毛仁燕 蔣倩倩 李永才 畢 陽(yáng) 劉勇翔 黃 怡 張 苗

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

鏈格孢菌(Alternariaalternata)作為典型的潛伏性侵染真菌[1]，是梨果采后主要致腐病原物之一[2]，其侵染后不僅會(huì)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)其作為病原物產(chǎn)生的毒素等代謝產(chǎn)物還會(huì)引起食品安全隱患[3-4]。深入了解A.alternata與果實(shí)的互作機(jī)制，對(duì)開發(fā)有效的病害防控措施具有至關(guān)重要的意義。病原真菌通過(guò)感知和響應(yīng)宿主表面疏水性和表皮蠟質(zhì)組分等物化信號(hào)進(jìn)而啟動(dòng)侵染，并在侵染過(guò)程中形成侵染結(jié)構(gòu)，在病原菌識(shí)別外界信號(hào)的過(guò)程中，涉及眾多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如cAMP(cyclic adenosine monophosphate)、MAPK(mitogen-activated protein kinase)及Ca2+途徑等[5]。其中，cAMP-PKA(cAMP-protein kinase A)信號(hào)傳導(dǎo)途徑在真菌致病調(diào)控中至關(guān)重要，該途徑通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP的細(xì)胞內(nèi)水平來(lái)調(diào)節(jié)真菌病原體的形態(tài)發(fā)生和發(fā)病機(jī)制[6-7]。細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平取決于其合成和降解相關(guān)酶的活性和基因表達(dá)，其中磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)可通過(guò)降解cAMP進(jìn)而維持胞內(nèi)cAMP平衡。PDE共有11個(gè)家族，其家族催化域的氨基酸序列僅有25%～35%的相似性，但都具有共同的結(jié)構(gòu)特征。如PDE所有催化域包含3個(gè)最多由16個(gè)螺旋組成的亞結(jié)構(gòu)，這些螺旋中的活性位點(diǎn)由高度保守的氨基酸殘基組成[8]。其次，與金屬鋅結(jié)合的位點(diǎn)包含2個(gè)組氨酸和2個(gè)天冬氨酸殘基，這些殘基屬于磷酸二酯酶超家族HD結(jié)構(gòu)的一部分，在目前已知的PDE中是絕對(duì)保守的[9]。在真菌中，PDE被劃分為低親和力磷酸二酯酶PDEL和高親和力磷酸二酯酶PDEH，盡管不同真菌之間的序列相似性較低，但均具有保守特征序列[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，在玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)[13]和柑橘褐斑病菌(Alternariaalternata)[14]中，PDEH和PDEL均具有典型的Ⅰ型和Ⅱ型催化結(jié)構(gòu)域，但兩種酶在致病性調(diào)控方面存在相反的結(jié)果。因此，了解AaPDE基因結(jié)構(gòu)的特異性對(duì)闡明其調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

PDE的主要功能是特異性催化cAMP/cGMP 3′,5′環(huán)磷酸的3′環(huán)磷酸鍵水解，進(jìn)而調(diào)節(jié)胞內(nèi)cAMP的水平。PDEH在真菌、哺乳動(dòng)物等多種生物中均有表達(dá)并表現(xiàn)出重要的調(diào)控作用[15]。相比之下，對(duì)PDEL的研究仍不夠系統(tǒng)，但已在多種生物，如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[15]、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)[16]、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)[17]和新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)中發(fā)現(xiàn)PDEL[18]。在S.cerevisiae中，ScPDEH在調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)感知、假菌絲分化、細(xì)胞周期進(jìn)程和應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用[19]，ScPDEL并不直接調(diào)控cAMP水平，只在葡萄糖存在的條件下負(fù)責(zé)調(diào)控cAMP水平[20]。在黃曲霉(Aspergillusflavus)中，AfPDEH對(duì)黃曲霉菌的生長(zhǎng)和毒素合成具有重要調(diào)控作用，而AfPDEL對(duì)其作用較弱[21]。在模式真菌稻瘟病菌中，MoPDEH在產(chǎn)孢量、致病性和細(xì)胞內(nèi)cAMP水平調(diào)節(jié)中均起主要作用，而MoPDEL無(wú)明顯作用[22]。在人類病原體白色念珠菌(Candidaalbicans)中，CaPDEH通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平來(lái)控制發(fā)育和毒性[23]?？梢奝DE的功能因病原物而異，具體調(diào)控機(jī)制尚需全面系統(tǒng)揭示。

本研究前期通過(guò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)cAMP-PKA信號(hào)途徑與梨果表皮物化信號(hào)誘導(dǎo)A.alternata侵染結(jié)構(gòu)分化有關(guān)[24]，并對(duì)該途徑的催化亞基AaPKAc進(jìn)行了功能研究，進(jìn)一步證實(shí)了cAMP-PKA信號(hào)途徑調(diào)控A.alternata菌絲生長(zhǎng)、生物量、致病性和毒素產(chǎn)生[25]。為進(jìn)一步探究梨果黑斑病菌cAMP-PKA途徑中對(duì)cAMP水平具有重要調(diào)控作用的PDE的生物功能，本研究克隆PDEL和PDEH基因，利用生物信息學(xué)的方法對(duì)其編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征及分子進(jìn)化等方面進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。此外，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)研究PDEL和PDEH在梨果黑斑病菌侵染結(jié)構(gòu)分化過(guò)程中的表達(dá)特性，以期為進(jìn)一步從分子水平揭示其調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

梨果黑斑病病菌A.alternata菌株(KY397985.1)分離自梨果的黑斑病部，經(jīng)過(guò)分離純化后備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 梨果黑斑病菌A.alternata基因組DNA及RNA的提取 取培養(yǎng)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)中5 d(28℃)的A.alternata新鮮菌絲0.1 g于研缽中，液氮研磨后使用DNA提取試劑盒E.Z.N.A.?HP Fungal DNA Kit(Omega，美國(guó))提取，具體步驟參照產(chǎn)品說(shuō)明書。提取A.alternata總RNA時(shí)，將121℃高壓滅菌后的研缽用液氮冰浴，再將上述取得的新鮮菌絲或孢子持續(xù)利用液氮冰預(yù)研磨，將研磨好的樣品用TRNzol試劑提取，操作過(guò)程中將提取物始終保持在4℃以下，具體操作參考使用說(shuō)明書。將所得的RNA用Biospecnano型核算定量?jī)x(島津，日本)測(cè)定濃度，并檢測(cè)OD260/OD280等指標(biāo)后置于-80℃冷凍保存。將部分提取的RNA使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Code.RR047B)試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)進(jìn)行基因組gDNA消化以及第一鏈cDNA合成。

1.2.2 梨果黑斑病菌AaPDEL和AaPDEH基因克隆 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載A.alternata的磷酸二酯酶PDEL和PDEH的基因序列，利用DNAMAN 6.0設(shè)計(jì)AaPDEL和AaPDEH的擴(kuò)增引物(表1)，以梨果黑斑病菌A.alternata的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，20 μL PCR反應(yīng)體系：20 ng·μL-1cDNA 1 μL，10 μmol·L-1引物F、R各0.5 μL，2×PhantaMaxMasterMix高保真酶10 μL，ddH2O 8 μL。 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳(1%瓊脂糖)觀察條帶大小，使用全式金瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Bio-Rad,美國(guó))對(duì)符合預(yù)期大小的目的條帶切膠回收。連接PTOPO-Blunt載體并送往北京擎科測(cè)序。

表1 擴(kuò)增目的基因引物序列Table 1 Primers used for amplication of target gene

1.2.3AaPDEL和AaPDEH基因序列和編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 利用GENEDOC軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)。采用MEGA7軟件中的MUSCLE程序進(jìn)行與其他真菌物種中PDE蛋白的多重序列比對(duì)，使用鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，運(yùn)行參數(shù)如下：Bootstrap值為1 000，其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。利用在線網(wǎng)址進(jìn)行目的基因及其編碼產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)網(wǎng)址如表2所示：

表2 在線預(yù)測(cè)網(wǎng)址Table 2 Online website

1.2.4 qRT-PCR分析 用無(wú)菌水從培養(yǎng)5 d的A.alternata菌落中收集孢子，經(jīng)過(guò)4層紗布過(guò)濾得到孢子懸浮液，并利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用無(wú)菌水稀釋孢子懸浮液濃度至5×105spores·mL-1。將疏水Gelbond膜(接觸角為74.63°)剪切至蓋玻片大小(5 cm×2 cm)放置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中后在膜上滴加20 μLA.alternata的孢子懸浮液，在28℃的恒溫箱中黑暗培養(yǎng)2、4、6、8 h。用SYBR GreenⅠReal Time PCR方法檢測(cè)A.alternata中AaPDEL和AaPDEH基因分別在孢子萌發(fā)(2 h)、芽管伸長(zhǎng)(4 h)、附著胞形成(6 h)、侵染菌絲形成(8 h)階段的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。以磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)為內(nèi)參基因，PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃ 40 s (收集熒光)，40個(gè)循環(huán)。以誘導(dǎo)2 h為對(duì)照，設(shè)置3次重復(fù)。基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔCT算法。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，用Origin9.0繪制圖表，用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性分析和標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 AaPDEL和AaPDEH基因克隆

以梨果黑斑病菌A.alternata(KY397 985.1)cDNA為模板，利用特異性引物AaPDEH-F/R和AaPDEL-F/R對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小分別為2 800 bp左右和3 100 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物AaPDEH和AaPDEL(圖1)。

圖1 AaPDEH和AaPDEL基因的克隆Fig.1 Cloning of AaPDEH and AaPDEL genes

2.2 AaPDEL和AaPDEH蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 基因結(jié)構(gòu)及蛋白理化性質(zhì)分析 基因結(jié)構(gòu)及序列信息分析結(jié)果表明，AaPDEL基因全長(zhǎng)為4 923 bp，包含4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子(圖2)，共含38個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)，其蛋白編碼區(qū)(coding sequence, CDS)長(zhǎng)度為3 132 bp，共編碼1 043個(gè)氨基酸；AaPDEH基因全長(zhǎng)為3 138 bp，包含5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子(圖2)，共含22個(gè)ORF，其CDS區(qū)長(zhǎng)度為 2 886 bp， 共編碼961個(gè)氨基酸。對(duì)其編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)表明，AaPDEL分子量為114.38 kDa，化學(xué)式為C5069H7849N1397O1573S19，理論等電點(diǎn)為5.72，負(fù)電荷殘基數(shù)均大于正電荷殘基數(shù)，屬于酸性蛋白；AaPDEH分子量為105.99 kDa，C4621H7387N1339O1452S33，其等電點(diǎn)為8.16，負(fù)電荷殘基數(shù)均小于正電荷殘基數(shù)，屬于堿性蛋白；AaPDEL和AaPDEH總平均親水性均小于0，脂肪系數(shù)均低于100，不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表明AaPDEL和AaPDEH均屬于親水性不穩(wěn)定蛋白。

圖2 AaPDEL和AaPDEH基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Genetic structures of AaPDEL and AaPDEH

2.2.2 同源序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)域分析 通過(guò)GENEDOC軟件進(jìn)行氨基酸同源序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，AaPDEL和AaPDEH分別具有Class Ⅱ PDE保守催化結(jié)構(gòu)域H-x-H-L-D-H-[LIVM]-x-[GS]-[LIVMA]-[LIVM](2)-x-S-[AP]和Class Ⅰ PDE保守催化結(jié)構(gòu)域H-D-[LIVMFY]-x-H-x-[AG]-x(2)-[NQ]-x-[LIVMFY](圖3)。此外，通過(guò)SMART網(wǎng)站在線分析其氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域，并通過(guò)IBS1.0軟件繪制AaPDEL和AaPDEL蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，AaPDEL在位于第251～第357氨基酸范圍內(nèi)具有翻譯延長(zhǎng)因子EF1G保守基序，AaPDEH在位于第358～第548氨基酸范圍內(nèi)含有一個(gè)保守的金屬依賴性磷酸二酯酶“HD”基序(圖4)。

圖3 AaPDEL和AaPDEL同源序列比對(duì)Fig.3 Alignment of AaPDEL and AaPDEH homologous sequences

圖4 AaPDEL和AaPDEL的結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Domain analysis of AaPDEL and AaPDEH

2.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 利用NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線工具檢索AaPDEL和AaPDEH蛋白的同源序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果表明，AaPDEL和AaPDEH分別與小麥褐斑病菌(Pyrenophoratritici-repentis)和番茄匍柄霉(Stemphyliumlycopersici)基因聚于同一分支，親緣關(guān)系最近，同源性分別高達(dá)79.25%和88.80%。

圖5 AaPDEL和AaPDEH的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of AaPDEL and AaPDEH

2.2.4 跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽和親/疏水性分析 利用TMHMM Serverv.2.0預(yù)測(cè)AaPDEL和AaPDEH的跨膜區(qū)域，結(jié)果顯示，AaPDEL和AaPDEH均無(wú)跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白(圖6-A、B)。利用SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)AaPDEL和AaPDEH為信號(hào)肽的可能性，其值為0.146 7和0.050 1，因此兩個(gè)蛋白無(wú)信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白(圖6-C、D)。利用ProtScale預(yù)測(cè)AaPDEL和AaPDEH的親疏水性，發(fā)現(xiàn)整體上親水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中，且平均分值大于疏水性氨基酸，初步推測(cè)AaPDEL和AaPDEH均為親水性蛋白(圖6-E、F)。

圖6 AaPDEL和AaPDEH蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域(A、B)，信號(hào)肽(C、D)和親疏水性(E、F)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of transmembrane domains (A, B), signal peptides (C, D), and hydrophobicity predictions (E, F) of AaPDEL and AaPDEH proteins

2.2.5 二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 采用SOPMA軟件預(yù)測(cè)AaPDEL和AaPDEH蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖7-A所示。AaPDEL和AaPDEH蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲均是出現(xiàn)最多的結(jié)構(gòu)，而β-折疊和延伸鏈出現(xiàn)比例均較小。利用在線工具SWISS-MODEL對(duì)AaPDEL和AaPDEH蛋白進(jìn)行同源建模，得到三級(jí)結(jié)構(gòu)圖(圖7-B)。

注：A和B分別是AaPDEL和AaPDEH的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。Note: A and B are the secondary and tertiary structures of AaPDEL and AaPDEH, respectively.圖7 AaPDEL和AaPDEH基因編碼產(chǎn)物的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 AaPDEL and AaPDEH genes coding products of secondary and tertiary structure

2.2.6 亞細(xì)胞定位 成熟蛋白質(zhì)僅在特定的細(xì)胞器里發(fā)揮穩(wěn)定的生物學(xué)功能，因此，分析蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位有助于了解蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。利用Softberry預(yù)測(cè)結(jié)果表明，AaPDEL主要定位于線粒體上，AaPDEH主要定位于細(xì)胞核上(表3)。

表3 AaPDEL和AaPDEH亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Table 3 Prediction of AaPDEL and AaPDEH subcellular localization

2.2.7 磷酸化位點(diǎn)分析 利用NetPhos3.1 Server在線分析工具預(yù)測(cè)AaPDEL和AaPDEH中的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AaPDEL蛋白存在58個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)，32個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)和15個(gè)Tys磷酸化位點(diǎn)(圖8-A)；AaPDEH蛋白存在80個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)，36個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)和7個(gè)Tys磷酸化位點(diǎn)(圖8-B)。

注：Ser：絲氨酸；Thr：蘇氨酸；Tys：酪氨酸。Note: Ser:Serine. Thr:Threonine. Tys:Tyrosine.圖8 AaPDEL(A)和AaPDEH(B)蛋白的磷酸位點(diǎn)分析Fig.8 Protein phosphorylation sites analysis of AaPDEL(A) and AaPDEH(B) proteins

2.3 AaPDEL和AaPDEH在疏水性誘導(dǎo)侵染分化中的表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR發(fā)現(xiàn)AaPDEL和AaPDEH在A.alternata侵染結(jié)構(gòu)分化過(guò)程中表達(dá)量存在差異(圖9)。以萌發(fā)初級(jí)階段(2 h)作為對(duì)照，AaPDEL表達(dá)量在芽管伸長(zhǎng)階段(4 h)低于對(duì)照，隨后在附著胞形成階段(6 h)，以及侵染菌絲形成后期(8 h)均顯著上調(diào)。AaPDEH表達(dá)量在侵染結(jié)構(gòu)形成階段持續(xù)顯著上調(diào)。AaPDEL和AaPDEH基因在附著胞形成階段(6 h)表達(dá)均出現(xiàn)了高峰，表達(dá)量較萌發(fā)初級(jí)階段(2 h)分別上調(diào)了1.19和1.97倍。由此表明，AaPDEL和AaPDEH協(xié)同調(diào)控疏水誘導(dǎo)A.alternata附著胞和侵染菌絲的形成，以AaPDEH作用更為明顯。

注：不同字母代表顯著性差異(P<0.05)。Note: Different letters indicating significant differences at 0.05 level.圖9 AaPDEL和AaPDEH基因在侵染結(jié)構(gòu)分化中的表達(dá)量Fig.9 Expression of AaPDEL and AaPDEH genes in infection structure differentiation.

3 討論

本研究通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，AaPDEH具有典型的Class I PDE保守催化結(jié)構(gòu)域和金屬依賴性磷酸二酯酶“HD”基序；AaPDEL具有典型的Class Ⅱ PDE保守催化結(jié)構(gòu)域，這與M.oryzae[26]、S.turcica[27]和柑橘褐斑病菌(A.alternata)[28]等的磷酸二酯酶分析結(jié)果類似。保守結(jié)構(gòu)域是基因的核心，在生物進(jìn)化或者一個(gè)蛋白家族中具有不變或相同的結(jié)構(gòu)域，具有重要的功能。已有研究發(fā)現(xiàn)，存在于具有金屬依賴性磷酸水解酶超家族中的HD結(jié)構(gòu)域是調(diào)節(jié)磷酸二酯酶活性所必需的[29]。在M.oryzae中，高親和力磷酸二酯酶的HD結(jié)構(gòu)域能夠修復(fù)MoPDEH缺失突變株在產(chǎn)孢量、孢子形態(tài)、親水表面附著胞形成、毒力和胞內(nèi)cAMP水平上的缺陷[30]，這表明AaPDEH結(jié)構(gòu)的保守性可能與功能之間存在必然聯(lián)系。與ScPDEL[31]相比，AaPDEL多一個(gè)EF1G結(jié)構(gòu)域，因此該蛋白在梨果黑斑病菌A.alternata中可能具有更復(fù)雜的生物學(xué)功能。

PDE作為G蛋白信號(hào)通路中重要的效應(yīng)酶，一般在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。本研究通過(guò)生物學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，梨果黑斑病菌中AaPDEL和AaPDEH在亞細(xì)胞定位上存在一定差異，分別位于線粒體和細(xì)胞核中。Ramanujam等[22]通過(guò)融合報(bào)告基因定位法發(fā)現(xiàn)定位于不同位置的MoPDEH和MoPDEL對(duì)調(diào)控cAMP水平以及致病性發(fā)揮不同的調(diào)控作用。因此，AaPDEL和AaPDEH的具體調(diào)控作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

宿主表面蠟質(zhì)和疏水性是誘導(dǎo)部分植物病原真菌中侵染結(jié)構(gòu)形成的重要刺激信號(hào)[32-33]。在小麥白粉菌(Blumeriagraminis)中，噴蠟的載玻片上需要有高疏水性表面才能誘導(dǎo)B.graminis孢子萌發(fā)和附著胞形成[34]。在玉米黑粉病菌(Ustilagomaydis)中疏水性表面能夠誘導(dǎo)菌絲的擴(kuò)展和附著胞形成[35]。本試驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，A.alternata在梨果表皮上的侵染過(guò)程為孢子萌發(fā)形成芽管，芽管伸長(zhǎng)、頂端膨大形成附著胞，部分附著胞進(jìn)一步分化形成侵染菌絲，進(jìn)而通過(guò)皮孔或表皮傷口侵入果實(shí)，而果實(shí)表皮疏水性與誘導(dǎo)A.alternata附著胞的形成呈正相關(guān)[36]。前人研究表明，許多植物病原真菌中附著胞的形成是成功侵入寄主的關(guān)鍵[37]。本研究利用人造疏水性表面誘導(dǎo)梨果黑斑病菌侵染結(jié)構(gòu)分化發(fā)現(xiàn)，AaPDEL和AaPDEH基因均在附著胞形成階段(6 h)上調(diào)表達(dá)，表明AaPDEL和AaPDEH參與了疏水介質(zhì)誘導(dǎo)A.alternata附著胞形成的調(diào)控作用，這與申珅等[13]研究S.turcica中StL-PDE主要參與分生孢子發(fā)育，StH-PDE在附著胞發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用的結(jié)果不一致，表明磷酸二酯酶PDEL和PDEH在不同真菌中的調(diào)控作用具有物種特異性。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)在附著胞形成階段，AaPDEH表達(dá)量高于AaPDEL，表明AaPDEH在附著孢形成階段發(fā)揮更重要的調(diào)控作用，該結(jié)果與前人研究一致[38]，在B.cinerea中，高親和力磷酸二酯酶BcPDEH在生長(zhǎng)、分化和毒力等方面的調(diào)控作用要比低親和力磷酸二酯酶BcPDEL更明顯。在M.oryzae中，MoPDEH在分生孢子萌發(fā)、附著胞和侵染菌絲形成階段均上調(diào)表達(dá)，在調(diào)節(jié)cAMP水平和致病性方面起主導(dǎo)作用，而MoPDEL無(wú)明顯功能[16]。綜上，AaPDEL和AaPDEH均參與了疏水誘導(dǎo)A.alternata侵染結(jié)構(gòu)分化的調(diào)控，其中AaPDEH的調(diào)控作用更明顯，但其調(diào)控的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步揭示。

4 結(jié)論

本研究從梨果黑斑病菌克隆得到AaPDEL和AaPDEH基因，利用生物信息學(xué)分析了該基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)以及亞細(xì)胞定位等。同時(shí)qRT-PCR分析表明，在疏水性誘導(dǎo)條件下，AaPDEL和AaPDEH在A.alternata附著胞形成時(shí)期上調(diào)表達(dá)，其中AaPDEH調(diào)控作用更為明顯，表明AaPDE參與了梨果黑斑病菌侵染結(jié)構(gòu)分化的調(diào)控。該結(jié)果為進(jìn)一步通過(guò)分子水平揭示PDE基因的功能及其調(diào)控梨果黑斑病菌侵染結(jié)構(gòu)分化的機(jī)制提供理論依據(jù)。