吳 威

李 群

宋 笛

孫明哲

(長春職業(yè)技術(shù)學院食品與生物技術(shù)分院，吉林 長春 130033)

葛花(Puerariaeflos)又名葛條花，具有解酒、降血脂、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[1-3]。葛花異黃酮是葛花的主要生物活性成分之一[4]，近年來葛花異黃酮的提取、純化和結(jié)構(gòu)鑒定方面也取得一些研究成果[5-7]，但分離純化技術(shù)落后、產(chǎn)品純度不高限制了葛花異黃酮在食品、化妝品和醫(yī)藥健康領(lǐng)域的應用。

肥胖已成為世界性的健康問題，脂類過量攝入是導致超重的重要因素之一。抑制膳食脂肪吸收進入人體消化系統(tǒng)是減肥的重要途徑之一[8]。在脂肪消化吸收過程中胰脂肪酶和膽固醇酯酶發(fā)揮了關(guān)鍵作用，抑制胰脂肪酶和膽固醇酯酶活性，可控制脂肪吸收進入人體，因此，胰脂肪酶抑制率、膽固醇酯酶抑制率和膽固醇膠束溶解度成為體外降脂減肥評價的通用方法[9-11]。異黃酮類化合物具有一定的降脂活性[12]，但關(guān)于葛花異黃酮降脂活性的研究未見報道。研究擬優(yōu)化葛花異黃酮精制工藝，并以胰脂肪酶、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度抑制率為指標，評價精制前后葛花異黃酮的體外降脂減肥活性，以期為葛花資源在食品領(lǐng)域中的應用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

葛花：吉林大藥房，經(jīng)干燥、粉碎、過80目篩備用。

1.2 儀器與試劑

酶標儀：F50型，瑞士帝肯TECAN集團公司；

紫外可見光分光光度計：UV-1700型，日本島津公司；

真空冷凍干燥機：FD-1A-50型，上海豫明儀器有限公司；

氣流式超微粉碎機：RT-25型，北京錕捷玉誠機械設備有限公司；

超聲波萃取儀：KS-600N型，上?？缕顑x器設備有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52C型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

葛根素標準品：中國食品藥品檢定研究院；

AB-8、NKA-9、HPD-100、D101、LSA-10型大孔樹脂：天津允開樹脂科技有限公司；

豬胰脂肪酶(100 U/mg)、豬胰膽固醇酯酶(100 U/mg)、對硝基苯基月桂酸酯、對硝基苯基丁酸酯：美國Sigma公司；

奧利司他膠囊(orlistat)：重慶華森制藥有限公司；

總膽固醇檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司。

1.3 葛花異黃酮提取方法

參照孫明哲[13]的方法，以葛花為原料，粉碎過80目，固液比(m葛花∶V乙醇溶液)1∶16 (g/mL)，乙醇體積分數(shù)74%，超聲功率260 W，超聲時間40 min，超聲溫度76 ℃，提取2次，濃縮、凍干(-55 ℃，0～5 Pa)備用。

1.4 葛花異黃酮的精制工藝

1.4.1 葛花異黃酮吸附率和解吸率 吸附率按式(1)計算，解吸率按式(2)計算。

(1)

(2)

式中：

A——吸附率，%；

D——解吸率，%；

A0——原液葛花異黃酮的吸光度值(250 nm)；

A1——吸附后溶液的吸光度值(250 nm)；

A2——洗脫溶液的吸光度值(250 nm)。

1.4.2 樹脂優(yōu)選 分別取5 g AB-8、NKA-9、D101、HPD-100和LSA-10型大孔吸附樹脂，預處理后置于三角瓶中，分別加入 50 mg/mL的葛花異黃酮粗提液20 mL，室溫震蕩2 h，過濾，于250 nm處測定濾液的吸光度值，計算吸附率；取吸附飽和的樹脂，分別向其中加入體積分數(shù)70%的乙醇水溶液20 mL，室溫條件下振蕩2 h，過濾，測定250 nm處吸光度值，計算解吸率，葛花異黃酮的精制樹脂選擇吸附率和解吸率中的最大值。

1.4.3 葛花異黃酮質(zhì)量濃度對吸附率的影響 取質(zhì)量濃度12.5，25，50，100，200，400，800 mg/mL的葛花異黃酮溶液各50 mL，與20 g預處理的HPD-100型大孔樹脂混合，室溫振蕩 2 h，過濾，測定濾液的吸光度值(250 nm)，計算吸附率。

1.4.4 pH值對葛花異黃酮吸附率的影響 三角瓶中分別配制50 mL質(zhì)量濃度為50.0 mg/mL的葛花異黃酮，pH值分別調(diào)整為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，分別加入預處理的HPD-100型大孔樹脂20 g，室溫振蕩 2 h，過濾，測定濾液的吸光度值(250 nm)，計算吸附率。

1.4.5 洗脫液體積分數(shù)對葛花異黃酮解吸率的影響 分別配制50 mL體積分數(shù)為30%，40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液，加入吸附飽和的HPD-100型大孔樹脂20 g，室溫振蕩 2 h，過濾，測定濾液的吸光度值(250 nm)，計算解吸率。

1.4.6 pH值對葛花異黃酮解吸率的影響 取吸附飽和的HPD-100型大孔樹脂20 g 于三角瓶中，將50 mL體積分數(shù)70%的乙醇溶液分別加入其中，調(diào)整溶液的pH值分別為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，置于搖床中振蕩 2 h，過濾取濾液，測定250 nm處吸光度值，計算解吸率。

1.4.7 洗脫流速對葛花異黃酮解吸率的影響 層析柱中(35 mm×500 mm)填入HPD-100型大孔樹脂(經(jīng)預處理)，經(jīng)12 h平衡后，上樣，即加入20 mL葛花異黃酮溶液(100 mg/mL)；洗脫，即利用70%(pH 5.0)乙醇溶液進行洗脫，洗脫流量分別調(diào)整為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/min，收集洗脫液，測定濾液的吸光度值(250 nm)，計算解吸率。

1.5 葛花異黃酮對胰脂肪酶活性的影響

胰脂肪酶活性測定參照Gondoin等[14]的方法并做適當修改。酶液(10 mg/mL)：1 g胰脂肪酶溶解于10 mL去離子水中，渦旋2 min，離心(8 000 r/min，10 min)取上清液備用；緩沖溶液：100 mmol/L pH 8.2 的三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris)；底物(對硝基苯基月桂酸酯0.08%)：以5 mmol/L pH 5.0的磷酸鹽緩沖溶液(內(nèi)含1% 曲拉通，Triton X-100)配制。分別取緩沖溶液350 μL，酶液150 μL，不同質(zhì)量分數(shù)葛花異黃酮樣品50 μL于離心管中，再加入450 μL底物開始反應，37 ℃孵育2 h，離心(8 000 r/min，1 min)，測上清液吸光度值(400 nm)，對照組以去離子水替代葛花異黃酮，胰脂肪酶抑制率按式(3)計算。

(3)

式中：

HP——胰脂肪酶抑制率，%；

AC——對照組吸光度值；

AS——樣品吸光度值。

1.6 葛花異黃酮對膽固醇酯酶活性的影響

膽固醇酯酶活性測定參照Garzón等[15]的方法并適當修改。酶液(25 μg/mL)：0.25 mg豬胰膽固醇酯酶溶解于10 mL去離子水中，離心(8 000 r/min，10 min)取上清液備用；底物緩沖液：配制0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.04)(內(nèi)含0.1 mol/L NaCl，0.02 mol/L對硝基苯基丁酸酯，6 mmol/L?；悄懰徕c)，分別取底物緩沖液925 μL，酶液50 μL和25 μL不同質(zhì)量分數(shù)葛花異黃酮樣品于離心管中，25 ℃孵育5 min，測吸光度值(405 nm)，對照組加入25 μL去離子水，膽固醇酯酶抑制率按式(3)計算。

1.7 葛花異黃酮對膽固醇膠束溶解度的影響

膽固醇膠束的制備參照Prados等[16]的方法并適當修改。膽固醇膠束制備：以15 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)配制，內(nèi)含?；悄懰徕c(10 mmol/L)、膽固醇(2 mmol/L)、油酸(5 mmol/L)、NaCl(132 mmol/L)，超聲波(400 Hz)處理1 h，37 ℃孵育24 h，取1 mL不同質(zhì)量分數(shù)葛花異黃酮樣品與5 mL膽固醇膠束混合，37 ℃孵育2 h，離心(8 000 r/min，10 min)，用總膽固醇試劑盒測定上清液膽固醇含量，對照組加1 mL去離子水，抑制率按式(4)計算。

(4)

式中：

HC——膽固醇膠束溶解度抑制率，%；

CC——對照組膽固醇含量，mmol/L；

CS——樣品膽固醇含量，mmol/L。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 葛花異黃酮精制工藝的確定

2.1.1 樹脂優(yōu)化 大孔吸附樹脂是廣泛選用的精制異黃酮類化合物的柱填料，因其極性和粒徑大小的不同，對不同異黃酮類化合物的吸附和解離的難易程度存在差異[17]。由圖1可知，HPD-100型大孔樹脂對葛花異黃酮表現(xiàn)出較好的吸附和解離性能，吸附率最高為89.61%，解吸率最高為83.86%，優(yōu)于其他類型的大孔樹脂，HPD-100型大孔樹脂的極性和粒徑適合分離葛花異黃酮，可以用于后續(xù)精制過程。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 樹脂篩選Figure 1 Optimization of macroporous adsorption resin

2.1.2 葛花異黃酮質(zhì)量濃度對吸附率的影響 由圖2可知，隨著葛花異黃酮質(zhì)量濃度的增大，吸附率呈先增加后減小的趨勢，當葛花異黃酮質(zhì)量濃度達到100 mg/mL時，吸附率出現(xiàn)最大值88.41%，此后吸附率逐漸減小?？赡苁歉邼舛鹊母鸹ó慄S酮堵塞樹脂孔洞，導致吸附率下降，因此葛花異黃酮吸附液質(zhì)量濃度定為100 mg/mL。

2.1.3 pH值對葛花異黃酮吸附率的影響 由圖3可知，隨吸附溶液pH的增加，吸附率呈先增大后減小的趨勢，當吸附液pH為6.0時，吸附率最高為87.49%。葛花異黃酮的弱酸性質(zhì)使其在pH 6.0 時出現(xiàn)最高的吸附率，與閔玉濤等[18]純化葛根異黃酮的吸附溶液pH(5.0～6.0)相似。因此，調(diào)整吸附溶液pH為6.0。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 葛花異黃酮質(zhì)量濃度對吸附率的影響

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 pH值對葛花異黃酮吸附率的影響Figure 3 The effect of pH on adsorption rate ofPuerariae flos isoflavones

2.1.4 洗脫液體積分數(shù)對葛花異黃酮解吸率的影響 由圖4可知，隨洗脫液濃度的增加，解吸率呈先增大后減小的趨勢，當洗脫液體積分數(shù)為70%時，解吸率達到最大值82.35%，70%的乙醇溶液，其極性適合從樹脂上解離葛花異黃酮類物質(zhì)。因此，洗脫溶液定為體積分數(shù)70%的乙醇溶液。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 洗脫液體積分數(shù)對葛花異黃酮解吸率的影響

2.1.5 pH值對葛花異黃酮解吸率的影響 由圖5可知，隨洗脫溶液pH值的增大，解吸率先增大后減小，在pH值為5.0處，解吸率出現(xiàn)最大值81.52%，因此，洗脫液pH值調(diào)整為5.0。

2.1.6 洗脫流速對葛花異黃酮解吸率的影響 由圖6可知，隨洗脫流速的增加，葛花異黃酮解吸率呈先增大后減小的趨勢，當2.0 mL/min速度進行洗脫時，解吸率出現(xiàn)最大值82.35%，洗脫流速過高，葛花異黃酮洗脫不夠完全，導致解吸率減小，洗脫流速參數(shù)與劉瑩等[19]的結(jié)論相同。因此，洗脫流速調(diào)整為2.0 mL/min。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 pH對葛花異黃酮解吸率的影響

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 洗脫流速對葛花異黃酮解吸率的影響

2.1.7 葛花異黃酮精制工藝參數(shù) 層析柱中(35 mm×500 mm)裝入預處理的HPD-100型大孔樹脂，以去離子水平衡12 h，吸附條件：葛花異黃酮質(zhì)量濃度100 mg/mL，pH 6.0，體積20 mL；解吸條件：70%乙醇溶液(pH 5.0)，流速2.0 mL/min。如圖7所示，經(jīng)HPD-100型大孔樹脂精制后，洗脫曲線中出現(xiàn)單一組分峰，收集管編號(22～30)，真空濃縮，冷凍干燥后獲得葛花異黃酮精制組分A1(純度81.47%)。

圖7 葛花異黃酮洗脫曲線Figure 7 The elution graph of Puerariae flosisoflavones

2.2 葛花異黃酮對胰脂肪酶活性的影響

由圖8可知，隨葛花異黃酮濃度的增加，胰脂肪酶抑制率呈線性增加的趨勢，當質(zhì)量濃度超過0.2 mg/mL后，趨于平緩，在1.0 mg/mL處抑制率出現(xiàn)最大值40.73%，略低于奧利司他(44.36%)，但高于未精制葛花異黃酮26.65%，高于相同質(zhì)量濃度的陳年烏龍茶[20]。胰脂肪酶是膳食脂肪分解的關(guān)鍵酶，抑制其活性可減少脂肪吸收，降低脂肪利用率[21]。葛花異黃酮可抑制胰脂肪酶活性，通過減少脂肪消化分解發(fā)揮降脂減肥作用。

圖8 葛花異黃酮對胰脂肪酶活性的影響

2.3 葛花異黃酮對膽固醇酯酶活性的影響

由圖9可知，隨葛花異黃酮質(zhì)量濃度的增大，膽固醇酯酶活性表現(xiàn)出一定的抑制作用，抑制率呈線性增加趨勢，當質(zhì)量濃度高于0.6 mg/mL時，增長趨勢趨于平緩，當質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，抑制率最高為52.32%，略低于奧利司他(54.28%)，但高于未精制葛花異黃酮(47.46%)。抑制膽固醇酯酶活性，可減少膳食中的膽固醇酯分解成膽固醇，進而抑制膽固醇的吸收，發(fā)揮降脂減肥的作用[22]。葛花異黃酮可抑制膳食膽固醇酯分解成游離膽固醇進入消化系統(tǒng)，具有一定的降脂減肥活性。

圖9 葛花異黃酮對膽固醇酯酶活性的影響

2.4 葛花異黃酮對膽固醇膠束溶解度的影響

由圖10可知，隨葛花異黃酮質(zhì)量濃度的增加，膽固醇膠束溶解度抑制率呈線性增加的趨勢，在質(zhì)量濃度1.0 mg/mL 處，抑制率出現(xiàn)最大值46.17%，略低于奧利司他(48.41%)，但高于未精制葛花異黃酮(37.53%)，膽固醇膠束溶解度抑制率高于亞麻籽肽[23]。膽固醇需借助膽固醇膠束完成轉(zhuǎn)運到消化系統(tǒng)的過程，溶解度越高，吸收利用率就越高[24]。葛花異黃酮可降低膽固醇膠束溶解度，降低膽固醇的生物利用率，發(fā)揮降脂減肥作用。

圖10 葛花異黃酮對膽固醇膠束溶解度的影響

3 結(jié)論

試驗優(yōu)化了葛花異黃酮的精制工藝條件，同時評價其體外降脂減肥活性。葛花異黃酮精制的最優(yōu)樹脂選擇HPD-100型大孔吸附樹，精制工藝條件如下，吸附條件：上樣100 mg/mL葛花異黃酮溶液(pH 6.0) 20 mL；解吸條件：利用70%乙醇溶液(pH 5.0)以2.0 mL/min的流速進行洗脫，葛花異黃酮經(jīng)精制后純度可達81.47%。精制后的葛花異黃酮在體外對胰脂肪酶、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度都表現(xiàn)出較好的抑制作用，并呈一定的劑量效應關(guān)系，但抑制率略低于奧利司他，高于未精制葛花異黃酮。葛花異黃酮可以通過抑制胰脂肪酶，抑制膽固醇酯酶的活性，降低膽固醇膠束溶解度，阻止食物中脂肪消化吸收而發(fā)揮降脂減肥作用，但能否在動物體內(nèi)經(jīng)消化后也表現(xiàn)出相同的降脂減肥活性，以及其作用機制將在后續(xù)研究中進行探討。