RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。利用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，利用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度。RNA的反轉(zhuǎn)錄參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進(jìn)行。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用內(nèi)參基因MdActin或NbActin的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和1%的瓊脂糖電泳，檢測(cè)cDNA質(zhì)量，選取質(zhì)量好的樣品保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)MdCoL及ABA生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因（表1）的引物，引物合成由上海擎科生物科技有限公司完成。以上述cDNA為模板，檢測(cè)相關(guān)引物質(zhì)量，選取最優(yōu)引物（表2）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。熒光定量PCR反應(yīng)體系配制按SYBR Green PCR Master Mix說明書進(jìn)行。以MdActin或NbActin做內(nèi)參，每組樣品3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共44個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增完全后溫度從65℃按0.1 s升溫1℃緩慢上升至95℃進(jìn)行溶解曲線繪制。每次循環(huán)第三步進(jìn)行熒光采集。

表1 ABA生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因

1.3 數(shù)據(jù)整理與分析

外源ABA及氟啶酮處理后煙草株高、節(jié)間長(zhǎng)、葉綠素含量等表型數(shù)據(jù)及熒光定量PCR數(shù)據(jù)均通過Microsoft Excel進(jìn)行處理，采用2－ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。圖表均通過GraphPad Prism 8繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源ABA對(duì)蘋果MdCoL及ABA生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)的影響

未經(jīng)外源ABA處理時(shí)，柱型蘋果‘威賽克旭’中的MdCoL相對(duì)表達(dá)量約為普通型蘋果‘旭’的6倍；經(jīng)外源ABA處理6 h后，MdCoL在柱型蘋果中明顯上調(diào)表達(dá)，處理12 h后表達(dá)量增加至普通型蘋果的13倍（圖1）。表明相較于普通型蘋果，ABA可明顯促進(jìn)柱型蘋果中MdCoL的表達(dá)。

由圖1可知，ABA的受體基因MdPYL9和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因MdABAR、MdSnRK2在經(jīng)ABA處理后明顯上調(diào)表達(dá)，ABA的生物合成相關(guān)基因MdAAO、MdZEP以及NCED家族的MdNCED2、MdNCED4.1、MdNCED6和MdNCED9在經(jīng)ABA處理后其相對(duì)表達(dá)量也均有不同程度的上升，而且柱型蘋果中上述基因的上調(diào)水平明顯高于普通型蘋果。表明外源ABA處理不僅可以促進(jìn)ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物合成，而且在促進(jìn)MdCoL基因表達(dá)上可能存在一個(gè)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。

圖1 外源ABA影響蘋果中MdCoL及ABA生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)

此外，對(duì)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)控因子MdWRKY和MdWRKY40進(jìn)行分析（圖1）發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)外源ABA處理時(shí)，二者在柱型蘋果中表達(dá)水平低于普通型，與MdAAO、MdZEP、MdNCED4.1、MdPYL9、MdABAR和MdSNRK2在柱型蘋果中的相對(duì)表達(dá)量均高于普通型蘋果不同，這可能與柱型蘋果較高水平的ABA含量相關(guān)。外源ABA處理后，二者在柱型和普通型蘋果中均有一定的上調(diào)表達(dá)，其中，柱型蘋果的MdWRKY表達(dá)量在處理24 h時(shí)略高于普通型蘋果，其余時(shí)間均低于普通型蘋果，而MdWRKY40表達(dá)量在處理6 h時(shí)明顯低于普通型蘋果，其余時(shí)間均高于普通型蘋果，具體還需進(jìn)一步探究。

2.2 氟啶酮對(duì)蘋果MdCoL及ABA生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)的影響

10μmol／L ABA生物合成抑制劑氟啶酮對(duì)柱型和普通型蘋果新梢和芽的處理結(jié)果（圖2）顯示，處理1～12 h內(nèi)，MdCoL的表達(dá)均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，柱型蘋果中下降更明顯，表明氟啶酮可抑制MdCoL的表達(dá)。處理24 h時(shí)，柱型蘋果中的MdCoL表達(dá)量明顯升高，而普通型蘋果中仍表達(dá)下調(diào)，這可能與柱型蘋果中較高水平的本底Md-CoL表達(dá)量有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步探究。

對(duì)ABA生物合成途徑相關(guān)基因的分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氟啶酮處理后，MdNCED2在普通型蘋果中明顯下調(diào)表達(dá)；MdNCED6在柱型和普通型蘋果中均明顯下調(diào)表達(dá)；MdNCED4.1除24 h的表達(dá)水平較高外呈現(xiàn)先上調(diào)再下調(diào)的趨勢(shì)；MdNCED9表達(dá)量在處理后1 h達(dá)到峰值，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；MdAAO表達(dá)量先下降后上升，在普通型蘋果中處理6 h后表達(dá)量即開始上調(diào)，而在柱型蘋果中下調(diào)趨勢(shì)更為明顯且表達(dá)量未能恢復(fù)到未處理時(shí)的水平；MdZEP表達(dá)量在柱型蘋果中先下降后上升，在24 h時(shí)表達(dá)量急劇上升，但在普通型蘋果中變化不明顯（圖2）。說明氟啶酮可以在一定程度上抑制ABA生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，而且柱型蘋果對(duì)氟啶酮處理更為敏感。

圖2 氟啶酮影響蘋果中MdCoL及ABA生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)

對(duì)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的分析發(fā)現(xiàn)，在柱型和普通型蘋果中ABA受體基因MdPYL9在氟啶酮處理后均表現(xiàn)出一定程度的上調(diào)表達(dá)（圖2），但變化幅度低于外源ABA處理后該基因的上調(diào)表達(dá)程度（圖1）。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因MdABAR在氟啶酮處理后明顯下調(diào)表達(dá)；MdSnRK2的表達(dá)則呈現(xiàn)出先下降再升高的趨勢(shì)，其中柱型蘋果中的表達(dá)水平變化相較于普通型蘋果更為明顯；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)控因子MdWRKY40表達(dá)量在普通型蘋果中呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，而在柱型蘋果中處理3 h后開始下調(diào)表達(dá)；MdWRKY則在柱型蘋果中明顯上調(diào)表達(dá)，在普通型蘋果中呈現(xiàn)先上調(diào)表達(dá)后下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)（圖2）。說明氟啶酮不僅可以通過抑制ABA的生物合成影響ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還可能通過負(fù)調(diào)控因子MdWRKY的高表達(dá)來(lái)起作用。

2.3 野生型和轉(zhuǎn)MdCoL本生煙中ABA生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)差異

經(jīng)外源ABA噴施處理后，ABA生物合成相關(guān)基因中，NbAAO、NbVED1和NbNCED1在兩個(gè)轉(zhuǎn)MdCoL本生煙株系中的表達(dá)量均高于野生型，其中NbVED1在轉(zhuǎn)基因株系CoL－5和CoL－15中的表達(dá)量分別是對(duì)照的9倍和10倍，NbNCED1的表達(dá)量分別是對(duì)照的36倍和18倍；NbNCED6則在CoL－5中表達(dá)量下降，在CoL－15中明顯上調(diào)表達(dá)（圖3）。表明MdCoL可上調(diào)本生煙中ABA生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，這進(jìn)一步證明ABA與MdCoL之間存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。

ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因NbSnRK2和受體基因NbPYL9在轉(zhuǎn)基因株系CoL－5和CoL－15中均明顯上調(diào)表達(dá)，且與MdCoL基因呈現(xiàn)相同的表達(dá)趨勢(shì)；NbABAR在CoL－15中明顯下調(diào)表達(dá)（圖3）。表明MdCoL還能促進(jìn)本生煙中ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

圖3 野生型與轉(zhuǎn)MdCoL本生煙中ABA生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)量的差異

2.4 外源ABA對(duì)轉(zhuǎn)MdCoL基因本生煙表型的影響

圖4結(jié)果顯示，ABA處理后的15 d內(nèi)，野生型和轉(zhuǎn)基因株系CoL－5和CoL－15的葉片均發(fā)生了一定程度的失綠，其中，野生型失綠最為明顯，CoL－5次之，CoL－15變化最小，但對(duì)其葉綠素含量的測(cè)定均未發(fā)現(xiàn)顯著差異。外源ABA處理未能改變轉(zhuǎn)基因株系CoL－15的原有表型，但在處理12 d后縮短了轉(zhuǎn)基因株系CoL－5的節(jié)間長(zhǎng)度，也明顯影響了野生型本生煙的表型變化，野生型本生煙在ABA處理3 d后節(jié)間開始縮短，在15 d時(shí)與對(duì)照植株的節(jié)間長(zhǎng)度差異達(dá)到最大。

此外，野生型煙草在ABA處理6天后腋芽萌發(fā)，呈現(xiàn)出類似轉(zhuǎn)基因煙草的短分枝現(xiàn)象（圖4 e），進(jìn)一步證明ABA與蘋果柱型性狀的關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

ABA通常被認(rèn)為是一類響應(yīng)脅迫的植物激素，但也是植物生長(zhǎng)發(fā)育中的一類負(fù)調(diào)控激素［29］。本研究結(jié)果顯示，外源噴施ABA后柱型和非柱型蘋果中MdCoL被誘導(dǎo)表達(dá)，而ABA生物合成抑制劑氟啶酮處理后的結(jié)果與之相反，且柱型蘋果反應(yīng)更敏感，表明ABA可促進(jìn)MdCoL的表達(dá)。此外，前期研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)MdCoL蘋果愈傷中ABA含量增多［29］。本研究也發(fā)現(xiàn)ABA生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)MdCoL煙草中均有不同程度的上升，說明MdCoL可以促進(jìn)ABA的生物合成，且ABA與MdCoL之間存在一個(gè)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。

柱型蘋果樹體矮小，節(jié)間短，側(cè)枝生長(zhǎng)緩慢，長(zhǎng)分枝少，多呈現(xiàn)為大量的短枝，且ABA含量較普通型蘋果高［27－29］。本研究對(duì)柱型和普通型蘋果中ABA生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)，MdAAO、MdZEP、MdNCED4.1、MdPYL9、MdABAR和MdSnRK2在柱型蘋果中表達(dá)水平更高，這可能是由于柱型蘋果中較高水平的ABA含量導(dǎo)致的。前人研究發(fā)現(xiàn)，ABA與水稻株型密切相關(guān)，獨(dú)腳金內(nèi)酯可促進(jìn)ABA生物合成關(guān)鍵基因OsNCED1的表達(dá)，促進(jìn)莖基部ABA的生成，進(jìn)而抑制水稻種子萌發(fā)和側(cè)枝生長(zhǎng)［30］；油菜素內(nèi)酯與ABA之間不僅存在拮抗作用，也存在協(xié)同交互作用［31，32］；GhCUC2可與GhBRC1互作調(diào)控GhNCED1的表達(dá)，從而調(diào)控內(nèi)源ABA含量，且過表達(dá)GhCUC2棉花的果枝數(shù)量減少，長(zhǎng)度變短［33］。本研究也發(fā)現(xiàn)，ABA處理野生型本生煙可誘導(dǎo)其呈現(xiàn)類似轉(zhuǎn)MdCoL本生煙的“短分枝”表型。以上結(jié)果說明ABA能夠抑制蘋果腋芽的萌發(fā)與伸長(zhǎng)，進(jìn)一步證明了ABA與蘋果柱型性狀的關(guān)系。

植物株型是由多種激素共同調(diào)控的，如甜瓜矮化基因CmSI可與生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CmPIN2互作，影響甜瓜莖蔓發(fā)育［34］；赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子DELLA可協(xié)同擬南芥的器官發(fā)育基因ATH1共同維持其蓮座狀株型結(jié)構(gòu)［35］；水稻中HTD12能夠影響ABA和BR的生物合成前體類胡蘿卜素的合成，通過改變激素含量調(diào)節(jié)植物株型［36］。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，MdCoL可促進(jìn)DELLA蛋白相關(guān)基因表達(dá)［37］，可能通過赤霉素途徑調(diào)控蘋果柱型性狀形成；外源BR處理可下調(diào)柱型蘋果中MdCoL表達(dá)，促進(jìn)轉(zhuǎn)MdCoL煙草植株的生長(zhǎng)［38］。本研究發(fā)現(xiàn)外源ABA可促進(jìn)MdCoL表達(dá)，但這些激素之間是否存在相互作用以及它們?cè)谡{(diào)控蘋果柱型性狀形成中的作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

綜上，ABA可促進(jìn)蘋果中MdCoL表達(dá)，二者可能通過一個(gè)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制共同調(diào)控柱型性狀形成。