王新悅 朱成磊 楊克彬 李廣柱 李 真 袁婷婷 高志民

(國(guó)際竹藤中心竹藤資源基因科學(xué)與基因產(chǎn)業(yè)化研究所，國(guó)家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102)

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，是十分重要的可再生資源[1]。纖維素合成酶(cellulosesynthase, CesA)對(duì)纖維素合成起關(guān)鍵性作用，通常以CesA復(fù)合體(cellulose synthase complex, CSC)的形式發(fā)揮功能，該復(fù)合體由6個(gè)三聚體形成，而三聚體由多個(gè)CesA組成[2]，CSC在植物的纖維素合成與沉積過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。研究表明，CesA包含多個(gè)保守區(qū)域，其中D、DxD、D和QxxRW是該家族的特征結(jié)構(gòu)域[4-5]。不同物種中CSC發(fā)揮功能需要多個(gè)CesA[6]，自第一個(gè)CesA基因在棉花(Gossypiumspp.)中被確定后[7]，已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[8]、水稻(Oryzasativa)[4]和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)[9]中分別鑒定出10、11和10個(gè)CesA基因。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中AtCesA1/3/6與初生細(xì)胞壁合成相關(guān)[10]，AtCesA4/7/8與次生細(xì)胞壁相關(guān)[11]；水稻中OsCesA1/3/6與初生壁相關(guān)，OsCesA4/7/9與次生壁相關(guān)[4]，而且發(fā)現(xiàn)赤霉素可以通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與NAC29/31 結(jié)合調(diào)控OsMYB61轉(zhuǎn)錄因子，OsMYB61與OsCesA4/7/9上游啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而聯(lián)級(jí)調(diào)控次生壁纖維素的合成[12]。

竹子具有生長(zhǎng)快、材性好等特點(diǎn)，在緩解我國(guó)木材供給壓力方面發(fā)揮著重要作用。纖維素是竹材的主要成分，CesA基因的表達(dá)水平直接影響到纖維素的含量和品質(zhì)，從而影響竹材材性[13]。因此，研究CesA基因的分子特征及其表達(dá)調(diào)控對(duì)竹子的開(kāi)發(fā)利用具有重要價(jià)值。初步研究表明，毛竹(Phyllostachysedulis)各組織纖維素的含量與CesA基因表達(dá)量有一定的關(guān)聯(lián)[14]，筍中纖維素含量隨基因表達(dá)量上升而增加[15]，并預(yù)測(cè)PeCesA6/9/13對(duì)初生壁和次生壁的形成均起到重要作用，而PeCesA1/2/3/4/5主要參與次生壁的合成[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)巨龍竹(Dendrocalamussinicus)中2個(gè)CesA基因與初生壁纖維素生物合成有關(guān)[17]。雖然在毛竹基因組草圖中鑒定了19個(gè)PeCesAs[18]，并對(duì)其中16個(gè)進(jìn)行了定量分析[19]，但其功能尚未被深入研究，尤其在表達(dá)調(diào)控方面更是空白。染色體水平毛竹基因組的發(fā)布[20]為更全面研究其中的CesA提供了組學(xué)數(shù)據(jù)。本研究在對(duì)毛竹CesA基因家族成員全基因組鑒定的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因表達(dá)模式篩選出與次生壁纖維素合成相關(guān)的CesA基因及MYB轉(zhuǎn)錄因子，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和酵母單雜交技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為揭示竹子纖維素生物合成與調(diào)控分子機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以江西省林科院實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)的毛竹為對(duì)象，采集不同高度筍(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0 m)的代表性節(jié)間(第15節(jié))，每種樣品平均隨機(jī)取3株，液氮速凍后存于-80℃冰箱，用于研究CesA與MYB在不同高度筍中的表達(dá)模式。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 毛竹CesA基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析 通過(guò)PLAZA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)下載水稻、二穗短柄草和擬南芥的CesA氨基酸序列，利用TBtools基于毛竹基因組數(shù)據(jù)[21]查找CesA同源序列，在Pfam(http://pfam.xfam.org/)網(wǎng)站利用CesA蛋白查找保守結(jié)構(gòu)域[22]，再運(yùn)用Smart BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/smartblast/?LINK_LOC=BlastHomeLink#)進(jìn)一步對(duì)候選基因進(jìn)行逐條比對(duì)分析，保留保守結(jié)構(gòu)域完整的基因，根據(jù)上述基因在Scaffold上的位置順序進(jìn)行命名。采用在線(xiàn)工具Softberry(http://linux1.softberry.com/all.htm)分析CesA的基本理化性質(zhì)。

1.2.2 毛竹CesA基因的生物信息學(xué)分析 通過(guò)TBtools中BLASTP程序?qū)γ癜被嵝蛄羞M(jìn)行雙向比對(duì)，閾值E<10-5，獲得共線(xiàn)性基因?qū)23]，通過(guò)TBtools內(nèi)置的MCScanX程序?qū)γ襁M(jìn)行物種內(nèi)的CesA共線(xiàn)性結(jié)果進(jìn)行可視化展示[24]。并計(jì)算基因?qū)χg的同義(Ks)和非同義(Ka)核苷酸替換率[25]。用TBtools軟件分析毛竹CesA的基因結(jié)構(gòu)；用在線(xiàn)軟件MEME(http://meme.nbcr.-net/meme/intro.html)分析毛竹CesA的蛋白保守基序，利用Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)毛竹CesA的亞細(xì)胞定位。利用MEGA7.0內(nèi)置的MUSCLE程序?qū)γ?、水稻、擬南芥和二穗短柄草的CesA氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并采用鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(使用系統(tǒng)默認(rèn)值，其中校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap值設(shè)置為重復(fù)1 000 次)[26]，模型為Poisson model[27]，序列中缺失位點(diǎn)選擇完全刪除，根據(jù)擬南芥[10-11]與水稻[4]中報(bào)道次生壁與初生壁相關(guān)的基因?qū)M(jìn)化樹(shù)的分支進(jìn)行分類(lèi)。

1.2.3 毛竹CesA基因表達(dá)模式分析 利用NCBI下載的毛竹26個(gè)組織/發(fā)育階段(鞭、筍、根、葉片、葉鞘和筍芽)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(登錄號(hào)：SRX2408703～SRX2408728)[20]，篩選其中CesA基因的FPKM值，并取對(duì)數(shù)Log2(FPKM+1)作為基因的表達(dá)量，利用TBtools軟件中最長(zhǎng)距離法與層次聚類(lèi)法繪制表達(dá)譜熱圖，并利用基迪奧生物網(wǎng)站(https://www.omicshare.com/tools/) spearman系數(shù)繪制相關(guān)性分析圖。利用BambooNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinformatics.cau.edu.cn/bamboo/)中Mutual rank與Pearson correlation coefficient(PCC)系數(shù)查找與毛竹CesA基因具有共表達(dá)關(guān)系的基因，于基迪奧生物網(wǎng)站繪制共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4 毛竹CesA基因在不同高度筍中的表達(dá)模式分析 根據(jù)毛竹CesA基因序列設(shè)計(jì)的特異性定量引物，由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成(表1)。采用TRIzol法(Promega, 美國(guó), Z3101)提取毛竹各樣品的總RNA，用DNase Ⅰ (TaKaRa, 日本, 2270A)除去基因組DNA后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, 美國(guó), A5003)合成cDNA。使用qTOWER熒光定量PCR儀(Analytikjena, 德國(guó), qTOWER 2.2)，體系參照Roche Light Cycler?480 SYBR Green 1 Master kit試劑盒(Roche, 中國(guó), 4707516001)，程序：95℃預(yù)變性6 min；95℃變性10 s，62℃退火10 s，45個(gè)循環(huán)[28]。以PeTIP41為內(nèi)參基因[29]，3次生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法[30]分析基因的相對(duì)表達(dá)量，利用IBM SPSS 26.0對(duì)3個(gè)技術(shù)重復(fù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行繪圖。

1.2.5 酵母單雜交分析 根據(jù)PeMYB35(PH02Gene26889)的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(coding sequence, CDS)序列和PeCesA1啟動(dòng)子的PeCesA1pro序列，設(shè)計(jì)添加載體構(gòu)建所需酶切位點(diǎn)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(20 μL)如下：PCR Buffer 2.0 μL，5′寡核苷酸 9.0 μL，3′寡核苷酸 9.0 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，72℃ 2 min，37℃ 2 min，25℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)。分別使用SmaI酶、EcoRI酶和SacI酶進(jìn)行酶切，將PeMYB35的CDS序列和PeCesA1pro分別連接到表達(dá)載體pGADT7-Rec2 和pHis2的多克隆位點(diǎn)，將測(cè)序正確的質(zhì)粒分別命名為pGADT7-Rec2-MYB35和pHis2-PeCesA1pro。另外，根據(jù)PeCesA1pro中3個(gè)GAMYB元件(CAACCTAC、CAACCCAA和CAACCAAC)分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增；同時(shí)利用EcoRI和SacI酶對(duì)pHis2載體進(jìn)行酶切，對(duì)PCR產(chǎn)物與膠回收產(chǎn)物進(jìn)行連接。連接體系：10×T4 Ligase 1.0 μL，T4 DNA連接酶 1.0 μL，pHis2 4.0 μL，元件PCR產(chǎn)物 4.0 μL，16℃過(guò)夜連接。將測(cè)序正確的質(zhì)粒分別命名為pHis2-Y1、pHis2-Y2和pHis2-Y3。

將構(gòu)建好的pHis2-PeCesA1pro、pHis2-Y1、pHis2-Y2 和pHis2-Y3質(zhì)粒分別與pGADT7-Rec2-MYB35共轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞(Y187)中，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性(p53His2+pGADT7-Rec2-53)和陰性(p53His2+pGADT7-Rec2-MYB35)對(duì)照，將共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的酵母菌液分別涂布在DDO (-Leu/-Trp)篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選后在含有3-AT (20 mmol·L-1)的TDO (-His/-Leu/-Trp) 平板培養(yǎng)2～3 d[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹CesA基因家族成員的鑒定與進(jìn)化分析

利用擬南芥和水稻的同源基因序列，在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析，共鑒定獲得21個(gè)CesA基因，分布在11個(gè)基本骨架(Scaffold)上，其中Scaffold14上有4個(gè)基因，Scaffold4和Scaffold10上有3個(gè)基因，其他Scaffold上有1～2個(gè)基因，根據(jù)其在Scaffold上順序分別命名為PeCesA1～PeCesA21(圖1)。PeCesAs編碼蛋白氨基酸長(zhǎng)度為904～1 093 aa，預(yù)測(cè)分子量為101.10～123.63 kDa之間，理論等電點(diǎn)在5.95～8.60之間，大多數(shù)呈中性或堿性蛋白；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，21個(gè)PeCesAs均定位于質(zhì)膜(表2)，說(shuō)明PeCesAs可能在質(zhì)膜上行使功能。

圖1 PeCesAs的Scaffold定位和共線(xiàn)性分析Fig.1 The scaffold location and collinearity analysis of PeCesAs

共線(xiàn)性分析發(fā)現(xiàn)，有19個(gè)PeCesAs之間存在共線(xiàn)性關(guān)系，且所有基因?qū)Φ姆峭x對(duì)同義取代比(Ka/Ks)均小于1.0，說(shuō)明PeCesAs基因在進(jìn)化過(guò)程中可能經(jīng)歷了較強(qiáng)的純化選擇[32-33]。利用毛竹、水稻、擬南芥和二穗短柄草的52個(gè)CesA的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，所有CesAs被聚類(lèi)在7個(gè)分支，在各分支中多數(shù)PeCesAs與二穗短柄草及水稻的CesA聚類(lèi)在一起，與擬南芥的CesA較遠(yuǎn)(圖2)。另外，研究發(fā)現(xiàn)水稻中OsCesA4/7/9以及擬南芥中AtCesA4/7/8主要參與次生細(xì)胞壁纖維素的合成，PeCesA1/5/10/11/17與OsCesA4/7/9和AtCesA4/7/8聚類(lèi)在較近的分支，因此推測(cè)上述編碼蛋白在毛竹次生細(xì)胞壁纖維素合成中可能具有相似的功能。

注：Pe、Os、At和Bd分別代表毛竹、水稻、擬南芥和二穗短柄草。Note: Pe, Os, At and Bd indicate Phyllostachys edulis, Oryza sativa, Arabidopsis thaliana and Brachypodium distachyon, respectively.圖2 基于不同植物CesA家族成員構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree constructed on the base of CesA family members in different plant species

2.2 PeCesAs基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的保守基序

基因結(jié)構(gòu)分析表明，21個(gè)PeCesAs具有8～14個(gè)內(nèi)含子(圖3)，9～15個(gè)外顯子，其中具有14個(gè)外顯子的基因有11個(gè)，13個(gè)外顯子的基因有5個(gè)，15與9個(gè)外顯子的基因分別有2個(gè)，12個(gè)外顯子的基因只有1個(gè)(PeCesA1)，PeCesA18比PeCesA14多1個(gè)外顯子與1個(gè)內(nèi)含子。各基因之間的差異除了外顯子的數(shù)量外，還表現(xiàn)在內(nèi)含子的位置差異，由此推測(cè)這些差異可能會(huì)導(dǎo)致基因功能不同。

圖3 PeCesAs基因結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Gene structure analysis of PeCesAs

蛋白保守基序分析表明，在PeCesAs中共鑒定出20個(gè)保守基序，其中4個(gè)纖維素合成酶家族特征性保守結(jié)構(gòu)域(DD、DCD、ED和QVLRW)分別分布在Motif 6、Motif 10、Motif 13和Motif 14中[34]。Motif 1、Motif 2～Motif 15為所有成員共有的保守基序；Motif 20為PeCesA1/4/6/7/14/15/18/19/21共同缺失的保守基序；此外，PeCesA7/14還缺少M(fèi)otif 16～Motif 20；PeCesA16缺少M(fèi)otif 19 (圖4)。

圖4 PeCesAs保守基序分析Fig.4 Conserved motif analysis of PeCesAs

2.3 PeCesAs組織特異性表達(dá)分析

基于毛竹26個(gè)組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，21個(gè)PeCesAs在毛竹不同組織以及同一組織不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)模式均存在著一定差異(圖5)。所有PeCesAs在各個(gè)組織中均檢測(cè)到表達(dá)，每個(gè)組織中各成員的表達(dá)量各不相同，說(shuō)明其可能不同程度地參與毛竹不同組織的纖維素合成。表達(dá)量相似的基因被聚類(lèi)在同一分支，如PeCesA3/6/7/8/9/19在毛竹根和筍的中部和基部表達(dá)量均較高，在葉片和筍的尖部表達(dá)量極低；而PeCesA12/13在所有組織中表達(dá)量均極低；PeCesA2/14/16/18/20在大部分組織中均表達(dá)，其中5個(gè)PeCesAs (PeCesA1/5/10/11/17)在筍的中部和基部的表達(dá)量隨著筍高度增加而上升，在3.0 m筍中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他高度的筍。因此，推測(cè)這些PeCesAs在毛竹筍的纖維素合成過(guò)程中發(fā)揮著更為重要的作用。

圖5 PeCesAs在不同組織中的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of PeCesAs in different tissues

2.4 PeCesAs與PeMYBs相關(guān)分析

通過(guò)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PeMYB35 (PH02Gene26889)和PeMYB37 (PH02Gene12586)與5個(gè)PeCesAs (PeCesA1/5/10/11/17)存在較強(qiáng)的共表達(dá)關(guān)系(圖6-A)。利用毛竹不同高度筍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析PeMYBs與PeCesAs表達(dá)量的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)2個(gè)PeMYBs與5個(gè)PeCesAs均具有極強(qiáng)相關(guān)性(PCC>0.8) (圖6-B)，其中PeMYB35較PeMYB37與PeCesAs的相關(guān)性更強(qiáng)。對(duì)PeCesAs的上游啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，PeCesA1/5/10/11/17的啟動(dòng)子中均包含GAMYB (CAACCNNN)元件(圖6-C)。在水稻中已證明MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠與GAMYB結(jié)合，調(diào)控CesA的表達(dá)[12]。因此，推測(cè)PeMYB35和PeMYB37可能通過(guò)與PeCesA1/5/10/11/17啟動(dòng)子中的GAMYB結(jié)合來(lái)調(diào)控毛竹纖維素的合成。

注：A：PeCesAs與PeMYB35共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)；B：PeCesAs與PeMYB35在不同高度筍中表達(dá)量相關(guān)性分析；C：PeCesAs啟動(dòng)子中的GAMYB元件分析。Note: A: Co-expression network prediction of PeCesAs and PeMYB35. B: Correlation analysis of PeCesAs and PeMYB35 expression in different height shoots. C: GAMYB in the promoters of PeCesAs.圖6 PeCesAs與PeMYB35關(guān)系圖Fig.6 The relationship diagram of PeCesAs and PeMYB35

2.5 PeMYB35與PeCesAs調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證

為驗(yàn)證PeMYB35與5個(gè)PeCesAs的調(diào)控關(guān)系，采用qRT-PCR方法檢測(cè)PeMYB35和PeCesA1/5/10/11/17在不同高度筍中的表達(dá)模式。圖7結(jié)果顯示，隨著筍高度的增加，PeMYB35和5個(gè)PeCesAs基本呈現(xiàn)相似表達(dá)趨勢(shì)，即不同程度地先下降后上升再下降，該趨勢(shì)與圖5相似，在圖7-A中均在6.0 m高筍中的表達(dá)量達(dá)到最高值，之后有所下降。另外，酵母單雜交結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照(p53His2+pGADT7-Rec2-53)和pHis2-PeCesA1pro+pGADT7-Rec2-MYB35、pHis2-Y1+pGADT7-Rec2-MYB35、pHis2-Y2+pGADT7-Rec2-MYB35和pHis2-Y3+pGADT7-Rec2-MYB35能夠在TDO/3-AT培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而陰性對(duì)照(p53His2+pGADT7-Rec2-MYB35)不能正常生長(zhǎng)(圖7-B)。由此說(shuō)明，PeMYB35能夠與PeCesA1啟動(dòng)子中3個(gè)不同的GAMYB相結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。

注：A：筍中PeMYB35和PeCesAs的表達(dá)定量分析；*和**分別表示其他高度筍中基因相對(duì)表達(dá)量與0.5 m筍中的差異顯著性水平為P<0.05和P<0.01。B：PeMYB35與PeCesA1pro共轉(zhuǎn)化酵母。Note: A: Expression analysis of PeMYB35 and PeCesAs in shoots with different heights. *, ** indicate significant differences at 0.05 and 0.01 level respectively between the relative expression in higher shoots and that in 0.5 m shoots. B: Co-transformation of yeast with PeMYB35 and PeCesA1pro.圖7 PeMYB35與PeCesAs調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證Fig.7 Verification of the regulatory relationship between PeMYB35 and PeCesAs

3 討論

纖維素含量嚴(yán)重影響著竹子的生長(zhǎng)與竹材材性，且影響采后竹筍的品質(zhì)[35]。CesA的表達(dá)是影響纖維素生物合成的關(guān)鍵因素。隨著越來(lái)越多物種中CesA基因家族的結(jié)構(gòu)特征、基因功能驗(yàn)證及轉(zhuǎn)錄調(diào)控被研究報(bào)道，竹子中CesA的研究倍受重視[36]。對(duì)毛竹中CesA基因的結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)模式，以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行分析，對(duì)于揭示CesA基因在竹材形成過(guò)程中的作用具有重要的參考價(jià)值。本研究從毛竹中鑒定出21個(gè)CesA家族成員，與Peng等[18]的鑒定結(jié)果相似，其具有的保守結(jié)構(gòu)域是纖維素合成的催化位點(diǎn)[37]。CesA家族基因的數(shù)量是擬南芥、水稻等二倍體物種的2倍左右，這可能與毛竹為異源四倍體有關(guān)[38]。本研究系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，PeCesAs聚類(lèi)在7個(gè)分支上，與共線(xiàn)性分析結(jié)果相一致，呈現(xiàn)共線(xiàn)性的蛋白被聚類(lèi)在同一個(gè)分支上，多數(shù)PeCesAs與水稻和二穗短柄草的CesA聚類(lèi)到較近的分支，這與毛竹、水稻和二穗短柄草親緣關(guān)系較近的前人研究結(jié)果相一致[28]。

纖維素是細(xì)胞壁的重要組成部分，21個(gè)PeCesAs在毛竹26個(gè)不同組織中均檢測(cè)到表達(dá)，在筍和根中表達(dá)量較高，該結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[18]，但本研究在芽和鞭中也檢測(cè)到了表達(dá)，這可能是取樣與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的差異造成的。此外CesA基因的表達(dá)具有傾向性，如白花泡桐中PfCesA4在莖中的表達(dá)量最高[39]，CiCesA3則在中間錦雞兒的葉中表達(dá)量最高[40]，毛白楊的PtoCesA4/7/8/17/18在木質(zhì)部中高豐度表達(dá)[41]。不同的PeCesAs在不同組織中的表達(dá)豐度差異明顯，表明各基因成員的功能存在一定的差異。除了PeCesA12和PeCesA13在所有組織中表達(dá)較低外，其他多數(shù)PeCesAs均在次生壁木質(zhì)化程度較高的鞭、根和筍(1.5、3.0和6.0 m)中表達(dá)豐度較高，表明這些PeCesAs的表達(dá)與毛竹細(xì)胞次生壁形成相關(guān)，與前人研究結(jié)果一致[4]。RNA-Seq數(shù)據(jù)分析結(jié)合qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)PeCesA1/5/10/11/17主要在1.5、3.0和6.0 m筍中表達(dá)，且分別是OsCesA4/7/9[4]和AtCesA4/7/8[11]的同源基因，推測(cè)該基因可能在毛竹筍纖維素合成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其具體生物學(xué)功能尚需開(kāi)展深入研究。

纖維素的生物合成調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，涉及多種轉(zhuǎn)錄因子，其中MYB轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控次生壁纖維素合成中發(fā)揮著重要作用。在擬南芥中，AtMYB46通過(guò)與AtCesA4/7/8的啟動(dòng)子中的M46RE元件結(jié)合，激活A(yù)tCesA4/7/8的表達(dá)，從而使纖維素含量升高[42]。在水稻中OsMYB58/63能與OsCesA7啟動(dòng)子中AC-II 和SMRE3元件結(jié)合，上調(diào)基因的表達(dá)[43]，而NAC29/31 則通過(guò)調(diào)控MYB61，MYB61再與OsCesA4/7/9 中上游啟動(dòng)子的GAMYB元件結(jié)合調(diào)控CesA的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素生物合成的調(diào)控，而SLR1和NAC29/31相互作用則會(huì)阻斷這條調(diào)控途徑[12]。在毛竹中PeMYB35和PeMYB37分別與擬南芥和水稻中的AtMYB46與OsMYB61為同源基因[44]。本研究發(fā)現(xiàn)并證明PeMYB35和PeMYB37均與5個(gè)PeCesAs (PeCesA1/5/10/11/17)之間存在共表達(dá)關(guān)系，在筍中的表達(dá)趨勢(shì)相似，表達(dá)量具有較強(qiáng)的相關(guān)性；酵母單雜交結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子PeMYB35能夠與PeCesA1的上游啟動(dòng)子中的MYB元件結(jié)合發(fā)生相互作用。由此推測(cè)，PeMYB35和PeMYB37可能通過(guò)調(diào)控PeCesAs (PeCesA1/5/10/11/17)的表達(dá)來(lái)參與毛竹纖維素的生物合成，但具體的調(diào)控分子機(jī)制以及對(duì)纖維素含量的影響尚需要通過(guò)進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究從毛竹中鑒定了21個(gè)CesA基因家族成員(PeCesA1～PeCesA21)，轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析揭示出不同PeCesAs在毛竹不同組織與筍的不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)存在明顯差異，表明上述基因功能具有一定的差異性。不同高度筍的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜和qRT-PCR結(jié)果均證實(shí)PeMYB35與PeCesA1/5/10/11/17呈現(xiàn)相似的表達(dá)趨勢(shì)，相關(guān)性極強(qiáng)(PCC>0.8)，且發(fā)現(xiàn)PeCesA1/5/10/11/17的上游啟動(dòng)子均含有MYB結(jié)合位點(diǎn)GAMYB，表明MYB可能通過(guò)與PeCesAs啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)調(diào)控其表達(dá)，PeMYB35與PeCesA1pro共轉(zhuǎn)化酵母的結(jié)果證明了這一推測(cè)。