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        化學(xué)合成類抗球蟲藥殘留檢測方法研究進(jìn)展

        2022-03-11 00:48:04龐杏豪
        食品與機(jī)械 2022年2期
        關(guān)鍵詞:試紙層析磺胺

        龐杏豪

        胡驍飛2

        邢云瑞2

        孫亞寧2

        王 耀1

        (1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽 471003;2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室,河南 鄭州 450002)

        球蟲病是由艾美球蟲屬的傳染性寄生蟲引起的疾病,其卵囊寄生于畜禽的腸道上皮細(xì)胞組織,破壞細(xì)胞的正常生理結(jié)構(gòu),導(dǎo)致炎癥和出血[1],使畜禽體重減輕、產(chǎn)蛋率下降[2],料肉比增加[3]。當(dāng)前,臨床對球蟲的防控方式分為球蟲疫苗和抗球蟲藥,前者含有小劑量的球蟲卵囊,可在腸道定殖,通過卵囊循環(huán)使動物機(jī)體獲得免疫,起到預(yù)防效果而無治療作用[4];后者主要用于治療也可用于預(yù)防,且選擇范圍廣,在實際養(yǎng)殖過程中大規(guī)模應(yīng)用。近年來,獸藥殘留超標(biāo)已成為食品安全監(jiān)督抽檢中發(fā)現(xiàn)的主要不合格問題之一[5]。長期不規(guī)范使用抗球蟲藥不僅會對畜禽產(chǎn)生毒性作用,使其耐藥性增強(qiáng),增加養(yǎng)殖成本,對養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和畜禽貿(mào)易產(chǎn)生不良影響;還會造成動物源性食品中殘留超標(biāo),將嚴(yán)重影響胃腸道菌群平衡,對人體健康造成潛在的慢性毒性危害[6-7]。為嚴(yán)格監(jiān)控動物源食品中的獸藥殘留情況,中國制訂了食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[8],規(guī)范了食品中化學(xué)合成類抗球蟲藥的最高殘留限量(見表1)。當(dāng)前有關(guān)抗球蟲藥殘留檢測方法僅側(cè)重于一類檢測方法[9-10],針對性強(qiáng)但全面性不夠。文章擬綜述近年來化學(xué)合成類抗球蟲藥的多種殘留檢測方法,如超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、免疫層析試紙法等,以期為抗球蟲藥檢測方法的深入研究提供參考。

        表1 化學(xué)合成類抗球蟲藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[8]Table 1 Standard for residue limits of chemically synthesized coccidiostats

        1 抗球蟲藥概述

        當(dāng)前,用于畜禽球蟲病防治的抗球蟲藥主要分為聚醚離子載體類、化學(xué)合成類和中草藥制劑類3類,其中化學(xué)合成類由于價格低廉、防治效果好而被廣泛使用?;瘜W(xué)合成類抗球蟲藥包含磺胺類、吡啶類、三嗪類、二硝基類等多個種類,其作用機(jī)理各不相同[11]?;前奉愃幬锱c對氨苯甲酸爭奪二氫葉酸合成酶,影響葉酸形成,阻礙核蛋白合成,抑制球蟲的生長繁殖;吡啶類藥物可通過抑制蟲體的呼吸作用來影響正常的新陳代謝[12];三嗪類抗球蟲藥通過抑制呼吸鏈酶的活性影響蟲體新陳代謝[13];二硝基類抗球蟲藥具有廣譜活性,尼卡巴嗪可抑制琥珀酸連接的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原[14];胍類抗球蟲藥阻止球蟲成熟裂殖體的形成[15];喹啉類中癸氧喹酯抗球蟲藥可降低球蟲卵囊孢子形成率[16];抗硫胺素類抗球蟲藥可抑制艾美球蟲對硫胺素的吸收,使硫胺素輔酶形成受阻;常山酮可抑殺球蟲早期生殖性芽孢以及第一、第二代裂殖體[17]。過量的抗球蟲藥在發(fā)揮藥效的同時,會對動物產(chǎn)生一定的毒副作用。高劑量的磺胺喹惡啉對幼雞的肝索細(xì)胞、肝臟淋巴區(qū)域、膽管、腎臟、骨髓和甲狀腺造成損傷[18];氯羥吡啶對小鼠有致畸和致突變作用[19-20];地克珠利可引起小鼠肝細(xì)胞和肝竇細(xì)胞腫脹、腸系膜組織細(xì)胞增生癥等不良反應(yīng);尼卡巴嗪在飼喂孕鼠時出現(xiàn)母體死亡率增加、幼鼠延遲骨化及胎兒體重降低等現(xiàn)象;常山酮可使牛腹瀉、胃腸道充血發(fā)炎,伴隨出現(xiàn)低蛋白血癥、高尿毒癥等現(xiàn)象[21]。

        2 化學(xué)合成類抗球蟲藥殘留檢測方法

        2.1 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

        超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)是一種集高效分離和多組分定性、定量于一體的方法,具有分離效率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點。梁飛燕等[22-23]建立了UPLC-MS/MS法用于氯羥吡啶的殘留檢測,前者選用PRIME HLB固相萃取柱作為純化柱,降低了樣品雜質(zhì)的影響,提高了檢測靈敏度,定量限和檢出限遠(yuǎn)低于后者。Zhao等[24]建立了HPLC-MS/MS和UPLC-MS/MS兩種方法檢測牛肉中8種抗球蟲藥殘留,結(jié)果表明兩種方法均具有高靈敏度和良好的準(zhǔn)確性,可滿足不同機(jī)構(gòu)所用設(shè)備的檢測需求,且UPLC-MS/MS的準(zhǔn)確性更好。Broekaert等[25]建立了UPLC-MS/MS法用于蔬菜中地克珠利、尼卡巴嗪等6種抗球蟲藥的殘留檢測,定量限為0.30~2.98 μg/kg。在使用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測藥物殘留時,樣品的基質(zhì)效應(yīng)對檢測方法的定量限、檢出限、準(zhǔn)確度和精密度均會產(chǎn)生不良影響。此外,該法所用儀器不僅價格昂貴,還對研究人員的檢測技術(shù)有較高要求,限制了其大規(guī)模應(yīng)用。

        2.2 酶聯(lián)免疫吸附測定法

        酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)將酶催化反應(yīng)的放大作用和抗原抗體親和反應(yīng)的專一性相結(jié)合[26],大大提高了檢測靈敏度,常被用于樣品的快速篩查。在檢測抗球蟲藥等小分子物質(zhì)時,該方法多基于競爭ELISA原理建立,即通過待檢抗原與包被在固相載體上的抗原競爭性結(jié)合單克隆抗體來達(dá)到檢測目的。張夢等[27]用重氮化方法合成磺胺氯吡嗪鈉抗原,制備單克隆抗體,建立間接競爭ELISA方法檢測動物組織中磺胺氯吡嗪殘留檢測,線性檢測范圍為20~400 ng/mL。龔云飛等[28]建立了間接競爭ELISA方法檢測雞蛋和雞肉樣品中磺胺二甲嘧啶殘留,雞蛋和雞肉樣品實際檢出限分別為2,5 ng/g。Li等[29]建立了間接競爭ELISA方法檢測牛奶樣品,其中磺胺甲噁唑、磺胺喹喔啉、磺胺間二甲氧嘧啶和磺胺二甲嘧啶的檢出限分別為1.25,2.95,3.35,6.10 μg/L,為抗球蟲藥殘留檢測提供了一種簡單、靈敏、高通量的篩選工具。Zhang等[30]建立了一步間接競爭ELISA方法,用于動物源性食品中地克珠利的殘留檢測,IC50為0.952 μg/kg,相較于傳統(tǒng)間接競爭ELISA方法至少節(jié)省30 min。Bai等[31]同時建立了直接競爭ELISA方法和非競爭性ELISA方法用于雞肉中常山酮殘留檢測,與使用相同抗體的競爭法相比,非競爭性ELISA方法在靈敏度和檢測范圍方面顯示出明顯優(yōu)勢,檢出限為0.13 ng/mL,線性檢測范圍為1.3~53.4 ng/mL。ELISA方法中常用的辣根過氧化物酶等天然酶的催化活性有限,穩(wěn)定性受環(huán)境、溫度等因素的影響較大。在檢測過程中,抗體和包被原濃度、各操作過程的反應(yīng)時間都會影響ELISA結(jié)果,大量的手動加樣步驟易導(dǎo)致人為誤差。

        2.3 免疫層析試紙法

        免疫層析試紙法是在單克隆技術(shù)、免疫層析技術(shù)及標(biāo)記技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種快速檢測方法,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、攜帶方便等優(yōu)點,在獸藥殘留的快速檢測方面發(fā)展迅速。免疫層析試紙條主要由帶壓敏膠的支撐底板、NC膜、吸水紙、膠金墊、樣品墊按序組裝而成[如圖1(a)],根據(jù)檢測所需在NC膜上噴涂C線和T線,其中C線作為質(zhì)控線始終顯色,若不顯色即為試紙失效。在檢測抗球蟲藥這類小分子物質(zhì)時,多以膠體金為顯色媒介構(gòu)建膠體金免疫層析試紙[32-35]。反應(yīng)原理如圖1(b) 所示,當(dāng)樣品中不含待測物時,金標(biāo)抗體先后與T線上的包被抗原以及C線上的羊抗鼠二抗反應(yīng),T、C線均顯色,呈陰性;當(dāng)樣品中含有待測物時,待測物與包被原競爭有限的金標(biāo)抗體,且待測物含量越高,T線顯色越淺,呈陽性。Wang等[36]建立了膠體金免疫層析試紙法用于檢測雞肉樣品中的地克珠利,15 min即可完成檢測過程,定性及半定量臨界值為20 μg/kg,機(jī)讀檢出限為1.08 μg/kg。Chao等[37]用高靈敏度單克隆抗體創(chuàng)建膠體金免疫層析試紙法,用于快速篩查生雞肉樣品中氯羥吡啶殘留,定性及半定量臨界值為5 μg/kg,機(jī)讀檢出限為0.14 μg/kg。盡管基于膠體金免疫層析試紙法的建立已經(jīng)成熟化,但針對抗球蟲藥的檢測靶標(biāo)相對單一,無法滿足多種藥物同時檢測的需求,而且其靈敏度依賴于抗體的特性和標(biāo)記物的穩(wěn)定性,靈敏度與假陰性問題始終是困擾該方法的關(guān)鍵問題。

        圖1 免疫層析試紙的組成及原理示意圖[32]

        2.4 表面增強(qiáng)拉曼光譜法

        表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)法是一種靈敏度更高、信號更強(qiáng)的拉曼技術(shù)[38],已被應(yīng)用于動物性食品中抗球蟲藥殘留檢測。金納米粒子(AuNPs)是SERS法常用的活性基底,可顯著增強(qiáng)SERS信號強(qiáng)度[39],提供好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性。Li等[40]以微波法合成磁性離子液體/金納米粒子(MIL-AuNPs)作為SERS底物,用于測定雞蛋樣品中的氯羥吡啶殘留,MIL-AuNPs粒徑均一分散,SERS信號明顯高于普通AuNPs(見圖2),該方法檢出限低至0.5 μg/kg。銀納米粒子(AgNPs)表面增強(qiáng)活性高于AuNPs[41],在實際應(yīng)用中效果更佳。Shao等[42]將AgNPs應(yīng)用于SERS法檢測鴨肉和雞肉樣品中二硝托胺和托曲珠利殘留,線性濃度范圍分別為0.30~33.30,0.30~66.70 nmol/L,檢出限分別為0.915,1.03 nmol/L。雙金屬納米結(jié)構(gòu)相比于單一金屬基底具有更好的SERE活性,Bi等[43]基于AuNPs和AgNPs制備出核殼結(jié)構(gòu)作為SERS底物,檢測雞、鴨樣品中鹽酸氨丙啉殘留。在檢測過程中藥物分子固定于金核和銀殼之間,顯著增強(qiáng)了藥物的拉曼信號,且Au@Ag納米粒子的負(fù)電性使其通過靜電作用均勻地分散在水中,形成穩(wěn)定的膠體。隨著檢測靈敏度的提高,對SERS基底性能的要求越來越高,合成優(yōu)良性能的基底成為新的研究方向。

        圖2 微波法合成磁性離子液體/金納米粒子作為超靈敏SERS基底用于痕量氯羥吡啶檢測[40]Figure 2 Microwave method synthesis of magnetic ionic liquid/gold nanoparticles as ultrasensitive SERS substratesfor trace clopidol detection

        2.5 毛細(xì)管電泳法

        毛細(xì)管電泳法是一種依據(jù)帶電化合物在高壓電場中分配系數(shù)和淌度差異達(dá)到鑒定和分離目的的強(qiáng)大工具[44],因其快速、高效率、樣品消耗量少的顯著優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用[45]。樣品前處理是毛細(xì)管電泳法開發(fā)的關(guān)鍵,在線固相萃取技術(shù)的應(yīng)用是樣品凈化的重要手段,同時也是提高實驗室通量的最佳策略之一。Ma等[46]在毛細(xì)管電泳法中應(yīng)用了離線分散液—液微萃取與在線場放大樣品進(jìn)樣相結(jié)合的雙富集方法,用于同時測定包括磺胺二甲嘧啶在內(nèi)的4種磺胺類藥物,為復(fù)雜水基質(zhì)中磺胺類藥物測定提供了廣闊前景。張建等[47]使用膠束溶劑堆積法在線富集模式并進(jìn)行條件優(yōu)化,建立了高效毛細(xì)管電泳法檢測雞蛋中3種磺胺類藥物殘留,檢出限約1.0 ng/mL。實際檢測過程中,現(xiàn)有技術(shù)與毛細(xì)管電泳法結(jié)合使用,有利于提高檢測靈敏度。

        2.6 電化學(xué)傳感器

        電化學(xué)傳感器可在復(fù)雜基質(zhì)中實現(xiàn)抗球蟲藥殘留的快速檢測,其靈敏度與電極的性能息息相關(guān)。而在電極表面修飾碳納米管、石墨烯、石墨碳氮化物等不同的材料,可提高電極靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性[48]。Huang等[49]將合成分子印跡聚合物固定在氧化石墨烯和二氧化鈦修飾的鉑電極表面,制備了分子印跡電化學(xué)傳感器(圖3),用于雞肌肉和雞蛋樣品中托曲珠利檢測。氧化石墨烯和二氧化鈦具有較大的活性表面積和較高的催化活性,可放大電化學(xué)信號,提高傳感器的靈敏度。改性碳糊電極可同時修飾多種生物傳感器材料,具有較寬的工作電位范圍,且易制備、成本低、表面構(gòu)建過程方便快捷,近年來被廣泛應(yīng)用[50]。Soleymanpour等[51]用磺胺喹喔啉鈉與2,3,5-三苯基四唑氯化物制備離子絡(luò)合物應(yīng)用于碳糊電極,制備了電化學(xué)傳感器傳感器,并用于測定生物樣品和牛奶中磺胺喹喔啉,檢出限低至3.0×10-6mol/L。Abdel-Raoof等[52]制備了氧化鎳納米粒子修飾多壁碳納米管作為傳感材料,用于雞肉中鹽酸氨丙啉的殘留檢測。與裸碳糊電極相比,該電極響應(yīng)時間短、重現(xiàn)性良好,方法檢出限低至6.3×10-7mol/L,線性范圍為10-6~10-2mol/L。目前大多數(shù)電化學(xué)傳感器的構(gòu)建都處于實驗室階段,實現(xiàn)批量化生產(chǎn)需要考慮不同修飾材料的穩(wěn)定性、生產(chǎn)成本以及攜帶便捷性等問題。

        圖3 分子印跡電化學(xué)傳感器示意圖[49]Figure 3 The schematic illustration of the molecularly imprinted electrochemical sensor

        3 總結(jié)與展望

        化學(xué)合成類抗球蟲藥常在家禽的生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用,出于對消費者健康考慮,近年來中國已經(jīng)為動物源性食品中的抗球蟲藥殘留設(shè)定了相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn),促使抗球蟲藥殘留檢測方法朝著靈敏度更高、特異性更好的方向發(fā)展。色譜法檢測極性抗球蟲藥殘留物時,常規(guī)的反相色譜吸附劑不能達(dá)到理想的分析效果,需要開發(fā)更有效的樣品制備程序,以減少由樣品基質(zhì)引起的離子抑制或增強(qiáng)作用。目前已有的免疫學(xué)檢測方法中,天然酶的活性限制了研究的發(fā)展,而納米材料的酶模擬物(納米酶)作為一種新型的人工酶,具有合成容易、穩(wěn)定性好、成本低、設(shè)計靈活等顯著特性,不僅有望替代天然酶在ELISA中廣泛應(yīng)用,還可作為標(biāo)記物用于免疫層析試紙法。同時,開發(fā)新型高效基底是SERS法發(fā)展的關(guān)鍵,新型稀土摻雜半導(dǎo)體基底[53]、MOF基底[54]以及仿生結(jié)構(gòu)的SERS基底[55]已分別應(yīng)用至醫(yī)學(xué)、藥殘檢測領(lǐng)域,未來會有更多的新型材料用于基底研發(fā),實現(xiàn)食品中抗蟲球藥殘留的快速靈敏檢測。毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光法等現(xiàn)有技術(shù)聯(lián)用是未來發(fā)展的重點,既提高了檢測效率和精確度,也為藥殘檢測提供了新的方向。對于電化學(xué)傳感器來說,功能化界面的不可再生性導(dǎo)致電極只能滿足單個樣品的測試,難以通過批量化檢測來降低成本,因此開發(fā)靈敏度高、穩(wěn)定性好、可重復(fù)使用的電極應(yīng)用于電化學(xué)傳感器,將推動電化學(xué)傳感器朝著小型化、便捷化方向發(fā)展。

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