史江莉， 王颯， 王磊， 仝瑞冉， 王森， 胡青霞， 萬然， 簡在海， 鄭先波， 陳延惠

(河南農(nóng)業(yè)大學園藝學院/河南省果樹瓜類生物學重點實驗室，河南 鄭州 450002)

石榴是千屈菜科(Lytharceae)石榴屬(PunicagranatumL．)落葉灌木或小喬木[1-2]，富含類黃酮、花青苷、鞣花單寧、酚酸等抗氧化活性物質(zhì)，對人類健康具有醫(yī)療和保健功效[3-7]。石榴的可食用部位是籽粒，包含假種皮、種皮、種仁3部分。石榴根據(jù)種皮的硬度差異，國內(nèi)外有不同的分類標準。陸麗娟等[8]將其分為軟籽(<3.67 kg·cm-2)、半軟籽(3.67～4.2 kg·cm-2)和硬籽石榴(>4.2 kg·cm-2)3類。ZAREI等[9]將其分為4類，即軟籽(8.16～15.31 kg·cm-2)，半軟籽(20.41～22.45 kg·cm-2)，半硬籽(30.61～42.86 kg·cm-2)，硬籽(45.92～64.29 kg·cm-2)。由于品種、儀器及測試者個人力度差異等因素的影響，石榴硬度分類標準存在較大差異。種子硬度作為鮮食品質(zhì)的重要指標，直接影響石榴的可食性和消費者的購買意向。硬籽石榴的種皮木質(zhì)素含量較高，不方便食用，而軟籽石榴的種皮木質(zhì)素含量較低，可直接食用，無需吐渣，更受消費者的青睞[10-11]，尤其是風靡全國各地的軟籽石榴品種‘突尼斯軟籽’石榴[12-13]。軟籽石榴在生產(chǎn)與消費市場潛力巨大，也是珍貴的石榴種質(zhì)資源，成為石榴育種的重要方向。

木質(zhì)素作為植物細胞壁的重要組分，不僅能增強植物體機械強度和細胞壁的硬度，并且在抵御逆境脅迫方面也發(fā)揮重要作用[14]。但是，石榴種子硬度與木質(zhì)素含量密切相關(guān)，木質(zhì)素的含量越高，種子硬度越高，并且硬籽石榴種子中的木質(zhì)素含量高于軟籽石榴[10,15-17]，因此，調(diào)節(jié)木質(zhì)素的生物合成是降低石榴籽粒硬度，培育軟籽石榴新種質(zhì)的重要途徑。目前，木質(zhì)素生物合成途徑已被闡明，木質(zhì)素是植物苯丙氨酸代謝途徑中的次生代謝產(chǎn)物。以苯丙氨酸為起點，經(jīng)過一系列脫氨基、羥基化、甲基化等反應，生成木質(zhì)素單體，即，對香豆醇(p-coumaryl alcohols)、松柏醇(coniferyl alcohols)和芥子醇(sinapyl alcohols)，再進一步氧化，聚合生成對-羥基苯基木質(zhì)素(H木質(zhì)素)、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(G木質(zhì)素)和紫丁香基木質(zhì)素(S木質(zhì)素)3種木質(zhì)素。在雙子葉植物中，木質(zhì)素主要有兩種，即S木質(zhì)素和G木質(zhì)素[18-20]。ZAREI等[16]通過對比軟籽石榴和硬籽石榴的種子不同發(fā)育階段與細胞壁形成相關(guān)的基因表達，發(fā)現(xiàn)S單體含量越高，種皮越柔軟，S/G單體比例的差異可能是石榴種子軟化的主要原因。QIN等[11]通過對比石榴種子發(fā)育不同階段的木質(zhì)素合成途徑中代謝物的累積，發(fā)現(xiàn)松柏醇和芥子醇在石榴種皮中大量累積，并且S和G是石榴種皮中主要的木質(zhì)素單體。然而，木質(zhì)化是一個復雜而動態(tài)的生物學過程，其生物合成途徑包含12種酶，受許多基因和代謝物的網(wǎng)絡調(diào)控[21]。其中，轉(zhuǎn)錄因子家族WRKY、MYB、NAC的基因成員參與木質(zhì)素代謝，在硬籽石榴中的表達水平高于軟籽石榴，從而調(diào)控植物木質(zhì)素的生物合成[10]。軟籽石榴和硬籽石榴的蛋白組學的對比研究還表明，木質(zhì)素生物合成相關(guān)的差異表達蛋白在軟籽石榴品種花后60 d表達水平較低[17]。

與硬籽石榴相比，軟籽石榴不僅品種資源較少，研究基礎(chǔ)較薄弱，而且木質(zhì)素生物合成在不同籽粒硬度品種中的差異尚不清晰。因此，本研究通過對比分析硬籽石榴‘泰山紅’和軟籽石榴‘突尼斯軟籽’在種子發(fā)育期的種子硬度、木質(zhì)素含量差異、木質(zhì)素代謝途徑的12個關(guān)鍵基因的表達，并結(jié)合成熟種子中代謝物的富集差異，探究石榴種子硬度形成機制，進而挖掘降低種子木質(zhì)素含量的優(yōu)異基因，為培育軟籽石榴新種質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’石榴種植于河南農(nóng)業(yè)大學園藝學院果樹試驗站，位于(河南省鄭州市金水區(qū)(34.46°N；113.40°E)。2019年分別采集‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’新梢上幼嫩的莖和葉片，并于盛花期后30、45、70、120 d 4個種子發(fā)育時期各采集6個果實(大小一致、著色相同、無病蟲害、無損傷)，立即帶至河南農(nóng)業(yè)大學園藝學院實驗室，用游標卡尺測定果實的橫徑和縱徑(保留兩位小數(shù)，3次重復，計算平均值)；果實切開，隨機混合籽粒，去掉假種皮，分為兩組。一組用于測定種子硬度、木質(zhì)素含量等。另一組種子及葉片和莖迅速于液氮中冷凍，并儲存在-80 ℃冰箱，用于木質(zhì)素途徑小分子物質(zhì)檢測及相關(guān)分子試驗。

1.2 種子硬度和木質(zhì)素含量的測定

采用數(shù)顯GY-4果實硬度計(艾德堡儀器有限公司，浙江省樂清市)分別測定20粒石榴種子硬度，3次重復，計算平均值，單位為kg·cm-2，將石榴種子于80 ℃烘干至質(zhì)量恒定，粉碎并過0.425 mm孔徑的篩子，稱取2 mg，參照木質(zhì)素含量試劑盒說明書(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，浙江省)，測定木質(zhì)素含量，3次重復。

1.3 木質(zhì)素代謝過程中小分子物質(zhì)的測定

‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’盛花期后120 d的成熟種子送武漢邁特維爾生物科技有限公司，采用超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC；Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A)和串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem Mass Spectrometry，MS/MS；Applied Biosystems 4500 QTRAP)聯(lián)用檢測木質(zhì)素途徑小分子物質(zhì)的含量，3次重復。樣品提取流程：將石榴的種子樣品進行真空冷凍干燥，用研磨儀(MM 400，Retsch)30 Hz研磨1.5 min至粉末狀。稱取100 mg種子粉末，溶解于0.6 mL提取液；溶解后的樣品于4 ℃冰箱過夜，其間渦旋6次；10 000×g離心10 min，吸取上清液，用微孔濾膜(0.22 μm pore size)過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。根據(jù) fold change≥2或fold change≤0.5 的標準確定最終差異代謝物。

1.4 實時熒光定量PCR分析

石榴種子總RNA提取采用生工柱式植物總RNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司，中國)，參照HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國)說明書合成第一鏈cDNA。實時熒光定量試驗采用Applied Biosystems 7500 Fast儀器，95 ℃預變性5 min，40個循環(huán)：95 ℃變性10 s，60℃退火和延伸30 s。根據(jù)公式用2-ΔΔCt計算基因相對表達量[22]。木質(zhì)素代謝途徑12個關(guān)鍵酶，即PAL(苯丙氨酸解氨酶，phenylalanine ammonialyase)、CAD(肉桂醇脫氫酶，cinnamyl alcohol dehydrogenase)、4CL(4-香豆酸輔酶A連接酶，4-coumarate: CoA ligase)、COMT(咖啡酸鄰位甲基轉(zhuǎn)化酶，caffeic acid O-methyltransferase)、C4H(肉桂酸4-羥化酶，cinnamate 4-hydroxylase)、CCOMT(咖啡酰輔酶A-鄰甲基化轉(zhuǎn)移酶，caffeoyl-CoA O-methyltransferase)、CCR(肉桂酸輔酶A還原酶，cinnamoyl-CoA reductase)、F5H(阿魏酸5-羥化酶，ferulate 5-hydroxylase)、C3H(對香豆酸3-羥化酶，p-coumaroyl-CoA 3-hydroxylase)、HCT(奎尼酸/莽草酸對羥化肉桂?；o酶A轉(zhuǎn)移酶，shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase)、POD(過氧化物酶，peroxidase)、LAC(漆酶，laccase)的基因引物序列見表1。PgActin基因(GenBank Accession No. LOC116200207)作為內(nèi)參。Real-time PCR采用20 μL的反應體系：1 μL的反轉(zhuǎn)錄模板；正反向引物各1 μL；10 μL的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國)；7 μL ddH2O。每個處理3次重復，計算平均值。

表1 木質(zhì)素代謝途徑關(guān)鍵基因?qū)崟r定量PCR特異引物Table 1 Special primers of key genes in lignin metabolism pathway for real-time PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2016分析試驗數(shù)據(jù)，SPSS Statistics v.20 (IBM，Chicago，IL，USA)用于數(shù)據(jù)的顯著性分析(P<0.05)。Origin 8軟件繪制坐標圖，R軟件 (v 3.5.1)的prcomp函數(shù)繪制主成分分析(PCA)散點圖，TBtools軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同石榴種子發(fā)育時期的果實大小及種子硬度和木質(zhì)素含量比較

如圖1-A和1-B所示，隨著果實的生長發(fā)育，‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’果實的橫徑和縱徑明顯增大。在相同的發(fā)育時期，‘泰山紅’的果實比‘突尼斯軟籽’略大，并且，圖1-E的果實表型觀察進一步證實了這個結(jié)果。此外，‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’石榴果實橫徑在盛花期后120 d具有顯著性差異，而縱徑自盛花期后70 d就具有顯著性差異。

從圖1-C和1-D可以發(fā)現(xiàn)，伴隨著種子發(fā)育和成熟，2個石榴品種的種子硬度和木質(zhì)素含量均逐漸增加，‘突尼斯軟籽’中始終低于‘泰山紅’，并具有顯著性差異。在盛花期后30 d，‘泰山紅’種子硬度比‘突尼斯軟籽’高1.98 kg·cm-2，木質(zhì)素含量高6.29%；在盛花期后120 d，‘泰山紅’種子硬度比‘突尼斯軟籽’高3.67 kg·cm-2，木質(zhì)素含量高5.14%。石榴種子的硬度和木質(zhì)素含量相關(guān)性分析表明，兩者呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.939(P<0.01)。

2.2 不同品種石榴成熟種子的木質(zhì)素代謝物差異

為探究種子硬度形成的差異和原因，運用UPLC-ESI-MS/MS的方法從硬籽石榴‘泰山紅’和軟籽石榴‘突尼斯軟籽’成熟果實的種子中，共檢測到木質(zhì)素代謝途徑中的11種代謝物，其中5種為差異代謝物。這11種代謝物的二維PCA散點圖表明，2個主成分PC1和PC2分別解釋了總變異的68.46%和15.05%(圖2)?！┥郊t’(H)和‘突尼斯軟籽’(T)的3個重復分別聚集在PC1的兩側(cè)，表明該方法穩(wěn)定，樣品重復性好，并且兩組樣品具有明顯差異。

T：‘突尼斯軟籽’，H：‘泰山紅’。

為進一步探究木質(zhì)素代謝途徑中代謝物累積模式，本研究對比分析了2個石榴品種成熟期種子中11種代謝物累積差異。如圖3聚類熱圖所示，2個品種被聚為2個主要分支，左側(cè)為軟籽石榴‘突尼斯軟籽’的3個生物學重復(T1，T2，T3)，右側(cè)為硬籽石榴‘泰山紅’的3個生物學重復(H1，H2，H3)。表明這些代謝物在兩個品種之間存在顯著差異，并且這個結(jié)果與圖2的主成分分析結(jié)果一致。同時，這11種代謝物中，有8種物質(zhì)，包括苯丙氨酸、松柏醛、芥子酸、松柏醇、對香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、對香豆醛，在軟籽石榴中的含量高于硬籽石榴。而肉桂酸和芥子醇的含量在2個石榴品種無明顯差異。僅有芥子醛的含量在‘突尼斯軟籽’中顯著低于‘泰山紅’。

T：‘突尼斯軟籽’，H：‘泰山紅’

2.3 石榴不同組織中木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵基因的表達

為解析木質(zhì)素代謝在軟籽石榴和硬籽石榴中的差異，本研究在石榴不同植物組織中，包括葉片(L)、外果皮(P)、種子(S)、莖(M)，檢測了木質(zhì)素代謝途徑關(guān)鍵基因的表達。通過對比木質(zhì)素代謝途徑中相關(guān)基因在2個品種的4種植物組織中的表達水平(圖4)，發(fā)現(xiàn)PgPAL基因在‘泰山紅’的莖中表達量最高，且明顯高于‘突尼斯軟籽’，而在‘突尼斯軟籽’的4個植物組織中，葉片中PgPAL基因表達量最高。PgC4H和Pg4CL均在2個品種的葉片中高表達，并且在‘泰山紅’葉片中的表達量最高。PgCCR、PgCOMT、PgCCOMT、PgC3H、PgHCT、PgLAC均在石榴莖中表達量最高，對比2個石榴品種，PgCCR和PgC3H在‘突尼斯軟籽’中的表達高于‘泰山紅’，其余PgHCT、PgCOMT、PgCCOMT、PgLAC則在‘泰山紅’中表達量高于‘突尼斯軟籽’。PgF5H基因在石榴種子中表達量最高，且在‘突尼斯軟籽’種子中表達量高于‘泰山紅’。但是，PgCAD和PgPOD基因表達在2個石榴品種的植物組織中存在差異，PgCAD基因分別在‘泰山紅’的葉和‘突尼斯軟籽’的種子中表達量最高；PgPOD基因分別在‘突尼斯軟籽’莖中和‘泰山紅’的外果皮中表達量最高。

2.4 果實不同發(fā)育期木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵基因的表達

為揭示木質(zhì)素生物合成在硬籽石榴和軟籽石榴中的差異，本研究對比分析了硬籽石榴和軟籽石榴木質(zhì)素代謝途徑中12個關(guān)鍵基因在種子發(fā)育期的表達(圖5)。結(jié)果表明，這些基因在不同籽粒硬度品種種子發(fā)育期的表達具有顯著差異。隨著‘突尼斯軟籽’種子發(fā)育，有9個基因，即PgPAL、PgC4H、PgC3H、PgHCT、Pg4CL、PgCCR、PgLAC、PgF5H、PgCCOMT的表達量逐漸升高，均在盛花期后70 d達到峰值，而后表達量下降。除了PgC4H基因，其余8個基因在‘突尼斯軟籽’盛花期后70 d的表達量均高于‘泰山紅’。在硬籽石榴‘泰山紅’中，PgPAL、Pg4CL、PgHCT、PgLAC、PgCOMT5個基因隨著種子生長發(fā)育，其表達呈逐漸下降的趨勢；PgC4H基因和PgF5H基因在‘泰山紅’盛花期后70 d表達量最高，與‘突尼斯軟籽’中的表達趨勢一致；PgCCR和PgCOMT基因在‘泰山紅’盛花期后45 d表達量最高。PgCAD和PgPOD基因在‘突尼斯軟籽’種子發(fā)育過程中表達水平逐漸下降，但PgCAD在‘泰山紅’盛花期后70 d基因表達量最高，PgPOD隨著‘泰山紅’的種子發(fā)育，表達水平無明顯變化。石榴PgCOMT基因在2個品種的表達趨勢則相反，在‘泰山紅’種子發(fā)育過程中逐漸下降，而在‘突尼斯軟籽’中逐漸上升。

TL：‘突尼斯軟籽’葉片，HL：‘泰山紅’葉片，TP：‘突尼斯軟籽’果皮，HP：‘泰山紅’果皮，TS：‘突尼斯軟籽’種子，HS：‘泰山紅’種子，TM：‘突尼斯軟籽’莖，HM：‘泰山紅’莖。

本研究進一步分析了石榴成熟果實種子中木質(zhì)素代謝途徑的小分子物質(zhì)含量，有助于解析石榴籽粒硬度形成的機制。從圖5可以看出，在木質(zhì)素代謝途徑前期，‘突尼斯軟籽’中的對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、及下游的松柏醇含量均顯著高于‘泰山紅’，僅有芥子醛的含量在‘泰山紅’中高于‘突尼斯軟籽’。

綠色字體表示與‘泰山紅’相比，代謝物含量在‘突尼斯軟籽’中顯著下調(diào)，紅色字體表示代謝物含量在‘突尼斯軟籽’中顯著上調(diào)。長方框內(nèi)4個圓圈從左到右分別代表種子4個發(fā)育時期(花后30，45，70，120 d)，藍色長方框為‘突尼斯軟籽’，紅色長方框為‘泰山紅’。

3 結(jié)論與討論

石榴籽粒硬度影響石榴口感和可食性，種子中的木質(zhì)素含量是構(gòu)成石榴籽粒硬度的主要因素。本研究測定了‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’成熟果實的種子硬度，分別為2.97和6.63 kg·cm-2。根據(jù)陸麗娟等[8]的標準，‘突尼斯軟籽’和‘泰山紅’分別屬于軟籽石榴和硬籽石榴。隨著石榴種子發(fā)育，種子的硬度逐漸增加，并且木質(zhì)素含量的增加與種子硬度增加呈顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.939)。同時，種子硬度和木質(zhì)素含量在‘突尼斯軟籽’中始終低于‘泰山紅’，表明軟籽石榴和硬籽石榴種皮中木質(zhì)素的含量差異是影響種子硬度的重要因素，與前人的報道一致[10,17]。

研究表明，木質(zhì)素代謝途徑中相關(guān)基因在草本植物生長前期高表達可以增強植物的抗倒伏性[26-28]；在梨果實發(fā)育前期的高表達增加了木質(zhì)素的含量[29-30]。劉玉倩[29]發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素代謝途徑中大部分基因，在刺梨果實發(fā)育前期(花后40 d前)具有較高的表達水平，并且果實中木質(zhì)素單體以及木質(zhì)素含量也較為豐富。劉盼盼[30]發(fā)現(xiàn)，梨的PAL、HCT-2、HCT-3、HCT-4、4CL-2等基因在果實發(fā)育期的表達規(guī)律與果肉中木質(zhì)素含量的變化規(guī)律相似，呈先升高后降低的趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著石榴種子發(fā)育，木質(zhì)素代謝途徑的12個關(guān)鍵基因在2個籽粒硬度不同的石榴品種中，表達趨勢存在明顯差異。在‘泰山紅’種子發(fā)育前期(盛花期后30和45 d)，12個基因中有8個基因，即PgPAL、Pg4CL、PgCCR、PgLAC、PgC3H、PgHCT、PgCOMT、PgCCOMT在硬籽石榴‘泰山紅’中的表達量明顯高于‘突尼斯軟籽’石榴，盡管在盛花期后70和120 d，這8個基因雖然在‘突尼斯軟籽’石榴中的表達量明顯高于‘泰山紅’，但‘泰山紅’的種子硬度和木質(zhì)素含量始終顯著高于‘突尼斯軟籽’，而且種子中木質(zhì)素前期增長量(盛花期后45 d比30 d增加7.66%)高于后期增長量(盛花期后120 d比70 d增加3.27%)兩倍多，據(jù)此推測，硬籽石榴和軟籽石榴種子硬度差異主要在種子發(fā)育前期完成，并且‘泰山紅’的種子硬度形成早于‘突尼斯軟籽’。NIU等[17]在軟籽石榴種子發(fā)育的早期(盛花期后60 d)，也發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素生物合成相關(guān)的差異表達蛋白具有較低的的表達水平。因此，這8個基因在硬籽石榴和軟籽石榴中的特異性表達為從軟籽石榴中篩選籽粒較軟的基因提供了重要信息。

木質(zhì)素合成途徑十分復雜。本研究從‘泰山紅’和‘突尼斯軟籽’成熟種子的木質(zhì)素代謝途徑中確定了11種代謝物。其中，‘突尼斯軟籽’石榴種子中對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、松柏醇的含量顯著高于硬籽石榴‘泰山紅’。因此，這4種代謝物在‘突尼斯軟籽’種子中顯著富集，可能是導致種子硬度低，木質(zhì)素含量低的關(guān)鍵物質(zhì)。而且，硬籽石榴‘泰山紅’中芥子醇的合成前體物質(zhì)芥子醛顯著高于‘突尼斯軟籽’，這與QIN等[11]認為，芥子醇在硬籽石榴‘大笨子’中的累積高于‘突尼斯軟籽’結(jié)果類似。此外，‘突尼斯軟籽’成熟種子中松柏醇含量較高，松柏醇通過氧化聚合反應直接生成愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(G-木質(zhì)素)，因此，這些代謝物在不同籽粒硬度的石榴種子中的累積模式有助于進一步解析木質(zhì)素生物合成機制。

有研究表明，硬籽石榴的整個種皮都出現(xiàn)木質(zhì)化，軟籽石榴籽粒種皮只有部分細胞木質(zhì)化[31-32]。根據(jù)田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，硬籽石榴‘泰山紅’的枝條比‘突尼斯軟籽’石榴的枝條硬。通過對比4個植物組織中12個木質(zhì)素代謝相關(guān)基因的表達水平發(fā)現(xiàn)，這些基因具有明顯的組織特異性表達，并且在石榴莖中高表達的基因，如PgPAL、PgCOMT、PgCCOMT、PgHCT，在硬籽石榴‘泰山紅’中的表達水平明顯高于‘突尼斯軟籽’石榴。因此,這4個基因可能潛在地影響石榴枝條木質(zhì)化程度，是枝條硬度形成的關(guān)鍵候選基因。

木質(zhì)素是植物體內(nèi)一種重要的有機物質(zhì)，木質(zhì)素的含量及組成對鮮食石榴的果實品質(zhì)有重要影響。本研究通過對比分析在軟籽和硬籽石榴的種子發(fā)育期，木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵基因的表達特性和成熟種子中代謝物富集差異，豐富并完善了石榴種子硬度形成機制，為從木質(zhì)素合成領(lǐng)域改良石榴果實品質(zhì)提供了基因資源。