樊茹 李曉非

結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)檢測技術(shù)的檢測時(shí)間長、敏感度或特異度欠佳、無法區(qū)分活性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染等，在一定程度上制約了結(jié)核病的早期診斷和治療。特別是涂片陰性肺結(jié)核、肺外結(jié)核和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染缺乏典型的臨床表現(xiàn)或影像學(xué)特征，且鑒別診斷技術(shù)較少，導(dǎo)致結(jié)核病的防控形勢更加復(fù)雜[1]。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是精準(zhǔn)診療時(shí)代的來臨，分子生物學(xué)檢測技術(shù)在結(jié)核病早期診斷輔助方面受到廣泛重視和應(yīng)用。分子生物學(xué)檢測技術(shù)具有準(zhǔn)確、高效、高通量等優(yōu)點(diǎn)，為結(jié)核病的診療及疫情的防控帶來了新曙光[2]。本文中，筆者綜合國內(nèi)外學(xué)者研究成果，對(duì)結(jié)核病分子生物學(xué)檢測技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用現(xiàn)況進(jìn)行綜述。

一、基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的結(jié)核病檢測及藥物敏感性分析技術(shù)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)核酸擴(kuò)增技術(shù)通常以IS6110、rpoB、gyrB、IS1081、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)等為靶標(biāo)，通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。2017年，國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)重新修訂發(fā)布的《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》標(biāo)準(zhǔn)中，已將MTB核酸檢測陽性作為結(jié)核病的診斷依據(jù)之一，可見其對(duì)結(jié)核病的輔助診斷具有重要的應(yīng)用價(jià)值[3]。

1.利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)(GeneXpert MTB/RIF，簡稱“GeneXpert”)：以GeneXpert檢測技術(shù)為代表的盒式檢測技術(shù)的出現(xiàn)標(biāo)志著結(jié)核病分子生物學(xué)檢測技術(shù)出現(xiàn)了新突破。GeneXpert檢測試劑盒由美國Cepheid公司開發(fā)，適用于GeneXpert儀器。該技術(shù)以多重半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)為實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，檢測MTB利福平耐藥決定區(qū)rpoB基因，可在2 h內(nèi)直接從患者新鮮痰液或凍存痰液中檢測是否含有MTB及其對(duì)利福平的耐藥性[4]。研究顯示，對(duì)于肺結(jié)核患者檢測呼吸道標(biāo)本，GeneXpert檢測的敏感度為61.8%～85.0%，特異度為98%～99%[5-8]；對(duì)MTB/HIV雙重感染者的痰標(biāo)本，其檢測的敏感度為85%[6]；對(duì)痰涂片陽性肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，其檢測的敏感度達(dá)98%[6]；對(duì)痰涂片陰性肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，其檢測的敏感度為67%[6]；檢測結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液標(biāo)本的敏感度為23%～52%[9]?；谏鲜鲅芯?，GeneXpert在檢測涂片陽性肺結(jié)核方面的應(yīng)用已得到廣泛認(rèn)可；并且對(duì)于疑似MTB/HIV雙重感染時(shí)，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)建議首選GeneXpert進(jìn)行檢測[10]。然而，也有研究表明，GeneXpert檢測含菌量低的標(biāo)本的敏感度下降，限制了其在涂片陰性肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者檢測中的使用[6,11]。

2．GeneXpert MTB/RIF Ultra(簡稱“Xpert Ultra”)：為進(jìn)一步提高GeneXpert檢測的敏感度，美國Cepheid公司推出了第二代GeneXpert檢測系統(tǒng)——Xpert Ultra。該檢測系統(tǒng)有2個(gè)不同的多拷貝擴(kuò)增靶標(biāo)(IS6110和IS1081)，并擁有了更大的DNA反應(yīng)室(由GeneXpert的25 μl體系增加至Xpert Ultra的50 μl體系)[7]。Xpert Ultra還集成了全套核酸擴(kuò)增和更快速的熱循環(huán)，這促使其檢測下限可達(dá)到16 CFU/ml，而GeneXpert為114 CFU/ml[12]。最近進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性研究結(jié)果顯示，Xpert Ultra和GeneXpert對(duì)137份涂片陰性但培養(yǎng)陽性肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測，敏感度分別為63%和46%；對(duì)115份MTB/HIV雙重感染患者培養(yǎng)陽性痰標(biāo)本檢測，敏感度分別為90%和77%；Xpert Ultra 和GeneXpert檢測的總體特異度分別為96%和98%；相比于初治肺結(jié)核患者，Xpert Ultra對(duì)復(fù)治患者檢測的特異度略低，為93%；但Xpert Ultra在檢測利福平耐藥方面的敏感度與GeneXpert一致[13]。由此可見，在檢測含MTB菌量低的標(biāo)本和MTB/HIV雙重感染患者的標(biāo)本方面，Xpert Ultra的敏感度較GeneXpert有所提高；然而與其他檢測技術(shù)類似，提高檢測敏感度的同時(shí)特異度會(huì)略微降低[14]。目前，GeneXpert和Xpert Ultra已經(jīng)在數(shù)十個(gè)國家獲得較為廣泛的應(yīng)用。但是，它們具有同樣的缺點(diǎn)，即僅能檢測MTB單一利福平耐藥rpoB基因的一段熱點(diǎn)突變區(qū)域，因此，有必要在現(xiàn)有基礎(chǔ)上納入對(duì)其他一線、二線抗結(jié)核藥物的耐藥性檢測；同時(shí)，其檢測成本較高，不適合在低收入國家和地區(qū)進(jìn)行推廣。

3.Truenat MTB、Truenat MTB Plus和Truenat MTB-Rif Dx：近幾年，印度推出了更適合在低收入國家使用的可以同時(shí)檢測多個(gè)靶標(biāo)、檢測效率高且檢測成本較低的Truenat系統(tǒng)，包括Truenat MTB、Truenat MTB Plus和Truenat MTB-Rif Dx。該系統(tǒng)被認(rèn)為是GeneXpert的替代品，已經(jīng)通過了WHO專家組技術(shù)性能的驗(yàn)證并獲得了WHO的推薦[15]。Truenat MTB是基于微量逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)和核酸雜交芯片的結(jié)核病檢測技術(shù)。其利用TruePrep儀器(一種可用電池驅(qū)動(dòng)的納米技術(shù)設(shè)備)提取痰標(biāo)本中的DNA(25 min)，在Truelab-UNOTM(電池驅(qū)動(dòng)的手持式熱循環(huán)儀)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增并分析報(bào)告結(jié)果(35 min)[12]。Truenat MTB Plus的原理與Truenat MTB相同，Truenat MTB-Rif Dx作為可選的附加芯片，用于MTB對(duì)利福平的耐藥性檢測[16]。與GeneXpert相比，Truenat MTB的樣本使用量更少(由GeneXpert的l ml減少至Truenat MTB的0.5 ml)；其更大的優(yōu)勢在于只有MTB陽性的標(biāo)本才會(huì)進(jìn)行利福平耐藥性檢測，大大節(jié)省了試劑和檢測成本。多項(xiàng)研究顯示，Truenat MTB、Truenat MTB Plus和Truenat MTB-Rif Dx對(duì)結(jié)核病和利福平耐藥的檢測效能與GeneXpert和Xpert Ultra一致[17-19]。除此之外，區(qū)別于其他檢測技術(shù)只能在受控環(huán)境中的特殊實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作，Truenat系統(tǒng)的整套裝置由電池提供電源，便于攜帶，在基礎(chǔ)設(shè)施不完善的國家和偏遠(yuǎn)地區(qū)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)也可以使用。

4.基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的結(jié)核病檢測技術(shù)：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)在2016年被WHO推薦作為痰涂片鏡檢的替代技術(shù)，用于疑似結(jié)核病患者的檢測[20]。其擴(kuò)增原理是在鏈置換DNA聚合酶參與下，為MTB靶基因的6個(gè)不同的特異性區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異性引物，使其在恒溫條件下短時(shí)間(15～60 min)循環(huán)，高速有效擴(kuò)增。這種核酸擴(kuò)增技術(shù)不需要復(fù)雜設(shè)備或特殊試劑，直接通過肉眼觀察是否有綠色熒光或白色沉淀即可判讀結(jié)果，適合在基層實(shí)驗(yàn)室或偏遠(yuǎn)山區(qū)推廣[21]。一些研究顯示，應(yīng)用IS6110、gyrB作為LAMP的靶標(biāo)檢測肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，其檢測敏感度為82%～99%，特異度為94.0%～96.8%[22-24]。Bojang等[24]研究顯示，LAMP和GeneXpert檢測肺結(jié)核具有相似的高敏感度及特異度。當(dāng)然，LAMP也存在不足。Joon等[25]為解決該技術(shù)可能會(huì)因非特異性擴(kuò)增而導(dǎo)致假陽性結(jié)果這一問題，使用尿嘧啶-N-糖基化酶+脫氧尿苷三磷酸法對(duì)LAMP技術(shù)進(jìn)行了改良，經(jīng)臨床標(biāo)本驗(yàn)證顯示，改良后的LAMP技術(shù)可以消除污染DNA的擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本也表現(xiàn)出較高的檢測敏感度(94.4%)和特異度(97.2%)。

二、基于核酸分子雜交技術(shù)的結(jié)核病檢測及藥物敏感性分析技術(shù)

線性探針技術(shù)(line probe assay，LPA)的主要原理是利用生物素化的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與固定于膜上的特異性寡核苷酸探針雜交，根據(jù)酶聯(lián)免疫比色進(jìn)行結(jié)果解釋。其既能用于MTB檢測，也能用于藥物耐藥突變檢測[26]。2008年，WHO批準(zhǔn)LPA用于結(jié)核病患者的利福平和異煙肼的耐藥性檢測。這是WHO最早推薦使用的結(jié)核病分子生物學(xué)檢測技術(shù)[27]。有研究統(tǒng)計(jì)，對(duì)于痰涂片陽性的肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，LPA檢測MTB對(duì)利福平耐藥的敏感度和特異度分別為96.7%和98.8%，檢測MTB對(duì)異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為90.2%和99.2%；但該技術(shù)檢測痰涂片陰性肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本敏感度不高，僅為44%[28]。德國Hain公司推出的第二代LPA技術(shù)，在痰涂片陰性肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本的檢測和二線抗結(jié)核藥物的藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)方面得到了較好的應(yīng)用。WHO又于2016年推薦其用于二線注射類和氟喹諾酮類抗結(jié)核藥物的耐藥突變檢測[29]。Singh等[30]研究顯示，對(duì)于痰涂片陰性肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，以BACTEC MGIT 960快速培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，第二代LPA檢測的敏感度達(dá)68.4%。一項(xiàng)Meta分析顯示，第二代LPA檢測MTB對(duì)利福平、異煙肼、二線注射類藥物(包括卡那霉素、卷曲霉素、丁胺卡那霉素)、氟喹諾酮類藥物的耐藥性，以及檢測耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的敏感度分別為91%、80%、79%、92%、81%和46%，特異度分別為98%、98%、98%、94%、99%和100%；可見，其檢測耐藥結(jié)核病的準(zhǔn)確度較高[31]。但LPA技術(shù)的明顯缺點(diǎn)是擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測時(shí)，手工操作復(fù)雜且容易產(chǎn)生污染，因而，限制了其推廣和應(yīng)用[32]。

三、基于基因測序的結(jié)核病檢測及藥物敏感性分析技術(shù)

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因測序成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。與核酸擴(kuò)增技術(shù)和核酸分子雜交等基因檢測技術(shù)不同，基因測序可提供特定基因的序列信息或完整準(zhǔn)確的基因組，因此，也被認(rèn)為是分子生物學(xué)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。二代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)又被稱為高通量測序，是一種新興的基于基因序列的病原微生物的鑒定方法。其基本原理是將基因組分割成短片段，對(duì)短片段測序再進(jìn)行拼接，已成功應(yīng)用于生物體的常規(guī)表征[33]、基因分型[34]和結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查[35]等。已有報(bào)道顯示，NGS檢測肺結(jié)核(痰和肺泡灌洗液標(biāo)本)和肺外結(jié)核(腦脊液和膿液標(biāo)本)均具有較高的敏感度[36-39]。Ko等[40]將NGS應(yīng)用于MTB耐藥基因分析，得到了耐藥基因堿基突變情況列表，為今后使用NGS進(jìn)行MTB耐藥基因突變位點(diǎn)檢測提供了參考。辜吉秀等[41]研究顯示，NGS檢測MTB對(duì)異煙肼、利福平、氧氟沙星等抗結(jié)核藥品的耐藥性的效能較好，能夠滿足臨床需要。NGS由于具有測序速度快、檢測效率高和突變基因檢出分辨率高等特點(diǎn)，被臨床廣泛應(yīng)用于耐藥結(jié)核病，特別是MDR-TB的檢測。但NGS由于價(jià)格高昂、技術(shù)要求高和生物信息管道的標(biāo)準(zhǔn)不一等原因在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)和國家的適用性受限[42]。

四、其他新型結(jié)核病檢測技術(shù)

1.Cobas TaqMan MTB：瑞士Roche公司推出的Cobas TaqMan MTB是第一個(gè)基于TaqMan qPCR的高通量檢測試劑盒。Cobas TaqMan MTB運(yùn)行在Cobas 8800全自動(dòng)分子診斷系統(tǒng)上，使用通用的標(biāo)本準(zhǔn)備流程，可在8 h內(nèi)完成960個(gè)樣本的高通量檢測。Cobas TaqMan MTB在檢測呼吸道標(biāo)本時(shí)具有較高的敏感度和特異度，分別為80.8%～88.4%和98.8%～99.4%[43-44]；而檢測非呼吸道標(biāo)本時(shí)敏感度較低，僅為63.6%[45]。但該技術(shù)在使用N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)對(duì)標(biāo)本液化、去污和濃縮過程中，導(dǎo)致結(jié)果假陰性的可能性較高[46]。

2.BD MAX MDR-TB：BD MAX MDR-TB是一款檢測臨床標(biāo)本中MTB，同時(shí)檢測MTB對(duì)利福平和異煙肼耐藥性的自動(dòng)化分子診斷系統(tǒng)[47]。該系統(tǒng)單次最多檢測24個(gè)樣本，手工操作時(shí)間短，4 h內(nèi)可出結(jié)果[48]。研究表明，與BACTEC MGIT 960快速培養(yǎng)相比，BD MAX MDR-TB檢測痰標(biāo)本的總體敏感度和特異度為93%和97%；檢測涂片陽性和涂片陰性肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本的敏感度分別為100%和81%。與藥敏試驗(yàn)相比，其檢測MTB對(duì)利福平耐藥性的敏感度和特異度分別為90%和95%，檢測MTB對(duì)異煙肼耐藥性的敏感度和特異度分別為82%和100%[49]。

3．realtime MTB和realtime MTB RIF/INH：以多重qPCR為原理的realtime MTB和realtime MTB RIF/INH檢測系統(tǒng)是美國Abbott公司開發(fā)的用于檢測呼吸道標(biāo)本的MTB和利福平、異煙肼耐藥性的技術(shù)，它們的系統(tǒng)是相互獨(dú)立的，但都依賴高通量m2000全自動(dòng)系統(tǒng)[50-51]。realtime MTB每批次運(yùn)行最多可以檢測96個(gè)標(biāo)本，檢出為陽性的標(biāo)本繼續(xù)使用realtime MTB RIF/INH進(jìn)行耐藥性檢測，每批次運(yùn)行最多可以檢測24個(gè)標(biāo)本。Kohli等[52]薈萃分析顯示，對(duì)于呼吸道標(biāo)本(痰液、肺泡灌洗液等，4858份)，realtime MTB檢測MTB的敏感度和特異度分別為96%和97%；realtime MTB RIF/INH檢測MTB對(duì)利福平耐藥性的敏感度和特異度分別為94%和100%，檢測MTB對(duì)異煙肼耐藥性的敏感度和特異度分別為89%和99%。realtime MTB RIF/INH在檢測MTB/HIV雙重感染患者的痰標(biāo)本時(shí)也具有良好的效能，敏感度在70%以上，特異度可達(dá)90%[53]。

五、總結(jié)

隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)核病的檢出效率明顯提高，接受耐藥性檢測患者的比例也顯著提高。但大量涌現(xiàn)的敏感度高、特異度強(qiáng)的分子生物學(xué)檢測技術(shù)并未從根本上改變結(jié)核病診斷困難的現(xiàn)狀。高昂的檢測成本使得這些技術(shù)在中低發(fā)展水平的國家難以推廣，而較大比例的結(jié)核病患者恰恰分布在這些國家和地區(qū)。因此，相對(duì)于一味追求兼具高敏感度、高特異度和自動(dòng)化全封閉的技術(shù)，在全面衡量技術(shù)性能和經(jīng)濟(jì)可承受性的基礎(chǔ)上發(fā)展適合醫(yī)療條件較差地區(qū)的分子生物學(xué)檢測技術(shù)就顯得尤為重要。除受到經(jīng)濟(jì)條件制約外，這些地區(qū)往往很難獲得及時(shí)的醫(yī)療服務(wù)，特別是對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高的分子生物學(xué)檢測服務(wù)。因此，不僅要研發(fā)低檢測成本的高效檢測技術(shù)，還需發(fā)展適合邊遠(yuǎn)地區(qū)檢測需求的即時(shí)檢驗(yàn)快速檢測系統(tǒng)。