李晴晴 霍瑩瑩 楊 靜 李甜甜 徐福榮 董 鮮

(云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

當(dāng)植物遭遇病原菌侵襲時(shí)，活性氧(reactive oxygen species, ROS)累積，以及防御系統(tǒng)啟動(dòng)，防御系統(tǒng)包括酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)[6]。非酶促系統(tǒng)主要通過(guò)合成一些次生代謝產(chǎn)物，如酚類、木質(zhì)素、植保素等來(lái)抵抗病原菌[7]。酶系統(tǒng)中，起重要作用的有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)，上述酶類參與ROS的清除，以及酚類、木質(zhì)素和植保素等抗病相關(guān)物質(zhì)的合成[8]，能有效抵御ROS對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抵抗能力。

研究表明不同氮素形態(tài)對(duì)植物防御系統(tǒng)的影響有差異[6,9-10]，對(duì)植物的生長(zhǎng)也有不同的影響。適宜的銨硝配比能夠增加植物的抗病性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加生物量以及次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積[11-13]。

目前三七種植過(guò)程中根腐病發(fā)生嚴(yán)重，而氮肥施用對(duì)三七根腐病影響的相關(guān)研究較少。因此，本試驗(yàn)就不同氮素形態(tài)配比及病原菌侵染對(duì)三七產(chǎn)量、有效成分以及抗性指標(biāo)的影響展開(kāi)研究，以期探索出科學(xué)的氮肥運(yùn)籌模式，為三七根腐病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三七：健康一年生三七子條由文山景源農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。

菌株：尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省道地瀕危中藥材繁育與栽培工程技術(shù)研究中心保存菌株。

試劑：三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd(對(duì)照品，純度均為HPLC≥98%)，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈(均為色譜純)，購(gòu)于德國(guó)Meker公司；植物可溶性糖含量檢測(cè)試劑盒、植物類黃酮含量檢測(cè)試劑盒、SOD試劑盒、POD試劑盒、PPO試劑盒和PAL試劑盒、植物總酚(total phenols, TP)含量檢測(cè)試劑盒、木質(zhì)素含量檢測(cè)試劑盒和過(guò)氧化氫(H2O2)含量檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)：去皮馬鈴薯20 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

Bilay’s培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1 g，氯化鉀0.5 g，硝酸鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，淀粉0.2 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3 孢子懸浮液的制備以及病原菌的侵染 用無(wú)菌水將PDA培養(yǎng)基上的尖孢鐮刀菌沖洗下來(lái)，經(jīng)過(guò)濾用無(wú)紡布Miracloth(Millipore)濾掉菌絲，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板調(diào)成所需濃度的孢子懸浮液(1 × 107個(gè)·mL-1)， 備用。不同氮素形態(tài)配比營(yíng)養(yǎng)液處理三七兩周后，7月5日三七接種尖孢鐮刀菌，用注射器將制備好的孢子懸浮液注入三七根部的基質(zhì)中，每株注射4 mL，未接菌組注入等量無(wú)菌水。此時(shí)總氮含量為2 mmol·L-1， 試驗(yàn)共10個(gè)處理，即：

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.4.1 尖孢鐮刀菌菌落直徑和孢子濃度的測(cè)定 在PDA培養(yǎng)基中分別加入總氮含量為2 mmol·L-1的5種不同氮素形態(tài)配比溶液。接種后連續(xù)7 d采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

在Bilay’s培養(yǎng)基中分別加入總氮含量2 mmol·L-1的5種不同氮素形態(tài)配比溶液。滅菌后加入等量的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液，放于搖床上，180 r·min-1、28℃恒溫震蕩培養(yǎng)7 d，采用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

1.4.2 葉綠素含量的測(cè)定和病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì) 氮素處理54 d后，植株采集前使用SPAD-502葉綠素含量測(cè)定儀(Konica Minoita, 日本)測(cè)定各處理兩年生三七的葉綠素含量并統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，根據(jù)三七病害的發(fā)展將發(fā)病程度分為0～4個(gè)等級(jí)：

0級(jí)：三七植株生長(zhǎng)健康；

1級(jí)：三七葉端出現(xiàn)病斑；

2級(jí)：植株出現(xiàn)枯黃葉片<50%；

3級(jí)：植株出現(xiàn)枯黃葉片>50%；

4級(jí)：植株死亡。

按照公式計(jì)算病情指數(shù)(disease index，Di)：

Di=∑[(Dn×Dg)/(Tn×Mg)]×100

(1)

式中，Dn表示同一病情等級(jí)的植株數(shù)目，Dg表示相應(yīng)的病情等級(jí)，Tn表示總植株數(shù)目，Mg表示最高病情等級(jí)。

1.4.3 生物量的測(cè)定 氮素處理54 d后進(jìn)行植株的采集，帶回實(shí)驗(yàn)室，洗凈、擦干水分后將其分為地上部分和地下部分，稱重。一部分經(jīng)液氮冷凍后放于-80℃ 冰箱，備用。另一部分置于40℃烘箱中烘干，稱定干重，銅銃粉碎，過(guò)65目篩，放于干燥器中，備用，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

1.4.4 皂苷含量的測(cè)定

1.4.4.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1和Rd四個(gè)對(duì)照品，甲醇定容至10 mL，配制成以上單體皂苷濃度分別為0.968、1.824、1.758和1.049 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，之后將其逐級(jí)稀釋，共8個(gè)濃度。

1.4.4.2 供試品溶液的制備 精密稱定三七地下部分粉末0.1 g，置于試管中，精密加入3 mL甲醇，封口，常溫超聲提取1h(40 kHz，300 W)，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，所得續(xù)濾液即為供試品溶液。

1.4.4.3 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，色譜條件參考《中華人民共和國(guó)藥典》[1]。流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，洗脫程序：0 min，19% A；12 min，19% A；60 min，36% A；77 min，36% A，之后回到初始濃度，保持10 min。流速為0.6 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。

1.4.5 可溶性糖和黃酮含量的測(cè)定 取保存于-80℃ 冰箱內(nèi)的三七地下部分鮮樣，液氮研磨后使用植物可溶性糖含量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。取三七地下部分粉樣，使用植物類黃酮含量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

1.4.6 三七防御酶活性的測(cè)定 取三七地上部分鮮樣，液氮研磨后使用SOD、POD、PPO和PAL活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

1.4.7 酚類和木質(zhì)素含量的測(cè)定 取三七地上部分粉樣，分別使用TP含量檢測(cè)試劑盒和木質(zhì)素含量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

1.4.8 H2O2含量的測(cè)定 取三七地上部分鮮樣，液氮研磨后，使用H2O2含量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS Statistic 19.00軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，使用Origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮素形態(tài)配比對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的影響

注：A：培養(yǎng)第7天菌落生長(zhǎng)情況；B：培養(yǎng)7天菌落生長(zhǎng)曲線。下同。Note: A: Colony growth on the seventh day of culture. B: Colony growth curve within seven days. A: N: The same as following.圖1 不同氮素形態(tài)配比對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of different nitrogen forms on the growth of F. oxysporum

表1 不同氮素形態(tài)配比對(duì)尖孢鐮刀菌第7天菌落直徑和孢子數(shù)量的影響Table 1 Effect of different nitrogen forms on colony diameter and spore content of F. oxysporum on the seventh day

2.2 不同氮素形態(tài)配比及病原菌侵染對(duì)三七生長(zhǎng)的影響

圖2 不同氮素形態(tài)配比及病原菌侵染對(duì)三七生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of different nitrogen forms and pathogen infection on the growth of P. notogensing

表2 不同氮素形態(tài)配比及病原菌侵染對(duì)兩年生三七生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of different nitrogen forms and pathogen infection on the growth of two-years P. notogensing

2.3 不同氮素形態(tài)配比及病原菌侵染對(duì)三七中皂苷含量的影響

注：1：三七皂苷R1； 2：人參皂苷Rg1；3：人參皂苷Rb1；4：人參皂苷Rd。Note: 1: Notoginsenoside R1. 2: Ginsenoside Rg1. 3: Ginsenoside Rb1. 4: Ginsenoside Rd.圖3 皂苷對(duì)照品(A)和三七樣品(B)HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of saponins reference substance (A) and P. notoginseng (B)

表3 不同氮素形態(tài)配比以及病原菌侵染對(duì)兩年生三七皂苷含量的影響Table 3 Effect of different nitrogen forms and pathogen infection on the content of saponins /(mg·g-1)

2.4 不同氮素形態(tài)配比及病原菌侵染對(duì)三七可溶性糖和黃酮含量的影響

注：不同字母表示不同處理間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。下同。Note: Different letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖4 不同氮素形態(tài)配比以及病原菌侵染對(duì)兩年生三七可溶性糖(A)和黃酮(B)含量的影響Fig.4 Effect of different nitrogen forms and pathogen infection on the contents of soluble sugar(A)and flavonoids(B)

2.5 不同氮素形態(tài)配比及病原菌侵染對(duì)防御酶的影響

圖5 不同氮素形態(tài)配比對(duì)兩年生三七抗病防御酶活性的影響Fig.5 Effects of different nitrogen forms and pathogen infection on the activity of anti-disease defensive enzymes

2.6 不同氮素形態(tài)配比及病原菌侵染對(duì)酚類和木質(zhì)素含量的影響

未接菌組酚類及木質(zhì)素平均含量分別為3.70 mg·g-1和188.74 mg·g-1，不同氮素配比處理含量無(wú)顯著性差異(圖6-A、B)。病原菌侵染使兩者含量均增加，此時(shí)酚類和木質(zhì)素平均含量分別為3.95 mg·g-1和217.00 mg·g-1，當(dāng)銨硝配比為25∶75時(shí)，二者升高幅度均達(dá)到最大。

圖6 不同氮素形態(tài)配比及病原菌侵染對(duì)酚類和可溶性糖含量的影響Fig.6 Effect of different nitrogen forms and pathogen infection on the contents of phenols and lignin

2.7 不同氮素形態(tài)配比及病原菌侵染對(duì)H2O2含量的影響

未接菌組H2O2平均含量為7.12 μmoL·g-1，接菌組平均含量為7.13 μmoL·g-1。不同氮素形態(tài)配比間H2O2含量無(wú)差異，病原菌侵染對(duì)H2O2含量無(wú)明顯影響(圖7)。

圖7 不同氮素形態(tài)配比及病原菌侵染對(duì)對(duì)H2O2含量的影響Fig.7 Effect of different nitrogen forms and pathogen infection on the content of H2O2

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4 結(jié)論