陳磊 郭海萍 逄宇 劉光福 潘兆寶 韓守華 程娟 李?yuàn)檴?/p>

近年來(lái)，由非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)引起感染的患者明顯增多，其中以膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus)感染最為常見(jiàn)[1]。膿腫分枝桿菌是一種快速生長(zhǎng)型NTM，主要引起肺部及皮膚軟組織感染[2]，已有很多關(guān)于膿腫分枝桿菌在人與人之間進(jìn)行傳播，甚至引起院內(nèi)感染的報(bào)道[3-4]。膿腫分枝桿菌對(duì)現(xiàn)有的大多數(shù)抗生素及經(jīng)典的抗結(jié)核藥物具有天然耐藥性[5]，因此其引起的感染極難治療。

最近的研究表明，3-氨甲基-4-鹵代苯并噁唑類化合物GSK656作為一種結(jié)核分枝桿菌亮氨酰-tRNA 合成酶(leucyl-tRNA synthetase)的小分子抑制劑，可用于治療耐多藥結(jié)核病[6]。本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究表明，GSK656對(duì)膿腫分枝桿菌具有較好的體外抑菌活性[7]。GSK656與其他抗菌藥物，特別是與氨基糖苷類藥物聯(lián)合使用在治療因膿腫分枝桿菌感染引起的疾病時(shí)是否具有協(xié)同效應(yīng)，將為以GSK656為有效治療方案的制定提供新的臨床依據(jù)。本研究評(píng)價(jià)GSK656與氨基糖苷類藥物——阿米卡星聯(lián)合用藥對(duì)膿腫分枝桿菌分離株的體外抑菌活性，為臨床應(yīng)用GSK656聯(lián)合阿米卡星治療膿腫分枝桿菌感染提供依據(jù)。

材料和方法

一、材料和儀器

1.臨床分離株：膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 19977)及30株分離株來(lái)自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院菌株庫(kù)。所有膿腫分枝桿菌分離株均已通過(guò)多位點(diǎn)序列分析，包括16S rRNA、hsp65、rpoB、16S-23S rRNA序列測(cè)定，在分析比對(duì)后鑒定菌株種類[8]。

2.培養(yǎng)基和抗菌藥物：中性羅氏(L?wenstein-Jensen)培養(yǎng)基購(gòu)自麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，抗菌藥物粉劑阿米卡星購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，GSK656購(gòu)自上海瀚香生物科技有限公司。采用無(wú)菌純水溶解后通過(guò)無(wú)菌0.22 μm濾膜(愛(ài)爾蘭默克密理博公司)過(guò)濾后備用。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 主要檢測(cè)指標(biāo)：檢測(cè)阿米卡星、GSK656對(duì)30株膿腫分枝桿菌的體外最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)、抑制50%受試菌所需的最低抑菌濃度(MIC50)、抑制90%受試菌所需的最低抑菌濃度(MIC90)。MIC50和MIC90可以反映藥物的體外抑菌活性，數(shù)值越低，體外抑菌活性越強(qiáng)。

2. MIC測(cè)定：微量肉湯稀釋法參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and Laboratory Stan-dards Institute，CLSI)指南進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)[9]。取接種于中性羅氏培養(yǎng)基并培養(yǎng)3～7 d長(zhǎng)勢(shì)良好的膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 19977)和30株分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。使用Mueller-Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基對(duì)抗生素進(jìn)行稀釋，GSK656的濃度范圍為0.008～8 mg/L，阿米卡星的濃度范圍為0.125～128 mg/L。從羅氏培養(yǎng)基斜面上刮取菌落并制備成1個(gè)麥?zhǔn)蠞舛鹊男迈r菌液，以1∶20比例稀釋后接種于96孔微孔板中。30 ℃ 孵育72 h后，每孔加入含20 μl阿爾瑪藍(lán)和50 μl 的5%吐溫-80混合液，以37 ℃孵育24 h后評(píng)估細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。將阻止液體由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色的最低藥物濃度判定為MIC值。本研究采用CLSI指南，將MIC≤16 mg/L定義為阿米卡星對(duì)膿腫分枝桿菌敏感，將MIC≥64 mg/L定義為阿米卡星對(duì)膿腫分枝桿菌耐藥[9]；而對(duì)于GSK656，膿腫分枝桿菌的耐藥基線值尚無(wú)報(bào)道。

3. 分級(jí)抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)測(cè)定：聯(lián)合藥敏試驗(yàn)采用棋盤(pán)稀釋法，根據(jù)各單藥MIC結(jié)果確定聯(lián)合藥敏試驗(yàn)使用的藥物濃度范圍，將GSK656和阿米卡星分別進(jìn)行倍比稀釋，使其工作濃度分別為8×MIC、4×MIC、2×MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC。以30 ℃孵育72 h后，每孔加入含20 μl阿爾瑪藍(lán)和50 μl的5%吐溫-80混合液，以37 ℃孵育24 h后評(píng)估細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。記錄兩藥聯(lián)合使用時(shí)的MIC值，并計(jì)算FICI判斷兩種藥物聯(lián)合使用的效果。FICI計(jì)算方法：FICI=A藥聯(lián)合使用時(shí)的MIC/A藥單獨(dú)使用時(shí)的MIC+B藥聯(lián)合使用時(shí)的MIC/B藥單獨(dú)使用時(shí)的MIC。FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.52為拮抗作用[10]。

結(jié) 果

一、GSK656與阿米卡星單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)膿腫分枝桿菌的MIC情況

30株膿腫分枝桿菌分離株對(duì)各抗菌藥物的MIC值見(jiàn)表1。對(duì)于阿米卡星，膿腫分枝桿菌的耐藥基線值為≥64 mg/L。本研究中30株膿腫分枝桿菌分離株對(duì)阿米卡星的敏感率為100.0%(30/30)(表1，2)。GSK656單獨(dú)使用時(shí)對(duì)30株膿腫分枝桿菌分離株的MIC50和MIC90分別為0.250 mg/L和2.000 mg/L，阿米卡星單獨(dú)使用時(shí)對(duì)30株膿腫分枝桿菌分離株的MIC50和MIC90分別為8.000 mg/L和16.000 mg/L。當(dāng)兩種藥物聯(lián)合使用時(shí)，GSK656的MIC50和MIC90分別為0.125 mg/L和0.500 mg/L，為單獨(dú)使用時(shí)的1/2和1/4，阿米卡星的MIC50和MIC90與單獨(dú)使用時(shí)相同。

表1 30株膿腫分枝桿菌對(duì)GSK656和阿米卡星的MIC值分布情況(株)

二、GSK656和阿米卡星聯(lián)合使用對(duì)膿腫分枝桿菌的FICI分布影響

GSK656和阿米卡星聯(lián)合使用對(duì)30株膿腫分枝桿菌以無(wú)關(guān)作用為主(80.0%，24/30)，對(duì)5株(16.7%)產(chǎn)生了協(xié)同作用，僅有1株(3.3%)產(chǎn)生了拮抗作用(表3，4)。

表2 30株膿腫分枝桿菌分離株對(duì)GSK656和阿米卡星的MIC范圍(mg/L)

表3 30株膿腫分枝桿菌對(duì)GSK656和阿米卡星單獨(dú)和聯(lián)合使用的MIC和FICI分布情況

表4 30株膿腫分枝桿菌對(duì)GSK656和阿米卡星單獨(dú)和聯(lián)合使用的MIC和FICI具體情況

續(xù)表4

討 論

在過(guò)去的幾年中，由NTM引起的感染患者例數(shù)快速增加[11-12]。由于缺乏明確的人與人之間傳播的證據(jù)，由NTM引起的感染往往容易被忽視[13]。且由于其對(duì)大多數(shù)的抗生素天然耐藥，對(duì)膿腫分枝桿菌感染的治療非常困難[14]。目前的治療方案推薦應(yīng)用氨基糖苷類或大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進(jìn)行治療，然而僅有約1/3的患者在多種抗生素治療后能夠獲得良好的疾病轉(zhuǎn)歸[11]。鑒于目前用于治療的抗生素效果不佳，亟需新的藥物或者藥物組合來(lái)治療因膿腫分枝桿菌感染引起的疾病。

目前的指南推薦使用大環(huán)內(nèi)酯類聯(lián)合氨基糖苷類或碳青霉烯類藥物治療膿腫分枝桿菌引起的肺部疾病[15]。氨基糖苷類藥物在分枝桿菌引起的疾病的治療中一直扮演著重要的角色。大多數(shù)氨基糖苷類化合物是由鏈霉菌屬或小單孢菌屬的放線菌產(chǎn)生的天然物質(zhì)。氨基糖苷類化合物的殺菌原理主要是通過(guò)與細(xì)菌的30 S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致翻譯過(guò)程不能正常進(jìn)行，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16]。該類抗生素的特點(diǎn)是抗菌譜廣，殺菌作用迅速，并能與其他藥物產(chǎn)生協(xié)同作用。阿米卡星通常用于治療由快速生長(zhǎng)型分枝桿菌引起的嚴(yán)重感染，包括偶然分枝桿菌和膿腫分枝桿菌。然而，在快速生長(zhǎng)的龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌中，由于核糖體操縱子單一拷貝的存在，其16S rRNA 1408位點(diǎn)的單一突變將導(dǎo)致高水平的阿米卡星耐藥。突變頻率已被證明高達(dá)10-5[16]。這表明當(dāng)這些細(xì)菌大量存在時(shí)，氨基糖苷類藥物不應(yīng)作為單一藥物使用。

作為替代療法，一些新的抗結(jié)核藥物用于NTM患者的治療實(shí)現(xiàn)了治療效果[17]。因此，進(jìn)行體外(聯(lián)合)藥敏試驗(yàn)評(píng)估這些新的抗結(jié)核藥物對(duì)NTM的MIC至關(guān)重要。GSK656是一種新的結(jié)核分枝桿菌亮氨酰-tRNA 合成酶的小分子抑制劑，它可以抑制亮氨酸修飾和蛋白質(zhì)合成[6]。已有研究表明，GSK656對(duì)耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病的分離株均有較好的體外抑制效果[7]。目前，關(guān)于GSK656對(duì)NTM菌株的體外抑菌活性的研究結(jié)果較少。Li等[6]藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果證實(shí)，GSK656在小鼠模型中的生物利用度為11.12 h·μg·ml-1，高于本研究中大多數(shù)膿腫分枝桿菌分離株的MIC值。本研究結(jié)果表明，GSK656在體外具有良好的抗膿腫分枝桿菌活性。96.7%(29/30)的測(cè)試菌株MIC值≤2 mg/L，因而GSK656是一種潛在的抗膿腫分枝桿菌的藥物。

阿米卡星是治療膿腫分枝桿菌肺病的一種氨基糖苷類藥物[13]。在本研究中，30株分離株對(duì)阿米卡星的敏感率為100.0%，且阿米卡星與GSK656的聯(lián)合效應(yīng)較好，16.7%表現(xiàn)為協(xié)同作用，80%表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用，僅3.3%表現(xiàn)為拮抗作用。從機(jī)制上看，GSK656是一種tRNA合成酶的抑制劑[6]，而阿米卡星的作用位點(diǎn)為16S rRNA[13]，兩者在抑制蛋白質(zhì)合成上可能有協(xié)同作用或相加作用。30株分離株中，僅有1株的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示為拮抗作用，推測(cè)其拮抗作用可能是由于該菌株在傳代培養(yǎng)的過(guò)程中，部分菌株對(duì)阿米卡星產(chǎn)生了耐藥。

在體外藥敏試驗(yàn)中，將阿米卡星與GSK656聯(lián)合作用，可提供GSK656與常規(guī)抗膿腫分枝桿菌藥物之間療效的直接比較，為GSK656在臨床的應(yīng)用提供新的參考依據(jù)。本研究結(jié)果表明，當(dāng)GSK656與阿米卡星聯(lián)合使用后，GSK656對(duì)膿腫分枝桿菌的MIC50和MIC90較單獨(dú)使用時(shí)出現(xiàn)明顯降低，由于協(xié)同作用而減少的MIC可能有助于取得良好的預(yù)后，從而提高臨床療效，減少耐藥的出現(xiàn)[11]。

本研究存在一定局限性。首先，體外確定的抗菌藥物的活性可能不能預(yù)測(cè)體內(nèi)的藥效，特別是協(xié)同作用。其次，不良反應(yīng)的發(fā)生是一個(gè)重要的問(wèn)題，但在現(xiàn)有研究中無(wú)法獲得此類信息。

綜上所述，體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，GSK656或GSK656和阿米卡星聯(lián)合用藥可能可以作為膿腫分枝桿菌治療的替代方案，但結(jié)果仍需進(jìn)一步的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。