劉錫銘

何 佳1,2

芮 蓬1,2

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2. 洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

紅薯葉中蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)元素含量極高，有很好的營養(yǎng)價值與保健功能[1]，其副產(chǎn)品加工種類也日益豐富，如紅薯葉掛面[2]、紅薯葉保健茶[3]等。紅薯葉酸菜作為一種較新穎的發(fā)酵型蔬菜也應(yīng)運而生。與傳統(tǒng)發(fā)酵不同，乳酸菌接種后的發(fā)酵酸菜亞硝酸鹽含量低[4]、氨基酸種類多[5]。此外，乳酸菌在食品加工工業(yè)中還有增添食品風(fēng)味、生物保鮮[6]等作用。宋文華等[7]利用混合乳酸菌發(fā)酵完成的紅薯葉乳酸含量高、質(zhì)地柔軟有韌性，但后續(xù)貯藏性研究尚未見報道。

發(fā)酵食品中較常見的貯藏方式有低溫、真空包裝、防腐劑以及殺菌處理。閆凱[8]研究表明，7 ℃冷藏條件下菌落總數(shù)在貯藏20 d后下降了約2個數(shù)量級，酵母菌數(shù)量也明顯下降，且長時間維持低水平。譚小琴等[9]研究了真空包裝酸肉在低溫貯藏過程中營養(yǎng)安全品質(zhì)及感官品質(zhì)變化，為傳統(tǒng)酸肉商品化冷鏈貯藏提供了適宜貨架期參考。添加防腐劑與殺菌處理相比，后者較為天然安全，大眾認(rèn)可度高，但不同殺菌方式對酸菜品質(zhì)有一定影響。試驗擬以乳酸菌發(fā)酵完成的酸菜為原料，真空包裝后以25 ℃、4 ℃、不同溫度時間巴氏殺菌后4 ℃貯藏，探究不同貯藏條件下的酸菜品質(zhì)變化，旨在為紅薯葉酸菜的貯藏技術(shù)和貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮紅薯葉：采摘自河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院紅薯實驗基地；

植物乳桿菌(LactobacillusplantarumHZLp-005)、鼠李糖乳桿菌(LactobacillusplantarumHZLr-023)、嗜酸乳桿菌(LactobacillusplantarumHZLa-008)：河南科技大學(xué)微生物實驗室-80 ℃冰箱貯藏；

食品級PA/PE包裝袋：喜之龍加厚24絲尼龍真空袋，河北省東光縣鑫鑫塑料有限公司；

乙酸鋅：分析純，天津市博迪化工有限公司；

亞硝酸鈉：基準(zhǔn)試劑，上海市化學(xué)試劑一廠；

N-1-萘乙二胺鹽酸鹽：分析純，天津市光伏精細(xì)化工研究所；

氨基苯磺酸：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

MRS培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基：生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

中性紅、結(jié)晶紫：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

豬膽鹽、乳糖：分析純，天津市河北區(qū)海晶精細(xì)化工廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

真空包裝機：DZ-400型，溫州市遠(yuǎn)康包裝機械有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH-S4型，北京科偉永興儀器有限公司；

紫外分光光度計：UV-2100型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-250型，北京市永光明醫(yī)療儀器公司；

色差儀：Color i5型，美國Xrite(愛色麗)公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與擴培 將植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌分別置于MRS液體培養(yǎng)基中活化，37 ℃培養(yǎng)18 h，將活化好的菌懸液分別按體積比1∶10擴大培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2 酸菜發(fā)酵 紅薯葉清洗入罐，以發(fā)酵罐體積計，加入2%食鹽、0.8%果葡糖漿、加水至半罐，倒入2%含培養(yǎng)基菌種(V植物乳桿菌∶V鼠李糖乳桿菌∶V嗜酸乳桿菌=1∶1∶1)，加水至滿罐，25 ℃發(fā)酵10 d。

1.2.3 包裝與貯藏 將發(fā)酵完成的紅薯葉酸菜真空包裝(抽真空11 s，熱封5 s)，每袋重量(150±5) g(含湯水)，分別于25 ℃、4 ℃、80 ℃-15 min殺菌后4 ℃、85 ℃-10 min 殺菌后4 ℃貯藏，每隔15 d取樣，貯藏90 d。

1.2.4 乳酸含量測定 稱取紅薯葉酸菜樣品100 g搗碎，取10 g加入30 g水打成勻漿，按GB/T 12456—2008測定乳酸含量，總酸酸度以乳酸計算。

1.2.5 亞硝酸鹽含量測定 稱取10 g紅薯葉酸菜加入30 g水打成勻漿，按GB 5009.33—2016測定亞硝酸鹽含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.031 48x+0.001 834，R2=0.999 7。

1.2.6 活菌數(shù)測定

(1) 乳酸菌數(shù)：按GB 4789.35—2016執(zhí)行。

(2) 酵母菌數(shù)：按GB 4789.15—2016執(zhí)行。

(3) 大腸桿菌數(shù)：按GB 4789.3—2016執(zhí)行。

(4) 總菌數(shù)：按GB 4789.2—2016執(zhí)行。

1.2.7 色澤測定 選取紅薯葉酸菜，流動水沖洗，瀝干，用保鮮膜包裹每片紅薯葉，利用色差儀測定酸菜色澤，測得L*和a*值。其中，L*代表亮度軸，0表示黑色，100表示白色；a*代表紅綠軸，正值代表紅，負(fù)值代表綠。

1.2.8 感官評價 選取10位食品專業(yè)人員按表1定期對紅薯葉酸菜進行感官評定，以總分平均分計(≥60分可食用)。

表1 感官評價表Table 1 Sensory evaluation form

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)采用Excel(2010)進行初步處理，使用Origin 2018作圖軟件和SPSS 15.0進行相關(guān)性和PCA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對紅薯葉酸菜pH值和乳酸含量的影響

由圖1可知，隨著貯藏時間的增加，各貯藏條件下的pH值均有所下降且下降趨勢大致相同，與黃慧福等[10]的結(jié)果一致，可能是隨著貯藏時間的增加，酸菜湯汁中殘余菌仍在發(fā)酵，產(chǎn)生了少量的酸，后期pH值較低，抑制了菌的生長，pH值趨于穩(wěn)定。

圖1 貯藏條件對pH值的影響Figure 1 Effects of different preservation conditionson pH value

由圖2可知，25 ℃和4 ℃下貯藏的乳酸含量先升高，貯藏第45天達最大值，分別為6.580，6.235 mg/g，后續(xù)又開始降低，可能是貯藏初期乳酸菌繼續(xù)產(chǎn)酸，后期pH較低，乳酸菌活性受到抑制，產(chǎn)酸能力降低。80 ℃-15 min和85 ℃-10 min下的乳酸含量變化情況相似，可能是經(jīng)殺菌后乳酸有部分流失，但貯藏前期不受影響，貯藏45 d后前者乳酸含量較高，說明該條件下乳酸流失較少。

圖2 貯藏條件對乳酸含量的影響Figure 2 Effects of different preservation conditions onlactic acid content

2.2 對紅薯葉酸菜亞硝酸鹽含量的影響

由圖3可知，貯藏期間亞硝酸鹽含量均在國標(biāo)限值(20 mg/kg)以下。25 ℃下貯藏第15天的亞硝酸鹽含量最高為8.852 mg/kg，常溫下雜菌活性較強，亞硝酸鹽生成加快，隨著雜菌在厭氧環(huán)境下逐漸死亡，逐漸被分解轉(zhuǎn)化，含量減少。4 ℃下貯藏0 d的亞硝酸鹽含量最低(6.226 mg/kg)，貯藏第90天含量比開始貯藏時高，說明隨著貯藏時間的增加，亞硝酸鹽積累速率大于分解速率，含量逐漸增多。貯藏第0天，80 ℃-15 min下的亞硝酸鹽含量比85 ℃-10 min的高，可能是殺菌溫度和時間對貯藏初期亞硝酸鹽降解有影響，高溫加快了亞硝酸鹽的降解。貯藏第0，90天，先殺菌后貯藏的紅薯葉酸菜的亞硝酸鹽含量比未殺菌的低，且差異極顯著(P<0.01)。貯藏第75 天，85 ℃—10 min下的亞硝酸鹽含量高于未殺菌組，可能是亞硝酸鹽還原菌活性較高，使亞硝酸鹽增多。

圖3 貯藏條件對亞硝酸鹽含量的影響Figure 3 Effects of different preservation conditions onnitrite content

2.3 對紅薯葉酸菜乳酸菌數(shù)的影響

酸菜發(fā)酵過程中乳酸菌占絕對的優(yōu)勢地位[11]，且乳酸菌活菌數(shù)越大，腐敗菌數(shù)量越小[12]。此外，乳桿菌和明串珠菌能通過抑制腸桿菌等硝酸鹽還原菌而降低亞硝酸鹽含量[13]。因此，一定數(shù)量的乳酸菌更有利于酸菜的貯藏。由圖4可知，貯藏過程中乳酸菌整體呈下降趨勢，原因是隨著貯藏時間的增加，乳酸菌活性逐漸減弱甚至死亡。25 ℃和4 ℃下貯藏第0天的乳酸菌數(shù)相同，貯藏第90天，25 ℃下的乳酸菌數(shù)降至5.00 lg(CFU/mL)，而4 ℃ 下的降至6.17 lg(CFU/mL)，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于殺菌后低溫貯藏的，可能是低溫下乳酸菌活性降低較慢，常溫下乳酸菌活性大，損失率上升從而數(shù)量下降，因此低溫貯藏有利于維持乳酸菌的活性從而穩(wěn)定乳酸菌數(shù)量。貯藏15 d后，80 ℃-15 min下的乳酸菌數(shù)比85 ℃-10 min的多，可能是前者殺菌溫度和時間適宜，能更有效地保留乳酸菌，隨著貯藏時間的延長，貯藏環(huán)境逐漸變酸，乳酸菌活性也逐漸減弱甚至死亡，數(shù)量逐漸下降。

圖4 貯藏條件對乳酸菌數(shù)的影響Figure 4 Effects of different preservation conditions onthe number of lactic acid bacteria

2.4 對紅薯葉酸菜酵母菌數(shù)的影響

酵母菌在pH 2.5～3.0的條件下也能存活，一些酵母菌會分泌聚半乳糖醛酸酶，使組織軟化，因此酵母菌的增長不利于酸菜貯藏。由圖5可知，25 ℃和4 ℃下貯藏第30天的酵母菌數(shù)最多，分別為6.38，6.80 lg(CFU/mL)，之后波動較小，可能是前期營養(yǎng)物質(zhì)豐富促進了酵母增長，之后隨著貯藏環(huán)境的變化逐漸死亡，達到與環(huán)境平衡后并保持穩(wěn)定，且二者差異不大，表明貯藏溫度對酵母菌增長無顯著影響。80 ℃-15 min和85 ℃-10 min下貯藏第45天的酵母菌數(shù)最少，貯藏后期又逐漸上升，原因是貯藏后期雜菌等微生物開始活躍，酵母菌也隨之增長，貯藏過程中二者變化相似，但數(shù)量始終低于未殺菌的。

圖5 貯藏條件對酵母菌數(shù)的影響Figure 5 Effects of different preservation conditionson the number of yeast

2.5 對紅薯葉酸菜大腸桿菌數(shù)的影響

由圖6可知，不同貯藏溫度下的大腸桿菌變化趨勢不同，25 ℃下的大腸桿菌數(shù)先增加后降低，貯藏第60天時最大，可能是大腸桿菌在適宜溫度下會利用營養(yǎng)物質(zhì)繁殖，隨著貯藏時間的增加，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少，且酸性越來越強，數(shù)量下降。4 ℃下貯藏的大腸桿菌數(shù)較低且變化不大，表明低溫條件下大腸桿菌活性較低，營養(yǎng)成分利用率也低。貯藏0 d，80 ℃-15 min下的大腸桿菌數(shù)最低，說明此條件能有效殺死部分大腸桿菌，而85 ℃-10 min 下的貯藏溫度高，但水浴時間短，殺滅大腸桿菌的效果低于前者。80 ℃-15 min下的大腸桿菌數(shù)低于其他3組，因此前者更適合作為酸菜的貯藏條件。

圖6 貯藏條件對大腸桿菌數(shù)的影響Figure 6 Effects of different preservation conditions onthe number of Escherichia coli

2.6 對紅薯葉酸菜總菌數(shù)的影響

初始原料中的微生物群落構(gòu)成很大程度上決定了泡菜發(fā)酵過程中的微生物群落構(gòu)成[14]。由圖7可知，隨著貯藏時間的延長，25 ℃下的總菌數(shù)整體呈下降趨勢，可能是占比最大的乳酸菌在常溫下?lián)p失率高，且貯藏后期環(huán)境不適宜，數(shù)量逐漸減少。4 ℃下貯藏初期總菌數(shù)一直下降，可能是某些微生物無法適應(yīng)低溫條件，在貯藏初期菌落呈線性下降[15]。80 ℃-15 min和85 ℃-10 min下總菌數(shù)均先下降后增長，可能是貯藏后期有酵母菌等其他雜菌滋生，說明長時間的貯藏不利于微生物的控制，與胡盼盼等[16]的結(jié)果一致，但菌落數(shù)始終在食用安全范圍內(nèi)。

圖7 貯藏條件對總菌數(shù)的影響Figure 7 Effects of different preservation conditions onthe number of total bacteria

2.7 對紅薯葉酸菜色澤的影響

色澤的變化在一定程度上被人們認(rèn)為是產(chǎn)品變質(zhì)的標(biāo)志[17]。由圖8可知，不同貯藏條件下的色澤變化趨勢不同。25 ℃下貯藏第0天的L*值最大為33.58，貯藏第90天的最小為18.21，亮度明顯降低，說明常溫不利于酸菜亮度的維持。4 ℃下貯藏亮度變化相對穩(wěn)定，低溫可能在一定程度上緩解了紅薯葉酸菜色澤的變化，且貯藏第90天的L*值為25.70，比貯藏第0天的降低了23.26%，說明較低貯藏溫度可以一直延緩褐變，保持較好的色澤[18]。貯藏第0天，殺菌后貯藏的亮度比未殺菌的低，說明殺菌溫度和時間對亮度有一定影響，可能是殺菌溫度和時間破壞了紅薯葉酸菜本身的色澤，導(dǎo)致亮度下降。4 ℃ 貯藏下的L*值的下降過程均比25 ℃下的緩慢，與曹秋閣[19]的研究相符。巴氏殺菌后貯藏第0，15，90天的L*值差異極顯著(P<0.01)，其中，80 ℃-15 min下亮度下降較慢，更適合酸菜的貯藏。

圖8 貯藏條件對L*值的影響Figure 8 Effects of different preservation conditionson L* value

由圖9可知，酸菜貯藏過程中a*值整體呈上升趨勢，說明隨著貯藏時間的延長，酸菜偏離綠色程度加重。25 ℃下貯藏第90天，a*值增加至2.73，增加了19.41%，偏離綠色程度比4 ℃貯藏下的大，說明低溫貯藏能有效減緩色澤丟失，抑制葉綠素含量的下降。貯藏第0天，與殺菌組相比，4 ℃下的a*值明顯升高且貯藏后期變化趨勢不同，可能是殺菌溫度和時間會導(dǎo)致酸菜色澤被破壞，且殺菌對貯藏過程有影響，殺菌后貯藏前期偏離綠色程度大，發(fā)生美德拉反應(yīng)，生成深色物質(zhì)[20]，加速了后期a*值的增大。80 ℃-15 min下的a*值偏離程度較小，可能是溫度低，氨基酸破壞程度小，美拉德反應(yīng)強度稍小。

圖9 貯藏條件對a*值的影響Figure 9 Effects of different preservation conditionson a* value

2.8 對紅薯葉酸菜感官評價的影響

由圖10可知，紅薯葉酸菜在不同貯藏條件下的感官評分均呈下降趨勢。25 ℃下的感官評分下降趨勢最大，貯藏第45天降至60分以下，已不能食用；4 ℃貯藏下的感官評分相近，其中未殺菌和85 ℃-10 min殺菌后4 ℃下貯藏第90天的感官評分降至60分以下，不具有食用價值。長時間貯藏會導(dǎo)致各種營養(yǎng)物質(zhì)慢慢消耗，顏色、風(fēng)味、口感等也慢慢流失，而低溫能有效減緩生物變化進程延緩品質(zhì)下降的趨勢。85 ℃-10 min下貯藏第75天的感官評分為61分，說明該條件下貯藏75 d后還能食用，而80 ℃-15 min下貯藏第90天的感官評分剛好達到食用臨界值，說明此條件下能貯藏90 d，且貯藏第0天的感官評分較高，可能是殺菌溫度較低，對色澤及口感影響較小，因此后者更適合酸菜的貯藏。

圖10 貯藏條件對感官評分的影響Figure 10 Effects of different preservation conditionson sensory evaluation

2.9 相關(guān)性及主成分分析

由表2可知，pH值與亞硝酸鹽呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與L*值、感官評分呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；乳酸菌數(shù)與酵母菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)、總菌數(shù)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。貯藏過程中殘余乳酸菌繼續(xù)發(fā)酵，乳酸含量上升，pH值下降，同時加速了亞硝酸鹽還原菌的活動，硝酸鹽還原率加快[21]，使得亞硝酸鹽含量上升。隨著貯藏時間的延長，微生物環(huán)境發(fā)生變化，增長的酵母菌和大腸桿菌使得總菌數(shù)增長，酸菜色澤偏離綠色程度增大，亮度和感官評分也隨之下降。紅薯葉酸菜貯藏期間各指標(biāo)存在不同程度的相關(guān)性，說明各指標(biāo)間存在信息重疊，部分品質(zhì)變化的同時會導(dǎo)致另外一些品質(zhì)發(fā)生改變，存在相互關(guān)聯(lián)、相互制約的關(guān)系[22]。

表2 貯藏期間各指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)?Table 2 Correlation coefficient of each index during preservation

通過線性變化，將存在相關(guān)性變量轉(zhuǎn)換成線性不相關(guān)的變量，將4種貯藏條件下9個指標(biāo)進行PCA分析，以特征值>1.0的原則提取出兩個成分，結(jié)果見表3和表4。由表3和表4可知，第一主成分貢獻值為3.468，方差貢獻率為38.538%，其中感官評分、L*值、pH值、亞硝酸鹽荷載量較大，是可以代表酸菜貯藏品質(zhì)的理化指標(biāo)；第二主成分貢獻值為2.714，方差貢獻率為30.150%，其中乳酸菌數(shù)、酵母菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)、總菌數(shù)荷載量較大，說明第二主成分主要包含酸菜的微生物指標(biāo)，兩個成分的累積貢獻率為68.689%，可反映貯藏酸菜品質(zhì)變化的大部分信息。

表3 主成分的特征值和貢獻率

表4 主成分的載荷系數(shù)Table 4 Load factor of principal component

3 結(jié)論

紅薯葉酸菜真空包裝后，25，4 ℃(未殺菌)貯藏與80 ℃-15 min、85 ℃-10 min殺菌后4 ℃貯藏相比，亞硝酸鹽含量以及總菌數(shù)均在食用安全范圍內(nèi)，但熱殺菌后亞硝酸鹽含量低、總菌數(shù)少，一定程度上減緩了酸菜變質(zhì)過程或者延長了貯藏時間，因此熱殺菌后的貯藏效果較好。25 ℃貯藏與4 ℃貯藏相比，亮度下降最快，說明低溫能有效減緩色澤變化，因此低溫更適合酸菜的貯藏。80 ℃-15 min殺菌后4 ℃貯藏90 d內(nèi)各指標(biāo)綜合性良好，感官品質(zhì)較優(yōu)，可作為酸菜貯藏的較佳條件，也為后期研究延長紅薯葉酸菜保質(zhì)期提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。相關(guān)性分析后通過主成分分析可得第1主成分主要反映酸菜貯藏品質(zhì)的理化指標(biāo)，第2主成分主要反映酸菜貯藏的微生物指標(biāo)，其中第1主成分中感官評分載荷量最大，最能說明酸菜的貯藏品質(zhì)情況。貯藏過程品質(zhì)變化的腐敗機理還有待研究，可對變質(zhì)酸菜的微生物進行分離鑒定，研究主要的腐敗菌種類。