劉子雄

謝國(guó)丹1

譚貴良2

鄭鴻濤1

董 海1

黃景輝3

(1. 中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 中山 528437；2. 電子科技大學(xué)中山學(xué)院，廣東 中山 528402；3. 廣東利誠(chéng)檢測(cè)技術(shù)有限公司，廣東 中山 528436)

低共熔溶劑(DES)是由一定化學(xué)計(jì)量比的氫鍵受體(如季銨鹽)和氫鍵給體(如醇、羧酸、氨基酸和糖等)通過(guò)分子間氫鍵作用組合而成的低共熔混合物[1]。其毒性低、綠色環(huán)保、可生物降解，可以作為不同物質(zhì)的萃取溶劑，且原料價(jià)格低廉、制作簡(jiǎn)便。Zhang等[2-4]將DES應(yīng)用于食品中合成著色劑及非法添加工業(yè)染料的檢測(cè)，張康迪等[5]將氯化膽堿/乙二醇組成的DES用于食用大豆油中抗氧化劑TBHQ的檢測(cè)，Zhao等[6]將脯氨酸/丙二醇組成的DES用于食品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，Shishov等[7]將四丁基溴化銨/丙二酸/乙酸3組分組成的DES用于雞肉中磺胺類獸藥殘留的檢測(cè)；在天然產(chǎn)物分析[8-13]和環(huán)境分析[14-17]方面也有相關(guān)應(yīng)用報(bào)道。但有關(guān)DES在食品中四環(huán)素類抗生素檢測(cè)分析中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。

四環(huán)素類抗生素是一類由放線菌屬產(chǎn)生的或半合成的廣譜抑菌劑，包括四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素等，可作用于多數(shù)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性敏感菌，臨床上用于立克次體、衣原體和支原體等所致感染。水產(chǎn)養(yǎng)殖中，因四環(huán)素類藥物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌等病原菌有效，故被廣泛用于預(yù)防和治療水產(chǎn)動(dòng)物疾病[18]。當(dāng)前，食品中四環(huán)素類抗生素定量檢測(cè)的主流方法為高效液相色譜法和液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法，其前處理過(guò)程分為兩種：① 使用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液或酸化乙腈提取，再經(jīng)固相萃取(SPE)小柱凈化，濃縮復(fù)溶后上機(jī)檢測(cè)[19-21]；② 用酸化乙腈—水體系提取目標(biāo)物，然后經(jīng)QuEChERS方法凈化后上機(jī)檢測(cè)[22-23]。兩種方法均會(huì)使用較多的有毒有機(jī)試劑，對(duì)環(huán)境不友好，且用SPE小柱凈化操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。試驗(yàn)擬使用DES這種新型、綠色萃取技術(shù)，結(jié)合超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法建立水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留的檢測(cè)分析方法，為實(shí)現(xiàn)市售水產(chǎn)品的快速定性和定量檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蝦、草魚、白鱔、多寶魚及三文魚等13 批水產(chǎn)品：市售；

蝦肉中四環(huán)素定量分析質(zhì)控樣品：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心；

蝦肉中四環(huán)素測(cè)定能力驗(yàn)證測(cè)試樣品：英國(guó)Fapas分析實(shí)驗(yàn)室；

甲醇：色譜純，德國(guó)Merck公司；

甲酸：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

氯化膽堿、乙二醇、丙三醇、丁二醇：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)鹽酸四環(huán)素(97.15%)、鹽酸土霉素(96.02%)、鹽酸金霉素(92.9%)及鹽酸強(qiáng)力霉素(99.3%)：德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超高效液相色譜—三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀： 1290/6460C型，帶Jet Stream電噴霧離子源(JetESI)，美國(guó)Agilent公司；

純水系統(tǒng)：Milli-Q Integral 3 System型，美國(guó)Millipore公司；

冷凍離心機(jī)：3-18 K型，德國(guó)Sigma公司；

分散機(jī)：T25 easy clean digital型，德國(guó)IKA公司；

超聲波清洗儀：SCQ-7201E型，上海聲彥超聲波儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DES的制備 選用氯化膽堿作為氫鍵受體，乙二醇、丙三醇和1,4-丁二醇作為氫鍵給體，按不同化學(xué)計(jì)量比稱量至250 mL雞心瓶中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，常壓下、70 ℃水浴攪拌，直至形成透明均一的液體，最終得到11 種不同類型的DES，詳見表1。

表1 不同類型的低共熔溶劑Table 1 Different types of DES

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及工作液的配制 準(zhǔn)確稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容至10.00 mL，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液。再分別取適量四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素儲(chǔ)備液，用甲醇定容至10.00 mL，得質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混標(biāo)中間工作液。繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時(shí)，根據(jù)樣品情況用陰性基質(zhì)提取液稀釋中間工作液至不同濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 儀器分析條件

(1) 色譜條件：InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(3.0 mm×150 mm，2.7 μm)；流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積5 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序：0.0 min，95% A；2.5 min，85% A；6.9～7.0 min，80% A；9.0～12.5 min，40% A；13.0 min，95% A。

(2) 質(zhì)譜條件：帶Jet Stream電噴霧離子源(JetESI)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；ESI+模式掃描；鞘氣流量11 L/min；鞘氣溫度350 ℃；霧化氣壓力0.31 MPa；噴嘴電壓500 V(ESI+)/1 000 V(ESI-)；毛細(xì)管電壓4 000 V(ESI+)/3 500 V(ESI-)；駐留時(shí)間20 ms，其他條件見表 2，質(zhì)譜圖見圖 1。

圖1 四環(huán)素類藥物質(zhì)譜圖Figure 1 Mass spectrum of tetracyclines

表 2 四環(huán)素類藥物的質(zhì)譜信息?Table 2 Mass parameters of tetracyclines

1.2.4 樣品前處理方法 稱取1.00 g樣品至15 mL帶刻度塑料離心管中，加入DES提取液3.0 mL，冰水浴10 min，均質(zhì)1 min，冰水浴超聲10 min，5 ℃、10 000 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至帶刻度15 mL離心管中；殘?jiān)屑尤?.0 mL DES提取液，重復(fù)提取1次，合并上清液，用初始流動(dòng)相定容至7.0 mL。過(guò)0.22 μm 聚四氟乙烯(PTFE)針式濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 DES條件優(yōu)化

(1) DES種類選擇：在1 g陰性蝦肉樣品中添加200 μL 的混標(biāo)中間工作液(1 μg/mL)，分別用制備好的DES進(jìn)行提取，按1.2.4的方法進(jìn)行檢測(cè)，考察DES種類對(duì)分析藥物提取效率的影響。

(2) DES含水量：在最優(yōu)DES中加入不同比例的水作為提取溶劑，按1.2.4的方法對(duì)1 g陰性加標(biāo)樣品(添加量200 ng)進(jìn)行檢測(cè)，考察低共熔溶劑含水量(80%，85%，90%，95%)對(duì)分析藥物提取效率的影響。

(3) DES溶劑pH：以蝦肉中四環(huán)素測(cè)定質(zhì)控樣為樣品，以最優(yōu)含水量下的最優(yōu)DES為提取溶劑1(pH 8.56)，在溶劑1中分別添加至含0.1%，0.5%，1.0%的甲酸后作為提取溶劑2(pH 2.60)、溶劑3(pH 2.25)和溶劑4(pH 2.07)，按1.2.4的方法進(jìn)行檢測(cè)；將GB/T 21317—2007 中Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH 4.0)作為提取溶劑5，考察低共熔溶劑pH對(duì)分析藥物提取效率的影響。

1.2.6 線性和檢出限的測(cè)定 取四環(huán)素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用陰性基質(zhì)提取液稀釋配置成 5.0，10.0，20.0，100.0，200.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.2.3的方法進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，各分析物定量離子的離子豐度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，考察標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍和相關(guān)系數(shù)。試驗(yàn)條件下，取陰性樣品1 g，加入不同濃度的混標(biāo)溶液，按1.2.4 的方法進(jìn)行前處理，上機(jī)檢測(cè)，依照信噪比為3(S/N=3)計(jì)算檢出限(LOD)。

1.2.7 方法精密度和準(zhǔn)確度的測(cè)定 方法精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示，按1.2.4的方法處理檢測(cè)，計(jì)算6次平行測(cè)定結(jié)果的RSD，以驗(yàn)證方法的精密度。準(zhǔn)確度以樣品加標(biāo)回收率表示，對(duì)試樣進(jìn)行3個(gè)濃度水平加標(biāo)，每個(gè)水平重復(fù)3 次，以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 使用安捷倫 Date Acquisition、Qualitative Analysis和 Quantitative Analysis工作軟件對(duì)研究的 4 種四環(huán)素類分析藥物的定量定性離子進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，保留時(shí)間和定性離子進(jìn)行定性，峰面積外標(biāo)法定量；用 Excel 軟件對(duì)DES條件優(yōu)化數(shù)據(jù)、精密度、回收率及樣品含量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法優(yōu)化

2.1.1 DES種類的選擇 DES制備過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，制備好的DES-10和DES-11冷卻至室溫(25 ℃)后會(huì)有結(jié)晶析出，是因?yàn)殡S著溫度的降低，DES組分之間的氫鍵被破壞，因此其不適用于室溫以下對(duì)目標(biāo)物的萃取，而另外9種 DES在室溫條件下呈液態(tài)，可用于后續(xù)研究。由圖2可知，DES-3和DES-6對(duì)4種四環(huán)素類藥物有較優(yōu)的提取效率，但對(duì)于金霉素，DES-6比DES-3有更優(yōu)的提取效率，所以選擇DES-6(氯化膽堿/丙三醇，摩爾比1∶4)作為試驗(yàn)方法的最佳提取溶劑。

圖2 溶劑對(duì)分析藥物提取效率的影響Figure 2 Effect of solvent types on extraction efficiencyof four analytes

2.1.2 DES含水量的選擇 親水性低共熔溶劑的黏度較大，不適合直接提取，且含水量是影響目標(biāo)組分提取效果的重要因素，加入適量的水可有效降低DES的黏度及調(diào)節(jié)其極性[11-12]。由圖3可知，當(dāng)?shù)凸踩廴軇┖坑?0%上升至95%時(shí)，四環(huán)素類藥物提取率均發(fā)生顯著變化，四環(huán)素呈增加趨勢(shì)，土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)含水量為90%時(shí)達(dá)最大值，綜合考慮選擇含水量為90%的DES-6進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 低共熔溶劑含水量對(duì)分析藥物提取效率的影響Figure 3 Extraction efficiency of analytes using DESwith different moisture content

2.1.3 DES溶劑pH的選擇 四環(huán)素類藥物在堿性條件下易生成異構(gòu)體，在較強(qiáng)酸性環(huán)境中(pH<2)易發(fā)生消去反應(yīng)生成脫水物，發(fā)生降解[20-21]。由表3可知，溶劑1處理結(jié)果遠(yuǎn)低于質(zhì)控樣的特性值，是因?yàn)槿軇?的pH處于弱堿性，四環(huán)素容易生成異構(gòu)體，從而影響結(jié)果；溶劑2、溶劑3、溶劑4、溶劑5處理結(jié)果均在特性值區(qū)間范圍內(nèi)，符合要求，且運(yùn)用DES前處理和運(yùn)用GB/T 21317—2007前處理結(jié)果無(wú)顯著差異，因此選擇溶劑2(pH 2.60)作為試驗(yàn)方法的最終提取溶劑。

表3 pH對(duì)四環(huán)素提取效率的影響Table 3 Effect of pH on extraction efficiency of tetracycline μg/kg

2.2 方法的線性和檢出限

由表4可知，各分析藥物均呈良好線性關(guān)系，r≥0.999 4。分析藥物的LOD為20.0 μg/kg，而GB/T 21317—2007中四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素的LOD均為50 μg/kg。綜上，試驗(yàn)方法具有較高的靈敏度。

表4 分析藥物的線性范圍和檢出限Table 4 Linear equations and limits of detection(LOD) of the analytes

2.3 方法的精密度和準(zhǔn)確度

由表5可知，RSD(n=6)為3.4%～5.2%，<10%；4種四環(huán)素類藥物在3個(gè)加標(biāo)水平下的加標(biāo)回收率為82.2%～102.8%，符合日常分析檢測(cè)的要求。

表5 回收率和精密度Table 5 Recovery and precision (n=6)

2.4 樣品檢測(cè)

運(yùn)用試驗(yàn)方法對(duì)市售的13批水產(chǎn)品(蝦6批，三文魚2批，草魚3批，白鱔及多寶魚各1批)、1批質(zhì)控樣及1批國(guó)際能力驗(yàn)證測(cè)試樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明，市售水產(chǎn)品中有1批次蝦肉分別檢出土霉素(64.8 μg/kg)和強(qiáng)力霉素(25.4 μg/kg)，而質(zhì)控樣品和國(guó)際能力驗(yàn)證樣品的檢出值均在給定已知的特性區(qū)間范圍內(nèi)，說(shuō)明試驗(yàn)建立的方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

建立了低共熔溶劑萃取—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(DES-UPLC-MS/MS)快速檢測(cè)水產(chǎn)品中的四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素的分析方法。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的SPE固相萃取凈化技術(shù)相比，試驗(yàn)方法前處理具有有機(jī)試劑用量少、毒害小、操作步驟簡(jiǎn)便及處理時(shí)間短等特點(diǎn)，且分析系統(tǒng)具有良好的線性關(guān)系和更低的檢出限，可用于水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留的快速定性和定量檢測(cè)。在DES條件優(yōu)化中，低共熔溶劑氫鍵受體和氫鍵給體選擇方面還是比較單一，后續(xù)可嘗試更多的組合來(lái)制備DES，從而尋求更優(yōu)的試驗(yàn)方案。