王藝臻，高 慧，賈 菲

阿司匹林和氯吡格雷雙重抗血小板治療常用于急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)或接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)治療的病人?？寡“逯委熯^(guò)程中的血小板聚集不同個(gè)體之間差異較大，未獲得抗血小板藥物治療的病人可能導(dǎo)致高治療血小板反應(yīng)性(high on-treatment platelet reactivity，HPR)和不良臨床缺血事件，對(duì)血小板藥物反應(yīng)過(guò)度導(dǎo)致低治療血小板反應(yīng)性(low on-treatment platelet reactivity，LPR)和不良出血事件[1-2]。藥物反應(yīng)導(dǎo)致遺傳變異性，因此，基因測(cè)試可識(shí)別攜帶某些可改變血小板反應(yīng)性個(gè)體化基因(多態(tài)性)病人并指導(dǎo)個(gè)性化治療。增加藥物劑量或改用替卡格雷或普拉格雷的抗血小板新藥治療LRP是可行的[3-4]。

血小板內(nèi)皮聚集受體-1(platelet endothelial aggregation receptor-1，PEAR1)是一種通過(guò)血小板與血小板接觸和受體激動(dòng)劑激活的血小板跨膜蛋白。通過(guò)激活的PEAR1依賴GPⅡb/Ⅲa功能傳遞信號(hào)，穩(wěn)定血小板凝血酶[5-7]。臨床研究顯示，阿司匹林治療期間PEAR1基因變異是血小板反應(yīng)性的決定因素[8-9]。分析環(huán)氧化酶1/血栓素A2通路被阿司匹林充分抑制，最大聚合的發(fā)生可能依賴于其他信號(hào)通路，如PEAR1血小板和血小板的相互作用通路對(duì)血小板聚集有影響。病人PEAR1基因突變對(duì)采用阿司匹林和氯吡雙重抗血小板治療二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)誘導(dǎo)血小板聚集的影響較少。本研究旨在分析PEAR1不同位點(diǎn)基因突變與雙重抗血小板治療病人預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年10月—2019年10月我院收治的冠心病病人612例，所有病人均接受PCI治療，同時(shí)給予阿司匹林和氯吡格雷雙重抗血小板治療。采用血栓彈性成像法測(cè)定血小板聚集，并測(cè)定血小板聚集抑制率(IPA)，其中IPA<30%的307例病人作為高治療血小板反應(yīng)性組(HRP組)，另外IPA>70%的305例病人作為低治療血小板反應(yīng)性組(LRP組)。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)會(huì)批準(zhǔn)，且所有病人均知情同意。所有病人PCI術(shù)前均接受300 mg阿司匹林和300 mg氯吡格雷治療，之后1年內(nèi)口服氯吡格雷每日75 mg，并終身口服阿司匹林每日100 mg。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡≥50歲；確診為冠心病；臨床資料齊全。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 年齡<50歲；血小板功能檢測(cè)結(jié)果不全；血小板計(jì)數(shù)<100×109/L或>300×109/L；血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定；1年內(nèi)主動(dòng)出血或有出血事件；出血傾向；口服血小板抗凝藥劑等。

1.3 血小板功能 PCI術(shù)后12～36 h，抽取病人空腹靜脈血于兩個(gè)真空管中，其中1個(gè)真空管中含3.2%檸檬酸三鈉抗凝劑，而另1個(gè)含鋰肝素抗凝劑，真空管顛倒混勻3～5次與抗凝血?jiǎng)┏浞只旌?。采用血小板成像法測(cè)定ADP誘導(dǎo)的血小板聚集[11]，采用TEG止血分析儀(Haemonetics Corp，Braintree，MA)和自動(dòng)化分析軟件測(cè)量，計(jì)算IPA：IPA=100%-100%×[(MAADP×MAFIBRIN)/(MATHROMBIN-MAFIBRIN)]；其中MAADP是ADP誘導(dǎo)聚集強(qiáng)度(抗血小板藥物效應(yīng)的測(cè)量)，MAFIBRIN是纖維誘導(dǎo)聚集強(qiáng)度，MATHROMBIN是凝血酶誘導(dǎo)最大聚集強(qiáng)度。

1.4 基因分析 采用HapMap(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)選擇16個(gè)PEAR1的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)進(jìn)行分析[12]。HapMap的選擇包括次等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>0.05和連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)測(cè)定r2閾值為0.8。并采用SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)軟件進(jìn)行單體型分析。抽取病人4 mL血樣并貯存于含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝真空管中。根據(jù)鹽析法提取全血樣本基因組DNA。選擇PEAR1的SNPS采用改良多重連接酶檢測(cè)反應(yīng)(improved multiple ligase detection reaction，imLDR)進(jìn)行基因分型(上海捷斯基生物科技有限公司)測(cè)定。同時(shí)采用隨機(jī)重復(fù)樣本(n=17)和DNA測(cè)序進(jìn)行重復(fù)基因分型。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較(見(jiàn)表1)

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組PEAR1基因型分布 兩組16個(gè)PEAR1的SNPs頻率和Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)是一致的。17個(gè)隨機(jī)重復(fù)基因型的符合率和16個(gè)SNPs評(píng)估的覆蓋率分別為100.00%和99.29%，HPR組和LPR組5個(gè)SNPs分布不同。HRP組rs11264580次要等位基因C、rs2644592次要等位基因G、rs3737224次要等位基因T和rs41273215次要等位基因T頻率高于LPR組(P<0.05)。LPR組rs57731889純合TT基因型頻率高于HPR組(P<0.05)。單因素分析顯示：所有的SNPs中，rs11264580、rs2644592、rs3737224和rs41273215與HPR相關(guān)，rs57731889與LPR相關(guān)。詳見(jiàn)表2。

表2 兩組PEAR1基因型分布 單位：例(%)

2.3 PEAR1的SNPs與血小板反應(yīng)性的影響因素Logistic回歸分析 以病人是否發(fā)生高血小板聚集作為因變量，以REAR1的16個(gè)SNPs基因型及病人一般資料作為自變量。將單因素分析中發(fā)現(xiàn)的PEAR1的5個(gè)SNPs進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，進(jìn)一步確定SNPs與血小板反應(yīng)性的相關(guān)性。回歸模型校正了可能影響血小板功能的潛在混雜因素，如年齡、性別、血小板計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和危險(xiǎn)因素等。結(jié)果顯示，rs41273215位點(diǎn)次要等位基因T與HPR獨(dú)立相關(guān)，rs57731889純合子TT基因型與LPR獨(dú)立相關(guān)。詳見(jiàn)表3。

表3 PEAR1的SNPs與血小板反應(yīng)性的影響因素Logistic回歸分析

2.4 PEAR1的SNPs與血小板反應(yīng)性的單倍型相關(guān)性分析 對(duì)5個(gè)SNPs(rs11264580、rs2644592、rs3737224、rs41273215、rs57731889)進(jìn)行單倍型分析，結(jié)果表明，5個(gè)SNPs單倍型分析中的結(jié)合產(chǎn)生8個(gè)單倍型。8個(gè)單倍型中，CGTTC表達(dá)與HPR相關(guān)，單倍型TACCT與LPR相關(guān)。詳見(jiàn)表4。

表4 PEAR1的SNPs與血小板反應(yīng)性的單倍型相關(guān)性分析 單位：例(%)

3 討 論

PEAR1是一種影響血小板聚集和內(nèi)皮功能的血小板跨膜蛋白，且PEAR1基因遺傳變異可能影響血小板抗血小板治療前后反應(yīng)性，并可能發(fā)生心血管事件。本研究采用阿司匹林和氯吡格雷對(duì)冠心病病人進(jìn)行ADP誘導(dǎo)血小板聚集，分析其與PEAP1基因的SNPs的相關(guān)性。通過(guò)單變量分析揭示了次要等位基因C為rs11264580，次要等位基因G為rs2644592，次要等位基因T為rs3737224，次要等位基因T為rs41273215，且單倍型C-G-T-T-C與HPR相關(guān)，而rs57731889基因型TT和單倍型T-A-C-C-T與LPR相關(guān)。進(jìn)一步采用多元回歸模型對(duì)混雜因素進(jìn)行校正分析，發(fā)現(xiàn)rs41273215是HPR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，rs57731889是LPR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

有研究表明，病人通過(guò)口服新型抗血小板藥物普拉格雷引起血小板聚集，且發(fā)現(xiàn)PEAR1的SNPs中rs11264580、rs3737224和rs41273215與普拉格雷引起的血小板聚集增加有關(guān)[13-14]，與本研究結(jié)果一致。有研究顯示，rs3737224和rs41273215對(duì)血小板聚集的重要性[15]。

本研究證實(shí)了rs57731889純合TT基因型與血小板低反應(yīng)性相關(guān)。有研究表明，PEAR1中rs12041331次要等位基因A與膠原誘導(dǎo)的血小板聚集減少存在相關(guān)性[16-17]，rs12041331次要等位基因A與氯吡格雷誘導(dǎo)低膠原刺激血小板聚集有關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，rs12041331次要等位基因A與ADP誘導(dǎo)的血小板聚集減少無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，分析可能是由于不同的激動(dòng)劑可刺激血小板，提示不同的藥物作用途徑不同，結(jié)論可能存在差異，說(shuō)明rs12041331的血小板聚集可能是通過(guò)膠原介導(dǎo)的受體途徑，而不是依賴ADP途徑。與以往研究不同，其他幾個(gè)SNPs在本研究中得到證實(shí)，這些基因包括位于PEAR1基因啟動(dòng)子區(qū)SNP的rs2768759等位基因C，rs11264579次要等位基因T和rs56260937(C/T)的同義變體。有研究顯示，SNP的rs2768759等位基因C與血小板聚集增加有關(guān)，不論是ADP、膠原蛋白或腎上腺素激動(dòng)劑還是阿司匹林治療[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)ADP刺激，rs11264579次要等位基因T與高纖維蛋白原結(jié)合和P選擇素表達(dá)相關(guān)[12]，且rs56260937(C/T)的同義變異在血小板聚集中發(fā)揮著重要作用。本研究涉及的SNPs與血小板反應(yīng)性相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析可能是由于研究人群、臨床因素、環(huán)境因素及檢測(cè)血小板功能方法存在差異導(dǎo)致的。

有研究分析PEAR1多態(tài)性和臨床結(jié)果的關(guān)系，認(rèn)為提高血小板功能的遺傳變異可能增加冠心病病人死亡、心肌梗死和腦卒中風(fēng)險(xiǎn)[12]，病人接受阿司匹林和氯吡格雷雙重抗血小板治療后，與GG純合子相比，rs12041331等位基因A攜帶者更易發(fā)生心血管事件或死亡；單獨(dú)阿司匹林治療，rs12041331等位基因A攜帶者相較于GG純合子，可能增加心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)[19]。因此，PEAR1基因多態(tài)性對(duì)臨床的影響需進(jìn)一步深入研究，可能需要大樣本研究證實(shí)臨床結(jié)論，通過(guò)PEAR1基因檢測(cè)進(jìn)行個(gè)體化治療，從而改善病人預(yù)后，且PEAR1可能是潛在的抗血栓治療靶點(diǎn)藥物。

綜上所述，與血小板相關(guān)的SNPs中rs2644592、rs41273215、rs57731889為反應(yīng)性位點(diǎn)，分別位于PEAR1基因的4，15，16內(nèi)含子區(qū)域。rs11264580和rs3737224分別位于外顯子區(qū)10和12，但為同義突變。推測(cè)這些內(nèi)含子或啟動(dòng)子變異可能為轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，這些轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)攜帶增強(qiáng)子元件和選擇性剪接位點(diǎn)上調(diào)基因表達(dá)。因此，PEAR1基因在不同位點(diǎn)變化對(duì)血小板反應(yīng)活性影響存在差異，今后需進(jìn)一步研究揭示PEAR1基因突變、基因表達(dá)及血小板之間的相互作用機(jī)制。