張婧，茍園園，張林，刁攀婭

重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院，重慶 402260

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，直腸與乙狀結(jié)腸交界處是其好發(fā)部位［1］。結(jié)腸癌發(fā)病率位于我國癌癥發(fā)病率第二位［2］，且病死率較高。結(jié)腸癌患者平均5年生存率約為50%，而晚期患者5年生存率則低于10%［3］。因此，積極尋找有意義的結(jié)腸癌生物學指標，研究其與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，對結(jié)腸癌患者早發(fā)現(xiàn)、早治療及預(yù)后判斷有重要意義。去泛素化酶（USP22）是一種泛素特異性蛋白酶，屬于去泛素蛋白酶家族［4］，在人體腦、骨骼肌、心臟細胞中均有表達，而在肝臟和肺臟中的表達水平較低。USP22具有多種生物學功能，如調(diào)節(jié)細胞生長周期、細胞分化及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等［5］。有研究報道，USP22在多種腫瘤（胃癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌等）細胞中也呈高表達狀態(tài)［6-8］。叉頭框蛋白M1（FoxM1）屬于Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)有一個螺旋的DNA結(jié)構(gòu)域。有文獻報道，F(xiàn)oxM1在基底細胞癌、肝細胞癌、肺癌及乳腺癌細胞中均呈高表達狀態(tài)［9］，并且具有調(diào)節(jié)細胞生長周期、促進腫瘤細胞增殖及分化的作用［10］。本研究探討結(jié)腸癌組織中USP22、FoxM1蛋白表達變化及臨床意義，為患者治療及預(yù)后評估提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年3月—2017年12月在本院住院治療的結(jié)腸癌患者198例，男135例，女63例；年齡41～68（55.1±3.9）歲，≥55歲128例，＜55歲70例；腫瘤直徑＜5 cm90例，≥5 cm 108例；結(jié)腸癌中低分化119例，高分化79例；Duke's分期：A期69例，B期53例，C期48例，D期28例；腫瘤浸潤深度：T1～283例，T3～4115例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例。納入標準：未接受過抗腫瘤治療；臨床資料完整，患者或家屬簽署知情同意書。排除標準：合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；合并重要臟器疾??；免疫系統(tǒng)功能障礙。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 結(jié)腸癌組織及癌旁組織中USP22、FoxM1蛋白表達檢測 采用免疫組化法。取結(jié)腸癌組織及距離腫瘤邊緣大于5 cm的癌旁組織，用甲醛固定后石蠟包埋，使用切片機將組織切成厚度為4μm的切片。切片脫蠟，再經(jīng)過無水乙醇等梯度水化后PSB緩沖液清洗3次，每次5 min。再將切片放入檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）中，100℃加熱維持25 min，室溫冷卻，PSB清洗3次，每次5 min。3%過氧化氫浸泡10 min，去除內(nèi)源性過氧化氫酶，PSB清洗。分別滴加100μL USP22、FoxM1的一抗（稀釋比例1∶100，Abnova公司），4℃過夜，復(fù)溫30 min后PSB清洗，再滴加100μL二抗，37℃溫育30 min，PSB清洗。擦干切片后DAB（DAKO公司）顯色5 min，流水沖洗后蘇木素復(fù)染1 min，流水沖洗后再次乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，晾干。運用Leica DC200圖像分析系統(tǒng)收集圖像并分析（×400）。隨機選取5個視野，每個視野選取100個細胞，根據(jù)細胞的染色強度及細胞陽性百分數(shù)進行綜合評分。染色強度評分：無色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。細胞陽性百分比評分：≤10%計1分，＞10%～50%計2分，＞50%～70%計3分，＞70%計4分，兩項評分相乘得0～2為陰性，≥3為陽性［6］。

1.3 隨訪 從患者出院起，每2～3個月隨訪1次，包括電話隨訪或門診隨訪兩種方式，隨訪3～36個月，直至2020年12月或患者死亡，收集患者生存數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；預(yù)后分析采用Kaplan-Meier生存分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織與癌旁組織中USP22、FoxM1蛋白表達比較 結(jié)腸癌組織與癌旁組織中USP22蛋白陽性表達率分別為52.5%（104/198）、31.8%（63/198）；結(jié)腸癌組織與癌旁組織中FoxM1蛋白陽性表達率分別為59.5%（118/198）、32.3%（64/198）。與癌旁組織比較，結(jié)腸癌組織中USP22、FoxM1蛋白陽性表達率高（P均＜0.05）。

2.2 結(jié)腸癌組織中USP22、FoxM1蛋白表達陽性與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 結(jié)腸癌組織中USP22、FoxM1蛋白表達陽性與患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.3 結(jié)腸癌組織中USP22、FoxM1蛋白表達與患者預(yù)后的關(guān)系 198例結(jié)腸癌患者均隨訪成功。3年內(nèi)，共有60例患者死亡，3年生存率為69.70%。USP22蛋白表達陽性患者3年生存率為60.58%（63/104），陰性患者3年生存率為79.79%（75/94），比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。FoxM1蛋白表達陽性患者3年生存率為63.56%（75/118），陰性患者3年生存率為78.75%（63/80），比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

目前結(jié)腸癌的治療方式主要有手術(shù)切除及放化療。雖然醫(yī)療技術(shù)已經(jīng)取得重大進步，但是結(jié)腸癌患者的發(fā)病率和病死率仍不容樂觀。我國晚期結(jié)腸癌患者的5年生存率僅為8%，早發(fā)現(xiàn)、早治療是提高結(jié)腸癌患者預(yù)后的有效手段［11］。因此，更深入了解結(jié)腸癌的發(fā)病機制對于患者治療及預(yù)后有重要意義。

USP22是去泛素蛋白酶家族的新成員，位于人類第17號染色體上，由14個外顯子組成，負責編碼500多個氨基酸［12］。USP22是SAGA（Spt-Ada-Gcn5-乙酰轉(zhuǎn)移酶）的亞基，可使組蛋白H2A和H2B去泛素化和乙?；哉{(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和表達［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，USP22基因是與腫瘤密切相關(guān)的11個基因之一，在胃癌及乳腺癌腫瘤細胞中呈高表達狀態(tài)，并且可以有效預(yù)測癌癥的治療效果［14］。USP22在調(diào)節(jié)細胞生長周期、胚胎發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要的作用。高表達的USP22與結(jié)腸癌的預(yù)后密切相關(guān)［15］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中USP22蛋白陽性表達率遠高于癌旁組織?？赡芤驗閁SP22的去泛素化作用導(dǎo)致抑癌基因p53乙酰化程度降低，進一步抑制了p53介導(dǎo)的細胞凋亡，使得腫瘤細胞增殖速度加快，促進腫瘤細胞的生長［16］。本研究結(jié)果還顯示，結(jié)腸癌組織中的USP22表達與腫瘤Duke's分期、分化程度有關(guān)。其原因可能為USP22通過抑制靶基因BMI-1、c-Myc、p53，同時上調(diào)p16INK4a、p14ARF的表達來介導(dǎo)腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞的惡性進展，使Duke's分期增高［17］。研究結(jié)果還顯示，結(jié)腸癌組織中的USP22表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，機制可能為USP22上調(diào)BMI-1、Cyclin D2的表達，而BMI-1通過調(diào)節(jié)E-cadherin的表達來促進腫瘤細胞遷移和侵襲［18］。

FoxM1位于人類染色體12p13.3，由10個外顯子組成，在全身各個組織具有增殖能力的細胞中均表達。FoxM1具有多種生物學功能，例如調(diào)節(jié)細胞周期、抑制癌細胞的增殖和遷移等［19］。FoxM1在多種腫瘤細胞中呈高表達狀態(tài)，如宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌等［12］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1參與腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移過程，如FoxM1的過表達會導(dǎo)致間充質(zhì)細胞活化進一步激活胰腺癌細胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化與癌癥干細胞標志物轉(zhuǎn)錄過程［20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中FoxM1蛋白表達上調(diào)。機制可能為FoxM1與β-catenin結(jié)合并激活了Wnt/β-catenin信號通路，促進癌細胞的增殖，使得腫瘤惡性程度增高［12］。本研究結(jié)果還顯示，結(jié)腸癌組織中的FoxM1蛋白表達與腫瘤Duke's分期和分化程度有關(guān)。原因可能是FoxM1通過上調(diào)SKP1-Cullin1-F-box泛素連接酶復(fù)合物表達來誘導(dǎo)p27、p21的降解，促進腫瘤的惡性進展，使得腫瘤細胞的Duke's分期進一步增高［21］。研究結(jié)果還顯示，結(jié)腸癌組織中的FoxM1表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，機制可能為下調(diào)結(jié)腸癌組織中E-cadherin蛋白及其mRNA的表達［22］，促進腫瘤細胞的浸潤、遷襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，縮短了結(jié)腸癌患者生存時間。

本研究中USP22與FoxM1蛋白表達陽性患者的3年生存率均低于陰性患者，表明了兩指標均具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。USP22可使β-catenin去泛素化，而去泛素化的β-catenin又與FoxM1結(jié)合促進腫瘤細胞的增殖、遷襲及轉(zhuǎn)移［12］。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中的USP22與FoxM1的表達均升高，與腫瘤細胞Duke's分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，這為結(jié)腸癌的診斷、治療及評估預(yù)后的過程中提供可靠的依據(jù)。但是兩指標在結(jié)腸癌發(fā)展過程中的具體作用機制尚不明確，還需大樣本的研究來進一步證實。