李永琴， 卜寧霞， 陳 娟， 馬 巖， 楊 奇

(寧夏獸藥飼料監(jiān)察所， 寧夏 銀川 750011)

優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的供給成為農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的迫切需求，但伴隨而來的質(zhì)量安全問題也成為阻撓畜產(chǎn)品高質(zhì)量發(fā)展的絆腳石，其中最突出的就是獸藥殘留問題。獸藥是一把“雙刃劍”，獸藥在動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)節(jié)防治動(dòng)物疾病、促進(jìn)生長(zhǎng)的同時(shí)，對(duì)靶動(dòng)物安全、接觸者的安全、環(huán)境生態(tài)安全、動(dòng)物性食品安全以及公共衛(wèi)生安全等都將構(gòu)成復(fù)雜而深刻的影響，獸藥不規(guī)范的使用，不可避免地會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)造成不同程度的殘存，過量殘存的獸藥或獸藥代謝物，相當(dāng)一部分還保留有一定的生物活性，如果通過食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)產(chǎn)生蓄積，即可對(duì)人體正常生理機(jī)能構(gòu)成影響，甚至引起直接的毒害作用[1-2]。獸藥殘留檢測(cè)分析是目前保障畜產(chǎn)品安全的有效手段，受獸藥種類、前處理方法、畜產(chǎn)品本身基質(zhì)等因素影響我國(guó)獸藥殘留檢測(cè)仍面臨前處理方法復(fù)雜耗時(shí)、檢測(cè)效率低、多種類藥物殘留聯(lián)檢技術(shù)缺乏等技術(shù)瓶頸，當(dāng)前獸藥殘留檢測(cè)工作仍難以實(shí)現(xiàn)對(duì)畜產(chǎn)品獸藥殘留質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)的全面分析與評(píng)價(jià)。因此，在獸藥殘留檢測(cè)中開發(fā)快速、簡(jiǎn)便的前處理技術(shù)及具有高靈敏度、高選擇性和良好重現(xiàn)性的檢測(cè)技術(shù)已成為未來獸藥殘留檢測(cè)的趨勢(shì)。

近年來動(dòng)物源性產(chǎn)品中多種類獸藥殘留的聯(lián)檢技術(shù)成為研究熱點(diǎn)，Desmarchelier等[3]建立了乳制品、魚類、蛋類食品中154種藥物殘留的LC- MS/MS檢測(cè)方法，涉及105種抗生素、41種抗寄生蟲藥、5種抗炎藥和3種鎮(zhèn)靜劑類藥物；Bessaire等[4]利用QuEChERS方法建立了雞蛋、牛奶、肉類等食品中23種內(nèi)酰胺類藥物的快速篩查方法；Goessens等[5]采用UHPLC- Orbitrap-HRMS對(duì)水產(chǎn)品中林可酰胺類、青霉素類、頭孢菌素類、二氨基嘧啶類、截短側(cè)耳素類和苯酚類等11類46種抗菌藥物殘留進(jìn)行全掃描快速篩查分析；孫雷等[6]利用超高壓液相色譜- 三重四級(jí)桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜開展了豬肉中14類92種獸藥殘留的高通量篩查和定量方法的研究，并采用MRM- IDA- EPI掃描模式提升了方法篩查準(zhǔn)確度；蔣定之等[7]針對(duì)禽蛋產(chǎn)品建立了磺胺及其增效劑類、喹諾酮類、硝基咪唑類、喹乙醇代謝物、吩噻嗪類等14類48種獸藥殘留的快速篩查檢測(cè)方法，以應(yīng)對(duì)雞蛋中禁限用藥物的快速檢測(cè)；李娜等[8]利用改進(jìn)的QuEChERS方法建立了禽肉、豬肉中4類29種禁限用獸藥殘留的檢測(cè)方法，解決了四環(huán)素類獸藥難與其他類獸藥同時(shí)檢測(cè)的難題；徐偉等[9]使用WondaPak QuEChERS多獸藥殘留專用提取包和凈化包建立了豬肉中8類125種藥物殘留的檢測(cè)方法，使前處理操作在20 min即可完成。這些國(guó)內(nèi)外研究均專注于通過建立快速的前處理技術(shù)和儀器全掃描分析模式，應(yīng)用一種檢測(cè)方法去實(shí)現(xiàn)畜產(chǎn)品中多種類藥物殘留的快速測(cè)定，以提升獸藥殘留檢測(cè)工作效率。

本研究為提升寧夏地區(qū)獸藥殘留分析工作效率和監(jiān)測(cè)水平，全面保障寧夏灘羊、肉牛、奶產(chǎn)業(yè)等特色畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，研建符合寧夏畜產(chǎn)品質(zhì)量安全保障工作需求的獸藥殘留檢測(cè)方法，從生產(chǎn)環(huán)節(jié)實(shí)際獸藥使用種類和國(guó)家規(guī)定禁限用藥物種類入手，確定篩查藥物種類。首先通過寧夏獸藥信息化監(jiān)管平臺(tái)對(duì)獸藥經(jīng)營(yíng)和使用環(huán)節(jié)的藥物使用情況進(jìn)行大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與調(diào)研，同時(shí)綜合考慮農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禁停用藥物名錄和GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定的有最大殘留限量的藥物，篩選確定生產(chǎn)環(huán)節(jié)不規(guī)范用藥可能會(huì)對(duì)寧夏肉牛產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展帶來風(fēng)險(xiǎn)隱患的獸藥種類，共12類。利用超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)與Oasis PRiME HLB固相萃取快速凈化前處理技術(shù)建立牛肉中多組分獸藥殘留聯(lián)檢應(yīng)用技術(shù)，開發(fā)一次進(jìn)樣可同時(shí)識(shí)別并分析12類80種獸藥及其代謝物的高通量檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)效率提升、參數(shù)擴(kuò)增、覆蓋面擴(kuò)大，希望為寧夏優(yōu)勢(shì)特色肉牛產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展和牛肉產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管提供重要的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg，6 mL)，美國(guó)Waters公司；0.22 μm微孔親水性聚丙烯濾膜，美國(guó)Waters公司；甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純，美國(guó)Fisher公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；標(biāo)準(zhǔn)品分別購(gòu)于德國(guó)DrEhrenstorfer GmbH公司、德國(guó)WITEGA公司及中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC- Xevo TQ- S micro型超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Waters公司；AE- 205型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；CT15RT型高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；氮吹儀，美國(guó)Organomation Associates公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品各約10 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確量取1 mg/mL的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確量取100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液各500 μL，于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2檢測(cè)條件

1.3.2.1 液相色譜條件

色譜柱使用Waters HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)，流動(dòng)相A為φ(甲酸)0.1%的水溶液，流動(dòng)相B為φ(甲酸)0.1%的甲醇溶液，柱溫為45 ℃，樣品盤溫度為10 ℃，進(jìn)樣量為2 μL，流動(dòng)相流速為0.45 mL/min。HPLC的梯度洗脫程序見表1。

表1 HPLC的梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of HPLC

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子源(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)采集模式；毛細(xì)管電壓3.5 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度600 ℃；脫溶劑氣流速度1 000 L/h；錐孔氣150 L/h；碰撞氣流速0.15 mL/min。80種獸藥及其代謝物的質(zhì)譜監(jiān)測(cè)參數(shù)見表2。

1.3.3前處理方法

準(zhǔn)確稱取2.50 g(精確至0.01 g)均質(zhì)好的牛肉樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入φ(甲酸)=0.2%且φ(乙腈)=80%的水溶液10 mL，旋渦振蕩，12 000 r/min高速離心5 min，取上清液待凈化。取Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg，6 mL)，不需要活化與平衡，直接取3 mL上清液過固相萃取柱，保持1秒1滴的流速，收集全部流出液，然后再準(zhǔn)確量取2 mL流出液，氮?dú)獯蹈桑? mLφ(甲酸)=0.1%且φ(甲醇)=10%的水溶液溶解，過0.22 μm微孔親水性聚丙烯濾膜，用HPLC- MS/MS測(cè)定分析。

表2 80種獸藥及其代謝物的質(zhì)譜監(jiān)測(cè)參數(shù)Tab.2 Mass spectrometry monitoring parameters of 80 veterinary drugs and their metabolites

續(xù)表2

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定藥物的選擇依據(jù)

本研究在檢測(cè)藥物的選擇從3個(gè)方面考慮，一是GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中明確規(guī)定有最大殘留限量的藥物及其同類藥物，在考慮國(guó)標(biāo)規(guī)定藥物的同時(shí)，將部分藥物的同類藥物納入選擇范圍，以緊追行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)，充分覆蓋養(yǎng)殖環(huán)節(jié)使用獸藥種類，包括8種氟喹諾酮類(表2中化合物序號(hào)15、24、25、69、73、75、76、77)、4種硝基咪唑類(化合物序號(hào)1、4、5、8)、2種激素類(化合物序號(hào)67、70)、7種苯并咪唑類(化合物序號(hào)9、17、23、29、39、46、53)、3種鎮(zhèn)靜劑類(化合物序號(hào)42、54、58)、21種磺胺類(化合物序號(hào)11、19、20、21、22、28、30、31、32、34、35、36、37、38、40、41、44、47、49、50、51)和泰妙菌素(化合物序號(hào)80)藥物；二是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2292號(hào)公告、250號(hào)公告中明確規(guī)定停止、禁止在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)使用的藥物及其他化合物[10]，包括4種氟喹諾酮類(化合物序號(hào)56、61、65、68)、21種β-激動(dòng)劑類(化合物序號(hào)3、10、12、13、14、16、18、26、27、33、43、45、48、52、55、57、59、62、71、72、78)和金剛烷胺類(化合物序號(hào)2、6、7)藥物；三是通過寧夏獸藥信息化管理平臺(tái)大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)掌握的在寧夏養(yǎng)殖環(huán)節(jié)大量使用，且不規(guī)范使用會(huì)造成獸藥殘留風(fēng)險(xiǎn)的藥物，包括3種氟喹諾酮類(化合物序號(hào)60、66、74)、土霉素(化合物序號(hào)79)、氨芐西林(化合物序號(hào)64)、頭孢氨芐(化合物序號(hào)63)藥物，共涉及12大類80種獸藥及其代謝物。此方法涉及藥物種類多，涵蓋參數(shù)廣，突破了傳統(tǒng)檢測(cè)方法只能夠?qū)σ阎幬锏膯我缓Y查，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)畜產(chǎn)品獸藥殘留質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)隱患的全方位評(píng)價(jià)分析。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1提取溶劑的優(yōu)化結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中選取不同溶劑提取化合物，包括乙腈、甲醇、φ(甲酸)=0.2%的乙腈溶液(以下稱為甲酸乙腈溶液)、φ(甲酸)=0.2%且φ(乙腈)=80%的水溶液(以下稱為甲酸乙腈水溶液)4種溶劑。結(jié)果表明：乙腈與甲醇相比，提取效率更高，上機(jī)后化合物整體峰形和提取率都偏高，但仍不能完全滿足正離子化合物檢測(cè)需求；不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸乙腈和甲酸乙腈水溶液比較，甲酸乙腈水溶液更適合多種類藥物提取，能夠顯著提高喹諾酮類、四環(huán)素類等常規(guī)適宜水相溶劑提取的藥物；選擇不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸乙腈水溶液進(jìn)行目標(biāo)化合物提取，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲酸濃度過高會(huì)對(duì)磺胺類等化合物回收率有影響，當(dāng)甲酸乙腈水溶液作為提取溶劑時(shí)80種獸藥及其代謝物的回收率均可保持在60%～120%范圍內(nèi)，能夠充分滿足GB/T 27417—2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》中對(duì)化合物分析正確度的要求[11]，且提取效果明顯高于其他溶劑，故本實(shí)驗(yàn)最終選取甲酸乙腈水溶液作為提取液。不同提取溶劑時(shí)80種獸藥及其代謝物結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取溶劑時(shí)80種獸藥及代謝物平均回收率Fig.1 Average recoveries of 80 veterinary drugs and their metabolites with different extraction solvents

2.2.2固相萃取柱的優(yōu)化結(jié)果

固相萃取技術(shù)是一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的分離技術(shù)，能夠選擇性去除干擾雜質(zhì)，獲得高靈敏度，是獸藥殘留分析中最常用的凈化方式。動(dòng)物源性食品樣品中存在大量的磷脂，非常容易干擾部分化合物分析定量，同時(shí)影響色譜柱壽命及儀器維護(hù)成本。本研究利用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱進(jìn)行樣品凈化，能有效去除磷脂等干擾雜質(zhì)，提高檢測(cè)工作的準(zhǔn)確性[12-13]。同時(shí)，其通過式的凈化處理策略能極大提高樣品分析通量，使樣品流速更快且不容易被堵，也極大地提高了檢測(cè)效率，使樣品處理過程簡(jiǎn)單高效，非常適用于檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)大批量的日常分析檢測(cè)。

2.3 方法定量限與線性范圍

準(zhǔn)確量取100 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2.50 g空白牛肉組織中制成1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/kg添加，前處理后上機(jī)測(cè)定，依據(jù)信噪比(S/N)≥10，綜合各類藥物的精密度和準(zhǔn)確度，保證每種獸藥及其代謝物都能夠滿足檢測(cè)定性定量要求，確定12大類80種藥物及代謝物的定量限在2.0～5.0 μg/kg，見表2。

準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用φ(甲酸)=0.1%且φ(甲醇)=10%的水溶液配制成濃度為1.0、2.5、5.0、25.0 、50.0 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，取空白樣品前處理氮吹后的殘留物5份，依次加入配制好的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1 mL,充分溶解后得空白基質(zhì)匹配系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，過濾后上機(jī)測(cè)定，可最大程度降低基質(zhì)影響。每個(gè)濃度進(jìn)3針，以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。80種藥物及代謝物在1.0～50.0 μg/L呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.990，見表3。

2.4 方法精密度與準(zhǔn)確度

將空白牛肉樣品進(jìn)行 2.0、5.0、50.0、100.0 μg/kg質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液加標(biāo)后，按照前處理方法處理后上機(jī)，平行測(cè)試5份樣品，重復(fù)3 次考察回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。從表3中實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出本方法牛肉中80種藥物及代謝物在2.0 μg/kg加標(biāo)濃度的平均回收率為 60.0%～103.0%，批間RSD為0.4%～18.7%；5.0 μg/kg加標(biāo)濃度的平均回收率為69.8%～99.5%，批間RSD為0.3%～17.1%；50 μg/kg加標(biāo)濃度的平均回收率為67.7%～99.7%，批間RSD為0.4%～19.6%；100 μg/kg加標(biāo)濃度的平均回收率為 64.5%～92.5%，批間RSD為0.4%～18.1%。牛肉中80種獸藥及其代謝物的加標(biāo)回收率與精密度見表3。

表3 牛肉中80種獸藥及其代謝物的加標(biāo)回收率與精密度Tab.3 Recovery rate and precision of 80 veterinary drugs and their metabolites in beef %

續(xù)表3

續(xù)表3

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

利用本方法對(duì)來自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的40批牛肉進(jìn)行藥物殘留檢測(cè)，結(jié)果按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中各類藥物及其代謝物的最大殘留限量進(jìn)行判定。結(jié)果顯示，有1批牛肉樣品中檢出土霉素殘留，殘留量為54.5 μg/kg，GB 31650—2019中規(guī)定牛肉肌肉組織中其最大殘留限量為100 μg/kg，屬合格產(chǎn)品；2批樣品檢出磺胺類藥物，殘留量分別為磺胺間甲氧嘧啶23.3 μg/kg和35.4 μg/kg，GB 31650—2019中規(guī)定牛肉肌肉組織中磺胺類藥物最大殘留限量為100 μg/kg，屬于合格產(chǎn)品；1批檢出恩諾沙星殘留，殘留量為118 μg/kg，GB 31650—2019中規(guī)定牛肉肌肉組織中其最大殘留限量為100 μg/kg，屬于不合格產(chǎn)品。本研究同時(shí)應(yīng)用國(guó)標(biāo)方法GB/T 21317—2007《動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測(cè)方法 液相色譜- 質(zhì)譜法》[14]、GB/T 20759—2006《畜禽肉中十六種磺胺類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法》[15]和GB/T 21312—2007 《動(dòng)物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測(cè)方法 液相色譜- 質(zhì)譜 質(zhì)譜法》[16]3種方法分別對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的牛肉樣品進(jìn)行復(fù)檢，4份陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果分別為土霉素殘留58.6 μg/kg，2份磺胺間甲氧嘧啶殘留分別為26.1 μg/kg和31.2 μg/kg，恩諾沙星殘留115 μg/kg。從牛肉陽(yáng)性樣品經(jīng)國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法檢測(cè)驗(yàn)證表明：本研究方法定性定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能夠滿足動(dòng)物源性食品殘留檢測(cè)的需求。

3 結(jié) 論

本檢測(cè)方法選擇甲酸乙腈水作為提取溶劑，采用通過式固相萃取凈化技術(shù)，有效去除樣品中的蛋白、磷脂等干擾雜質(zhì)，建立快速、高效的樣品前處理方法。采用Waters公司HSS T3色譜柱提升多種類化合物的分離度和靈敏度，利用超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式實(shí)現(xiàn)對(duì)80種獸藥及其代謝物的準(zhǔn)確定性定量分析。

本方法根據(jù)歐盟2002/657/EC和我國(guó)農(nóng)牧發(fā)[2003]1號(hào)文規(guī)定進(jìn)行殘留量測(cè)定方法學(xué)考察驗(yàn)證，方法的線性范圍、回收率和精密度等參數(shù)均能滿足我國(guó)和歐盟的規(guī)定，方法具有較高的重現(xiàn)性和可操作性，能夠滿足對(duì)牛肉中80種藥物及代謝物殘留定性和定量分析的要求。本方法可以實(shí)現(xiàn)一針進(jìn)樣同時(shí)測(cè)定80種獸藥及代謝物的殘留，解決了使用常規(guī)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)多類藥物多種前處理方法復(fù)雜耗時(shí)的技術(shù)難題，有效提升了獸藥殘留檢測(cè)效率，通過方法在牛肉產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用，可有效提升牛肉獸藥殘留風(fēng)險(xiǎn)隱患的排查能力。