肖超，肖佑，肖戈，潘燎，王曉燕，王真權(quán)

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸科，長沙 410005

結(jié)腸癌是全球第三大常見惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡率居第4位的惡性腫瘤，目前其治療仍然是以手術(shù)為主的綜合治療［1-2］。術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者生命質(zhì)量降低和生存時(shí)間縮短的主要原因，目前臨床主要通過隨訪和影像學(xué)檢查評估術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，缺乏相關(guān)生物標(biāo)志物［3］。微小RNA（miRNA）是一類非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)，與細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)［4］。miR-320a為miR-320家族一員，在肝癌、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤等惡性腫瘤組織中呈低表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等行為［5-6］。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)基因1（MACC1）是一種參與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基因，結(jié)腸癌組織中MACC1水平上調(diào)常預(yù)示腫瘤生物學(xué)行為向惡性轉(zhuǎn)變［7-8］。本研究通過觀察結(jié)腸癌患者血清miR-320a表達(dá)、MACC1水平變化，探討二者與結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本院2017年1月—2018年5月收治的結(jié)腸癌患者102例（結(jié)腸癌組），均行根治性切除術(shù)治療。其中男53例，女49例；年齡32～82（52.54±6.78）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為結(jié)腸癌；初次診斷，未接受相關(guān)抗腫瘤治療；TNM分期［9］Ⅰ～Ⅲ期；年齡≥18歲；臨床資料和隨訪資料完整；患者及家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤廣泛浸潤周圍組織；妊娠期；不能耐受CO2氣腹；合并嚴(yán)重心、肝、腎、肺疾病，不能耐受手術(shù)；術(shù)前全身狀況不良未糾正；血液、免疫系統(tǒng)疾??；急性梗阻、穿孔等結(jié)腸癌急診手術(shù)；失訪、不能接受隨訪或隨訪期間非腫瘤進(jìn)展導(dǎo)致死亡。另選取同期結(jié)腸良性病變患者63例為對照組，男33例，女30例；年齡18～82（52.44±5.17）歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（BDCIR 20200668）

1.2 血清miR-320a表達(dá)及MACC1水平檢測 采集兩組入院次日清晨空腹靜脈血6 mL，3 000 r/min離心10 min（離心半徑8 cm），取血清置于-80℃冰箱中待檢。取部分血清用TRIzol試劑提取血清總RNA，NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)驗(yàn)證RNA濃度和純度（OD260/OD280為1.8～2.0），TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)qRT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。miR-320a正向引物：5'-ATGAGAAAAAGCTGGGTTGAGA-3'，反 向 引 物：5'-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3'。內(nèi)參GAPDH正向引物：5'-AGAGAAGATTAGCATGGACCCTG-3'，反向引物：5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'。反應(yīng)體系：cDNA 1μL、引 物0.3μL、SYBRPremix Ex TaqⅡMix 5μL、ddH2O 3.4μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s循環(huán)40次。用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-320a相對表達(dá)量。另取3 mL血液樣本用ELISA法檢測血清MACC1水平，試劑盒由江西艾博因生物科技有限公司提供。

1.3 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移隨訪 結(jié)腸癌患者術(shù)后定期行腹部CT、B超、組織病理學(xué)檢查，統(tǒng)計(jì)術(shù)后3年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移定義為根治術(shù)后再次出現(xiàn)與原發(fā)灶相關(guān)的惡性腫瘤或出現(xiàn)盆腔轉(zhuǎn)移灶，伴或不伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)法；結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素分析采用多因素Cox回歸；受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-320a、MACC1水平對結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值，曲線下面積比較采用Z檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-320a表達(dá)、MACC1水平比較 與對照組比較，結(jié)腸癌組血清miR-320a表達(dá)低，MACC1水平高（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組血清miR-320a表達(dá)、MACC1水平比較（±s）

表1 兩組血清miR-320a表達(dá)、MACC1水平比較（±s）

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2.2 結(jié)腸癌患者血清miR-320a表達(dá)與MACC1水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，結(jié)腸癌患者血清miR-320a表達(dá)與MACC1水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.672，P＜0.05）。

2.3 結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素 術(shù)后隨訪4～36個(gè)月，中位隨訪時(shí)間22個(gè)月。102例結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移26例，其中局部復(fù)發(fā)9例、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移17例（腦轉(zhuǎn)移2例、肺轉(zhuǎn)移3例、肝轉(zhuǎn)移7例、其他部位單發(fā)或多發(fā)轉(zhuǎn)移5例）。

2.3.1 單因素分析結(jié)果 血管侵犯、TNM分期Ⅲ期、miR-320a相對表達(dá)量≥0.91、MACC1≥7.18 ng/mL是結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素（P均＜0.05）。見表2。

表2 結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響因素的單因素分析（例）

2.3.2 結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響因素的多因素分析結(jié)果 以血管侵犯（有=1，無=0）、TNM分期（Ⅲ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0）、miR-320a（≥0.91=1，＜0.91=0）、MACC1（≥7.18 ng/mL=1，＜7.18 ng/mL=0）為自變量，隨訪時(shí)間為時(shí)間變量，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移（是=1，否=0）為因變量，結(jié)果顯示，血管侵犯、TNM分期Ⅲ期、MACC1≥7.18 ng/mL是結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，miR-320a≥0.91是獨(dú)立保護(hù)因素（P均＜0.05）。見表3。

表3 結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的多因素Cox回歸分析

2.4 血清miR-320a表達(dá)、MACC1水平對結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值 當(dāng)血清miR-320a表達(dá)為0.97時(shí)，預(yù)測結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的曲線下面積、敏 感 度、特 異 度分 別 為0.799（95%CI：0.708～0.872）、92.31%、60.53%；當(dāng)血清MACC1水平為9.60 ng/mL時(shí)，預(yù)測結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的曲線下面積、敏感度、特異度分別為0.812（95%CI：0.723～0.883）、61.54%、92.11%。miR-320a＋MACC1預(yù)測結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的曲線下面積為0.916（95%CI：0.845～0.962），敏感度、特異度分別為84.62%、88.16%。二者聯(lián)合預(yù)測結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的曲線下面積大于分別單獨(dú)預(yù)測（P均＜0.05）。

3 討論

miRNA是內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)部分或完全匹配結(jié)合，降解靶基因mRNA的功能或抑制靶基因mRNA的蛋白質(zhì)翻譯［4］。近年來越來越多的研究表明，miRNA與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，可通過靶向特定的癌基因或抑癌基因來調(diào)控腫瘤進(jìn)展中的重要功能［10］。miR-320a位于人染色體8p21.3，其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究顯示，miR-320a能通過抑制叉頭盒轉(zhuǎn)錄基因M1抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲［11］。miR-320a能通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1/血管內(nèi)皮生長因子A軸抑制子宮內(nèi)膜癌增殖、遷移、侵襲［12］。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組血清miR-320a表達(dá)低于對照組，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者miR-320a≥0.91比例明顯降低，提示miR-320a可能與結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。進(jìn)一步通過多因素Cox回歸分析顯示，miR-320a≥0.91是結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立保護(hù)因素，表明miR-320a與結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-320a表達(dá)能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲［13］。李沛等［14］發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-320a表達(dá)能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了上述研究結(jié)果，但關(guān)于miR-320a調(diào)控結(jié)腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明確。

惡性腫瘤非單一行為和性質(zhì)的腫塊，其是由無數(shù)個(gè)癌細(xì)胞構(gòu)成的復(fù)雜群落，肆意繁殖會(huì)不斷擴(kuò)大病灶，腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，部分細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)基因突變，最終獲得轉(zhuǎn)移能力，經(jīng)局部浸潤和侵犯血管外滲后轉(zhuǎn)移到其他器官［15］。本研究結(jié)果也顯示，血管侵犯是結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。MACC1為肝細(xì)胞生長因子/肝細(xì)胞生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。最初研究發(fā)現(xiàn)，MACC1具有促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力［7］。近年多項(xiàng)研究證實(shí)，MACC1能通過激活肝細(xì)胞生長因子/met信號通路促進(jìn)癌細(xì)胞生長、上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)降解、誘導(dǎo)血管生成等途徑促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移［16-17］。本研究結(jié)果也顯示，結(jié)腸癌組血清MACC1水平明顯提升，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者≥7.18 ng/mL比例明顯增加，是結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。但本研究中，單獨(dú)MACC1預(yù)測結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的曲線下面積僅0.812，敏感度較低；同時(shí)miR-320a預(yù)測結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的曲線下面積為0.799，特異度較低。提示單獨(dú)miR-320a和MACC1對結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移雖然具有一定預(yù)測價(jià)值，但二者敏感度與特異度相對不足。本研究通過分析結(jié)腸癌患者血清miR-320a與MACC1水平的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。ZHANG等［13］研究也報(bào)道，miR-320a可通過誘導(dǎo)特異性蛋白1下調(diào)抑制MACC1/met通路，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲。結(jié)合本研究結(jié)果我們推測miR-320a與MACC1共同參與結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，可能存在靶向關(guān)系，但還需進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，miR-320a＋MACC1預(yù)測結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的曲線下面積為0.916，較二者單獨(dú)預(yù)測顯著增加，敏感度和特異度為84.62%、88.16%，提示二者聯(lián)合預(yù)測能提升結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測價(jià)值。

綜上所述，結(jié)腸癌患者血清miR-320a表達(dá)降低，MACC1水平提升，二者與結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測指標(biāo)。但本研究隨訪時(shí)間較短，還需多中心研究證實(shí)，并進(jìn)一步分析miR-320a與MACC1的關(guān)系。