吉寶麗毛維興張樹武徐秉良

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070)

小麥禾谷孢囊線蟲(Heteroderaavenae)是一種危害禾谷類作物和禾本科牧草根部的土傳病原線蟲,屬于固著性寄生線蟲,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[1]。該線蟲于1874年在德國被首次發(fā)現(xiàn),目前已經(jīng)在全球近40個(gè)國家的小麥種植區(qū)發(fā)生和危害[2];在澳大利亞的小麥種植區(qū),導(dǎo)致糧食減產(chǎn)23%～89%,每年造成高達(dá)7 000萬美元的經(jīng)濟(jì)損失[3];在西班牙重發(fā)區(qū)高達(dá)90%[4]。在中國,該病原線蟲于1989年在湖北首次被發(fā)現(xiàn),目前已在青海、山西、江蘇、河北等16個(gè)省(市)廣泛分布[5-6],危害面積達(dá)小麥種植面積的80%,導(dǎo)致小麥產(chǎn)量損失達(dá)20%～70%[7-8]。另外,禾谷孢囊線蟲發(fā)生危害時(shí)造成小麥根部損傷,增加了土壤中植物病原菌侵染的機(jī)會(huì),進(jìn)一步加重小麥產(chǎn)量的損失[9]。因此,小麥禾谷孢囊線蟲病已成為制約中國小麥生產(chǎn)和糧食安全的重要因素。

當(dāng)前,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,主要采用化學(xué)防治(如米樂爾和好年冬)以及抗耐病品種等措施對植物病原線蟲進(jìn)行防治[10]。但是,目前中國大面積種植的小麥品種抗性較差,同時(shí),抗耐性品種的選育是一項(xiàng)長期的戰(zhàn)略[11-12];化學(xué)防治效果可達(dá)90%以上,但其具有土壤殘留高和毒性大,以及危害土壤中有益微生物等缺陷,且隨著人們環(huán)保和安全意識(shí)的提高,化學(xué)農(nóng)藥的使用正在不斷減少[13]。因此,尋找綠色高效生物農(nóng)藥防治禾谷包囊線蟲已成為必然的趨勢。

木霉菌(Trichodermaspp.)是一種絲狀真菌,其特點(diǎn)是分布廣泛、抑菌譜廣、環(huán)境適應(yīng)強(qiáng),目前已被證實(shí)對立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、腐霉菌(Pythiumspp.)、鐮刀菌(Fusariumspp.)等多種植物病原菌具有拮抗作用[14-15]。同時(shí),木霉菌對植物病原線蟲也有一定的防治效果,如使用擬康氏木霉(T.pseudokoningii)防治根結(jié)線蟲能夠顯著降低卵的孵化率,同時(shí)對2齡幼蟲也具有較強(qiáng)的毒殺作用[16]。張樹武等[17]研究表明,長枝木霉菌(T.longibrachiatum)分生孢子懸浮液對小麥禾谷孢囊線蟲卵具有明顯的寄生和致死作用,從而降低2齡幼蟲的數(shù)量。阿維菌素是一種廣譜、高效、安全、穩(wěn)定的神經(jīng)毒劑類生物農(nóng)藥,對農(nóng)業(yè)上許多害蟲包括植物寄生線蟲具有一定的防治效果,且在土壤中降解迅速,無累積、無殘留[18]。張同慶等[19]研究表明,1%阿維菌素對鐵棍山藥根結(jié)線蟲的防效為60.54%。但是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中單一使用阿維菌素容易引起小麥禾谷孢囊線蟲的抗藥性和效果不穩(wěn)定等問題[20]。

生防真菌與生物農(nóng)藥混配使用,不僅能夠提高防治效果,還能起到擴(kuò)大防病譜、延緩線蟲抗藥性等作用[21-22]。因此,本試驗(yàn)以禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲為研究對象,測定長枝木霉T6、阿維菌素及其不同比例混用對其室內(nèi)毒殺效果,以期獲得一種高效的復(fù)配型生物農(nóng)藥,為新型生防制劑的開發(fā)與應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供在PDA 培養(yǎng)基上生長的長枝木霉T6菌株,于2016年保藏于中國科學(xué)院微生物研究所,保藏號(hào)為CGMCC No.13183。

1.1.2 供試土樣 采用五點(diǎn)取樣法于2015年7月在河南省小麥禾谷孢囊線蟲發(fā)生較嚴(yán)重的地塊采集土樣,取樣時(shí)先去除土塊的表層干土,然后取0～20 cm 層的土壤,將多點(diǎn)土樣混勻,備用。

1.1.3 供試藥劑 有效成分含量為1.8%的阿維菌素乳油,浙江世佳科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲分離 采用“漂浮法”[23]分離孢囊。向河南采集的病田土樣中加入一定量的自來水,充分?jǐn)嚢柚镣翗尤咳芙?靜置2～3 min即為土壤懸浮液,利用嵌在65目網(wǎng)篩中的25目網(wǎng)篩緩慢過濾懸浮液,重復(fù)3次,以防止孢囊被過濾掉。去掉25目網(wǎng)篩,用干凈的水緩慢沖去65目網(wǎng)篩中的泥沙,將剩余物倒入墊有雙層擦鏡紙的漏斗內(nèi)。然后將過濾后的剩余物移入干凈的培養(yǎng)皿中,用竹簽在體式顯微鏡下挑取新鮮、飽滿的棕色孢囊,置于4 ℃冰箱,備用。挑取的孢囊用1% NaCl O 溶液消毒1 min,并用無菌水沖洗6次。然后將消毒的孢囊放入墊有擦鏡紙的線蟲分離器中,置于15～20℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵化13～22 d,每天收集孵化的2齡幼蟲,置于顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)板配制濃度為200 m L-1的2齡幼蟲懸浮液,4 ℃下保存,備用。

1.2.2 長枝木霉菌T6菌株孢子懸浮液的制備

取25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d的長枝木霉T6菌株P(guān)DA 平板,加入100μL Tween 80及5 m L無菌水,用無菌毛刷將孢子刷入無菌的10 m L 離心管中充分震蕩,即獲得分生孢子懸浮液,利用血球計(jì)數(shù)板配制使終濃度為2.0×107cfu·m L-1,備用。

1.2.3 阿維菌素溶液的制備 將1.8%的阿維菌素乳油用無菌水分別配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg·m L-1溶液,備用。

1.2.4 長枝木霉T6孢子懸浮液與阿維菌素溶液復(fù)配劑的制備 按體積比為1∶1、2∶1、3∶1的比例分別復(fù)配濃度為2.0×107cfu·m L-1的長枝木霉T6分生孢子懸浮液和上述5個(gè)濃度的阿維菌素溶液,充分震蕩使其混合均勻,備用。

1.2.5 長枝木霉與阿維菌素及其復(fù)配對2齡幼蟲毒殺作用的測定 利用無菌的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板測定單劑和復(fù)配劑的殺線活性,每孔中先加入10μL濃度為2×102m L-1的2齡幼蟲懸浮液,再分別加入90μL長枝木霉T6與阿維菌素復(fù)配劑、單一長枝木霉T6孢子懸浮液和不同濃度的阿維菌素溶液,以加入等量的無菌水作為對照處理。每個(gè)處理16個(gè)重復(fù),置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24 h在顯微鏡下觀察并記錄線蟲的死亡蟲數(shù),根據(jù)記錄數(shù)據(jù)計(jì)算其校正死亡率、致死中量并進(jìn)行方差分析。

死亡率=死亡2齡幼蟲數(shù)量/供試2齡幼蟲數(shù)量×100%

校正死亡率=(處理死亡率-對照死亡率)/(1-對照死亡率)×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2017對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并利用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析,差異顯著性檢驗(yàn)采用Duncan氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 長枝木霉T6菌株孢子懸浮液對線蟲毒殺活性

長枝木霉T6菌株孢子懸浮液處理禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲表現(xiàn)出較好的毒殺活性,并且隨處理時(shí)間的增大活性增強(qiáng),與對照相比存在顯著差異(表1)。

表1 長枝木霉T6菌株孢子懸浮液對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲的毒殺效果Table 1 Toxic effect of T.longibrachiatum T6 spore on the second stage juveniles of H.avenae

2.2 不同濃度阿維菌素溶液對線蟲毒殺活性

阿維菌素溶液對2齡幼蟲具有較好的毒殺活性,隨著阿維菌素濃度和處理時(shí)間的增加而不斷增強(qiáng),且不同濃度對2齡幼蟲的致死作用存在顯著差異。由毒力回歸方程和LC50可知,阿維菌素溶液對2齡幼蟲的致死作用與其濃度以及處理時(shí)間呈正相關(guān)(表2)。

表2 不同濃度阿維菌素對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲的毒殺效果Table 2 Toxic effect of different concentrations of Avermectin on second stage juveniles of H.avenae

2.3 長枝木霉T6菌株和阿維菌素復(fù)配溶液對線蟲毒殺活性

長枝木霉T6菌株孢子懸浮液與阿維菌素溶液復(fù)配后對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲具有較強(qiáng)的毒殺作用,其活性明顯高于單一木霉菌株或單一阿維菌素,顯著提高單一木霉或單一阿維菌素對2齡幼蟲的毒殺效果。濃度為2.0×107cfu·m L-1的長枝木霉T6 菌株孢子懸浮液與0.5μg·m L-1的阿維菌素按體積比1∶1 復(fù)配處理2齡幼蟲48 h后的死亡率高達(dá)96.30%,校正死亡率為96.30%(表3)。由毒力回歸方程和LC50可知,長枝木霉孢子懸浮液與不同濃度阿維菌素復(fù)配對2齡幼蟲的毒殺作用與阿維菌素濃度以及處理時(shí)間呈正相關(guān)。

表3 長枝木霉與阿維菌素1∶1混劑對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲的毒殺作用Table 3 Toxic effect of T.longibrachiatum and Avermectin 1∶1 mixture on second stage juveniles of H.avenae

濃度為2.0×107cfu·m L-1的長枝木霉T6菌株孢子懸浮液與0.5μg·m L-1的阿維菌素按體積比2∶1復(fù)配處理2齡幼蟲24 h和48 h后的死亡率分別為64.44%與91.24%(表4);兩者按體積比3∶1復(fù)配處理2齡幼蟲24 h和48 h后的死亡率分別為74.29%與91.07%(表5)。試驗(yàn)結(jié)果表明,長枝木霉T6菌株孢子懸浮液與阿維菌素溶液按不同體積比復(fù)配后對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲均具有較強(qiáng)的毒殺作用,與單一木霉或單一阿維菌素處理2齡幼蟲的毒殺效果相比,均有顯著提高,表明長枝木霉孢子懸浮液與阿維菌素有很好的兼容性,而且當(dāng)阿維菌素濃度為0.5 μg·m L-1時(shí),長枝木霉孢子懸浮液與其按1∶1、2∶1、3∶1的體積比混合處理2齡幼蟲24 h,對線蟲毒殺活性有顯著差異,而在處理48 h后毒殺活性無顯著差異。

表4 長枝木霉與阿維菌素2∶1混劑對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲的毒殺作用Table 4 Toxic effect of T.longibrachiatum and Avermectin 2∶1 mixture on second stage juveniles of H.avenae

表5 長枝木霉與阿維菌素3∶1混劑對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲的毒殺作用Table 5 Toxic effect of T.longibrachiatum and Avermectin 3∶1 mixture on second stage juveniles of H.avenae

3 結(jié)論與討論

單一阿維菌素和單一長枝木霉T6菌株孢子懸浮液對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲均具有較好的毒殺效果,且隨處理濃度和時(shí)間的增大效果增強(qiáng);長枝木霉T6孢子懸浮液與阿維菌素有很好的兼容性,長枝木霉T6菌株孢子懸浮液與不同濃度阿維菌素溶液按不同體積比復(fù)配后對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲均具有較強(qiáng)的毒殺作用,毒殺效果顯著優(yōu)于單一木霉或單一阿維菌素。

馬金慧等[24]利用哈茨木霉發(fā)酵液原液處理南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲,48 h后的校正死亡率達(dá)到100%;本試驗(yàn)中,長枝木霉分生孢子懸浮液處理2 齡幼蟲48 h 后,線蟲的校正死亡率為71.43%,校正死亡率的差異可能與生防真菌的種類、殺線機(jī)制以及病原線蟲的不同等有關(guān)[25]。

通過將不同作用機(jī)制的生防菌與生物農(nóng)藥復(fù)配后進(jìn)行植物病原菌的防治,能夠顯著提高防治效果,同時(shí)減少農(nóng)藥的使用并延長農(nóng)藥的持效期。楊波等[26]利用生防真菌淡紫紫孢菌顆粒劑與阿維菌素復(fù)配防治黃瓜根結(jié)線蟲,復(fù)配后阿維菌素的用量顯著降低,且有明顯的增效作用。木霉菌與阿維菌素均與環(huán)境相容性好,復(fù)配使用生產(chǎn)成本低,成分多樣,線蟲不易產(chǎn)生抗藥性,具有擴(kuò)大防治譜和協(xié)同增效等作用[18,27]。在本試驗(yàn)中,長枝木霉T6 菌株孢子懸浮液與阿維菌素溶液以1∶1體積比復(fù)配時(shí),對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲的防效達(dá)96.3%,所需的長枝木霉T6菌株分生孢子懸浮液用量少,生產(chǎn)成本低,具有良好的應(yīng)用前景。