朱亞珠， 夏率博， 陳 琳， 劉 洋， 吳祖芳,*， 翁佩芳

(1.浙江國際海運職業(yè)技術學院 海洋旅游學院， 浙江 舟山 316021;2.寧波大學 食品與藥學學院， 浙江 寧波 315211)

芽孢桿菌是廣泛存在于環(huán)境中的益生菌之一，在增強機體抗氧化能力，提高免疫力和改善生產性能等方面具有良好的效果[1]。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)作為芽孢桿菌的一個新種，具有植物促生長、生物防治、制備生物修復劑及產生多種酶和抗菌物質等功能[2]，其中的抗氧化性與具有的載體物質胞外多糖[3]和活性肽[4]有關，可作為一種理想的微生物源抗氧化劑。全基因圖譜分析顯示[5-6]，B.velezensis基因組中含有srfAA、srfAB、ituC、bmyB、bioA及fen等多種脂肽類抗生素相關基因，且含有非核糖體多肽合成酶(NRPSs)基因簇，可指導合成多種常見的、具有廣譜抑真菌活性的脂肽，如表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、芬薺素(fengycin)等，這類脂肽類物質能夠對真菌類植物病原體產生明顯的拮抗作用[7-8]。B.velezensis對白菜黑斑病菌[9]、番茄灰霉病菌[10]、小麥赤霉病菌及小麥全蝕病菌[11]等多種植物病原菌具有拮抗作用，因此在農業(yè)上有作為生物抑制劑的潛能[12]。這些特性在食品行業(yè)中也具有一定的應用潛力，但鮮有報道。本團隊前期研究中，從自然發(fā)酵海洋魚醬油樣品中分離得到了一株貝萊斯芽孢桿菌SW5(BacillusvelezensisSW5，以下簡稱SW5)菌株，具有較強的蛋白酶活性和較好的水解海洋魚類蛋白的特性[13]。本研究進一步對菌株SW5的生長特性、生理生化特性及抑菌性能進行分析，并分離純化和初步鑒定其發(fā)酵產生的抑菌物質，為SW5菌株在海洋蛋白質資源深度利用、食品保鮮與安全等方面的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貝萊斯芽孢桿菌SW5及實驗菌株(鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌)，寧波大學食品生物技術實驗室保藏。

HCl、NaOH等(分析純)及LB、TSB、NB培養(yǎng)基，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SW- CJ- 2D型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司;LDZX- 40BⅠ型立式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;5804R型高速大容量冷凍離心機，德國Eppendorf公司;QY- 2102C型全溫振蕩培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1培養(yǎng)基配制

MOLP培養(yǎng)基[14](mg/L)：蛋白胨30 000、蔗糖20 000、酵母提取物7 000、KH2PO41 900、CuSO40.001、FeCl3·6H2O 0.005、Na2MoO40.004、KI 0.002、MnSO4·H2O 3.6、MgSO4450、ZnSO4·7H2O 0.14、H3BO30.01、C6H8O710，pH值7.0。LB固體培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10、胰蛋白胨10、酵母提取物5、瓊脂15。

1.3.2不同環(huán)境因素對菌株SW5生長影響的測定

在LB培養(yǎng)基中接種2% SW5菌株，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)3 d，分別測定不同溫度(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃)、pH值(3、4、5、6、7、8、9、10、11)、NaCl質量濃度(0、5、10、15、20、25、30 g/mL)對細胞生長的影響。細胞生物量的測定方法：分光光度計測定600 nm處吸光度，根據吸光度大小判斷生長狀態(tài)，每個實驗平行重復3次。

1.3.3菌株SW5生長曲線的測定

將菌株SW5種子液(OD600約為 1)，按2%接種量接種到含有50 mL LB培養(yǎng)基的三角燒瓶內，在不同時間取樣，測定其在600 nm處的吸光度，然后以OD值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制生長曲線。

1.3.4菌株SW5的抗生素抗性測定

將SW5菌株按2%接種量接種于TSA平板上，在平板中央打孔，加入一定濃度的EUCAST推薦的抗生素，在37 ℃培養(yǎng)24 h，測量透明圈直徑，直徑越大說明其對抗生素越敏感。

1.3.5菌株SW5發(fā)酵上清液的抑菌特性測定

選取食品中常見的8種病原菌(鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌)為指示菌，取1 mL新鮮菌液加入100 mL的NB固體培養(yǎng)基中，迅速倒入培養(yǎng)皿中，作為指示菌平板。并在平板上用無菌打孔器打孔備用。取活化好的SW5菌株，按3%的接種量接種于MOLP培養(yǎng)基，在37 ℃、200 r/min的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。8 000 r/min離心10 min，得到發(fā)酵上清液。取50 μL發(fā)酵上清液加入指示菌平板的孔中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈直徑。

1.3.6濃縮發(fā)酵液抑菌活性的測定

在20 mL發(fā)酵上清液中加入10 mL的正丁醇，搖勻后離心，抽出有機相后再加入相同體積的正丁醇，重復抽提3次，得到30 mL有機相抽提液。將抽提液進行冷凍干燥，完全凍干后再加入2 mL無菌水溶解，得到濃縮15倍的發(fā)酵上清液。按1.3.5節(jié)方法測定發(fā)酵上清液的抑菌活性。

1.3.7發(fā)酵液抑菌物質鑒定

以濃縮后發(fā)酵上清液為原料，體積分數10%甲醇為溶劑，采用UHPLC- Q Exactive系統(tǒng)，鑒別出其中的抑菌物質[7]。色譜條件：色譜柱BEHC18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A為水(含體積分數0.1%甲酸)，流動相B為乙腈- 異丙醇(體積比1∶1)(含0.1%甲酸)；流速0.40 mL/min，進樣量10 μL，柱溫40 ℃。原始數據用代謝組學處理軟件Progenesis QI (美國Waters Corporation)進行搜庫鑒定，數據庫來源為 http:∥www.hmdb.ca。

2 結果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌SW5的菌落形態(tài)分析

將貝萊斯芽孢桿菌SW5接種在LB固體培養(yǎng)基上，觀察其菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)SW5菌株在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形或橢圓形，一般較大，顏色為不透明灰白色，表面有皺褶，菌落中心有凸起，該結果與鐘麗娟等[15]分離的貝萊斯芽孢桿菌菌落形態(tài)類似。

2.2 菌株SW5的生長曲線分析

貝萊斯芽孢桿菌SW5的生長曲線如圖1。由圖1可知，接種貝萊斯芽孢桿菌SW5后，延遲期為0～2 h，此時菌株生長緩慢；對數生長期為2～14 h，此時菌體數明顯增多，其中培養(yǎng)至第9 h時，其生長速率達到最大；穩(wěn)定期為16～26 h，菌體數不再增加，26 h時菌體的OD600值達到最大；最后在26 h后進入衰亡期，菌體數量開始下降。

圖1 貝萊斯芽孢桿菌SW5的生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus velezensis SW5

2.3 菌株SW5的生理生化特性分析

2.3.1不同環(huán)境因素對菌株SW5生長的影響

菌株SW5在不同溫度下的細胞生長情況如圖2。結果表明：菌株在16～50 ℃均可生長，溫度大于16 ℃時，溫度升高生長速度加快，最適生長溫度為35 ℃。pH值對菌株SW5生長的影響如圖3。從圖3可以看出，pH值為3時細胞不可生長，pH值4～9時均可生長，最適生長pH值為5。不同NaCl質量濃度下的細胞生長情況如圖4。結果表明：在質量濃度0～20 g/100 mL均可生長，0～5 g/100 mL時的生長速度呈上升趨勢，5～20 g/100 mL時生長速度呈下降趨勢。

圖2 溫度對菌株SW5生長的影響Fig.2 Effect of temperatures on growth of strain SW5

圖3 pH值對菌株SW5生長的影響Fig.3 Effect of pH on growth of strain SW5

圖4 NaCl質量濃度對菌株SW5生長的影響Fig.4 Effect of mass fractions of NaCl on growth of strain SW5

AMP：氨芐西林，GEN：慶大霉素，KAN：卡那霉素，STR：鏈霉素，NEO：新霉素，TET：四環(huán)霉素，ERY：紅霉素，CIP：環(huán)丙沙星，CLI：克林霉素，VAN：萬古霉素，RIF：利福霉素，CHL：氯霉素，TRI：甲氧芐啶，LIN：利奈唑胺，QUI：達福普丁，PB：多黏菌素B，CTR：頭孢曲松，IMI：亞胺培南，CAZ：頭孢他啶。圖5 菌株SW5對不同抗生素的抗性Fig.5 Resistance of strain SW5 to various antibiotics

2.3.2菌株SW5抗生素抗性結果分析

菌株SW5對抗生素抗性實驗結果如圖5。從圖5可以看出，SW5菌株對β-內酰胺類抗生素，如頭孢曲松、亞胺培南，以及氯霉素表現(xiàn)得較為敏感；而對多粘菌素B與克林霉素則體現(xiàn)出較強的耐藥性。張小波等[16]獲得了一株鴨源貝萊斯芽孢桿菌GZZY2019，藥敏實驗顯示該菌對紅霉素、環(huán)丙沙星、復方新諾明等15種藥物敏感，對丁胺卡那、哌拉西林、四環(huán)素 3 種藥物中敏，對多粘菌素B、苯唑西林等 6 種藥物耐藥。表明貝萊斯芽孢菌株對多數抗生素表現(xiàn)為敏感，而對多粘菌素B等少數抗生素表現(xiàn)為耐藥，這種特性為其在食品工業(yè)生產中的應用創(chuàng)造了條件與基礎。

2.4 菌株SW5的抑菌活性及抗菌成分分析

菌株SW5發(fā)酵上清液對幾種常見病原菌的抑菌活性如圖6、圖7。結果表明：菌株經過MOLP培養(yǎng)基的發(fā)酵，其上清液對于福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌的生長均表現(xiàn)出一定的抑制作用。發(fā)酵上清液濃縮15倍后，對于福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌的抑菌性增強，其中弗氏檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌的抑菌效果變化最為顯著；而對蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌來說，發(fā)酵液濃縮后抑菌性稍有減弱。整體來說，菌株SW5的發(fā)酵液對于福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌均具有較為顯著的抑菌效果，SW5菌株可作為今后潛在的益生菌應用菌株[17]。

指示菌依次為 1.福氏志賀氏菌，2.鼠傷寒沙門氏菌，3.枯草芽孢桿菌，4.蠟樣芽胞桿菌,5.奇異變形桿菌,6.金黃色葡萄球菌，7.弗氏檸檬酸桿菌，8.大腸埃希氏菌。圖6 菌株SW5發(fā)酵上清液濃縮前后抑菌圈對比Fig.6 Comparison of inhibition zones of fermentation supernatant of strain SW5 before and after concentration

圖7 發(fā)酵上清液對8種病原菌的抑制效果Fig.7 Inhibition effect of supernatant on eight kinds of pathogens

為進一步探究SW5菌株MOLP培養(yǎng)基抗菌特性的原因，以濃縮后的發(fā)酵液樣品為研究對象，通過質譜分析法檢測其抗菌成分，發(fā)酵液質譜檢測的總離子色譜結果如圖8。從圖8可以看出，該檢測條件下，峰形良好，分布相對均勻。

四極飛行時間質譜分析并結合代謝組學軟件和搜庫鑒定等綜合分析表明：m/z1 036.69處的吸收峰分子式為C53H93N7O13，對應表面活性素(圖9)；m/z860.42處的吸收峰分子式為C21H43N5O7，對應莫西霉素、大環(huán)內脂類抗生素(圖10)；m/z655.31處的吸收峰分子式為C34H50N4O9S，為達福普汀，屬于鏈霉菌素類抗生素(圖11)；m/z557.27處的吸收峰分子式為C29H42O9，為山茱萸苷A(圖12)；m/z608.25處的吸收峰分子式為C22H43N5O12，為異帕米星，屬于氨基糖苷類抗生素(圖13)。

圖8 發(fā)酵液樣品的總離子色譜Fig.8 Ion chromatography of fermentation broth sample

圖9 表面活性素質譜Fig.9 Mass spectrum of surfactin

圖10 莫西霉素質譜Fig.10 Mass spectrum of mocimycin

圖11 達福普汀質譜Fig.11 Mass spectrum of dalfopristin

圖12 山茱萸苷A質譜Fig.12 Mass spectrum of corchoroside A

圖13 異帕米星質譜Fig.13 Mass spectrum of isepamicin

菌株SW5發(fā)酵液的成分檢測表明：發(fā)酵液中共檢測到5種不同性質的典型抗菌活性成分，印證了實驗菌發(fā)酵上清液抑菌實驗結果。細菌素是貝萊斯芽孢桿菌產生的優(yōu)勢抑菌物質，張海林等[18]純化出了一種細菌素，分子質量約為10 kDa，能夠抵抗蛋白酶K、胃蛋白酶等多種蛋白酶水解，且對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌均有較強的抑制能力。在常見細菌或放線菌產生的抗菌物質研究中已有較多報道，如在假單胞菌20#-5菌株[19]、海洋放線菌B5[20]、巨大芽孢桿菌L2[21]、枯草芽孢桿菌SB1[22]等菌株的代謝產物中找到了抑菌物質，并對它們的抑菌效果進行廣泛的探索。而作為一種具有特殊蛋白酶活性多樣性與較高蛋白酶活力的SW5菌株[23]，同時兼?zhèn)洚a生多種具有抗菌活性的次級代謝產物的能力，進一步說明了貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株具有的復雜代謝體系及存在多種酶活性，從而賦予SW5菌株多重生物學性能。SW5菌株在食品工業(yè)的進一步開發(fā)與實際應用還有待進一步的研究。

3 結 論

貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株，對數生長周期較長(12 h)，在多種培養(yǎng)基中均能以較快速度生長，且在16～50 ℃、pH值4～9、NaCl質量濃度為0～20g/100 mL可生長。SW5菌株發(fā)酵上清液對福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌具有較強的抑菌作用，其發(fā)酵上清液中含有多種氨基糖苷類抗生素，如表面活性素、莫西霉素和異帕米星等，從而對多種病原菌產生抑制作用。