補娟，史深，周玲，張曉玲，葉勒丹·馬漢，朱沂

1新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究與轉(zhuǎn)化中心，烏魯木齊 830001；2新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心；3新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

含NLR家族Pyrin域蛋白3（NLRP3）炎癥小體是由斑點樣蛋白、NLRP3和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1前體（Pro-caspase-1）組成的多聚蛋白化合物?；罨腘LRP3炎癥小體導(dǎo)致Caspase-1活化，介導(dǎo)炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放，進而促進炎癥反應(yīng)以及細胞焦亡［1］。NLRP3炎癥小體活化失調(diào)會導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生［2］。抑制NLPR3炎癥小體的激活可能是治療這些疾病的潛在靶點，但目前臨床還未見靶向NLPR3炎癥小體的治療藥物。隨著深入研究，在動物實驗中發(fā)現(xiàn)了效果較好的NLPR3炎癥小體抑制劑［3-4］。但這些藥物存在特異性不強、半衰期短、生物利用度差、臨床應(yīng)用前景不明等缺點，需要進一步尋找靶向NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑。刺槐素又稱刺槐黃素、金合歡素，屬黃酮類化合物，可從菊花、刺槐、雪蓮等多種植物中提取獲得，相對分子質(zhì)量小，易通過血腦脊液屏障，不良反應(yīng)小，具有多種藥理活性。目前研究發(fā)現(xiàn)，刺槐素可以誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制癌細胞存活發(fā)揮抗癌作用［5-6］。刺槐素通過抑制NF-κB、MAPK通路下調(diào)TNF-α和IL-1β的表達，發(fā)揮抗炎作用，對動物模型的關(guān)節(jié)炎、帕金森?。≒D）等炎性疾病具有治療作用［7］。但刺槐素作用靶點和具體機制尚不明確。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，刺槐素和NLRP3炎癥小體有關(guān)［8］，但是刺槐素是直接作用于NLRP3炎癥小體，還是通過抑制腦缺血再灌注損傷后的級聯(lián)反應(yīng)間接抑制NLRP3炎癥小體的表達尚不明確。本研究于2019年11月—2020年11月探討刺槐素對尼日利亞菌素（Nigericin）誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活的影響，為其成為靶向NLRP3炎癥小體的候選藥物奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 12周SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量（25±2）g，購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心，許可證號：SCXK（新）2016-0001；給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，室溫保持在22～26℃，濕度45%～60%。本實驗嚴格遵循科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。胎牛血清（FBS）購自上海Excell Bio公司；DMEM（高糖）培養(yǎng)基、胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗均購自美國GIBCO公司；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF）、脂多糖（LPS）、刺槐素均購自美國SIGMA公司；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Nigericin購自美國InvivoGen公司；Anti-IL-1β抗體、Anti-Pro Caspase-1+p10+p12抗體購自美國Abcam公司。熒光倒置顯微鏡購自日本尼康公司；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 小鼠骨髓巨噬細胞（BMDM）原代分離培養(yǎng) 頸椎脫臼處死小鼠，取雙側(cè)脛骨和股骨至超凈工作臺。仔細分離肌肉等組織，完整暴露骨質(zhì)，離斷兩端，用無菌PBS溶液沖洗骨髓至DMEM培養(yǎng)基中。室溫下1 000 r/min，離心10 min（離心半徑10 cm），棄上清，用2 mL紅細胞裂解緩沖液重懸，在冰上靜止5 min。加入8 mL含10%FBS及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，1 400 r/min室溫離心5 min（離心半徑10 cm）。棄上清液，用含10 ng/mL粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的DMEM培養(yǎng)基（10%FBS及1%雙抗）重懸。用移液器反復(fù)吹打使細胞混勻，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿，于37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3 d后，全換液；5 d后，半換液。顯微鏡下觀察細胞貼壁及分化情況，鏡下可見細胞貼壁良好，伸出偽足，呈梭形［11］。

1.3 細胞分組及NLRP3炎癥小體刺激 將細胞隨機分為六組：空白對照組、LPS組、LPS+Nigericin組、LPS+2.5μmol/L刺槐素+Nigericin組、LPS+5μmol/L刺槐素+Nigericin組和LPS+10μmol/L刺槐素+Nigericin組。于12孔板每孔置入5×105個BMDM，除空白對照組外，其他各組加入LPS（50 ng/mL）預(yù)處理3 h，除空白對照組、LPS組外其他各組繼續(xù)加入不同劑量（2.5、5、10μmol/L）刺槐素處理細胞0.5 h，然后加入刺激劑Nigericin（10μmol/L）處理0.5 h。

1.4 裂解液中Pro-caspase-1、Pro-IL-1β和上清液中caspase-1、IL-1β表達檢測 采用Western blotting法。收集細胞樣品并提取蛋白，BCA法蛋白定量。蛋白質(zhì)樣品加熱變性后，取30μg樣品，以12%凝膠濃度進行SDSPAGE凝膠電泳。電泳條件：濃縮膠80 V，分離膠100 V。電泳結(jié)束后，將膠上蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。裂解液Pro-caspase-1、Pro-IL-1β及β-Actin使用0.45μmol/L PVDF膜，上清液caspase-1、IL-1β使用0.20μmol/L PVDF膜，Pro-IL-1β、Pro-caspase-1、caspase-1、IL-1β及β-Actin轉(zhuǎn)膜時間為60 min。將轉(zhuǎn)印后的膜用封閉劑（5%牛血清白蛋白，TBST配制）在室溫下封閉2 h，不需洗膜，將膜分別加入含兔抗大鼠β-肌動蛋白（1∶5 000）、兔抗Pro-IL-1β及IL-1β（1∶500）及兔抗Pro-caspase-1、caspase-1（1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST洗滌10 min×3次，加入相應(yīng)的二抗抗體（1∶5000），室溫下孵育2 h。TBST洗滌10 min×3次，將化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液按1∶1比例配制，均加2 mL至膜上，用ChemiScopeMini化學(xué)發(fā)光儀檢測、拍照。以目的基因條帶吸光度值/β-Actin吸光度值計算各蛋白相對表達量。

1.5 上清液中IL-1β、IL-18、TNF-α檢測 采用ELISA法。收集各組細胞上清液。按試劑說明書進行操作。使用酶標(biāo)儀進行雙波長檢測，測定450 nm最大吸收波長和570 nm參考波長下的OD值。校準(zhǔn)后OD值為450 nm的測定值減去570 nm的測定值。

1.6 細胞上清液LDH檢測 收集每組細胞上清液，按照LDH試劑說明書進行操作。酶標(biāo)儀檢測波長450 nm處吸光度值。LDH濃度（U/L）=（測定OD值-對照OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.2μmol/mL）×1 000。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 刺槐素對Nigericin誘導(dǎo)NLRP3活化的影響見表1。

表1 各組裂解液和上清液中相關(guān)蛋白表達比較（±s）

表1 各組裂解液和上清液中相關(guān)蛋白表達比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，▲P＜0.05；與LPS+Nigericin組比較，#P＜0.05；與LPS+2.5μmol/L刺槐素+Nigericin組比較，▼P＜0.05；與LPS+5μmol/L刺槐素+Nigericin組比較，☆P＜0.05。

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2.2 刺槐素對Nigericin誘導(dǎo)NLRP3活化后炎癥因 子釋放的影響 見表2。

表2 各組細胞上清液中IL-1β、IL-18、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組細胞上清液中IL-1β、IL-18、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，▲P＜0.05；與LPS+Nigericin組比較，#P＜0.05；與LPS+2.5μmol/L刺槐素+Nigericin組比較，▼P＜0.05；與LPS+5μmol/L刺槐素+Nigericin組比較，☆P＜0.05。

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2.3 刺槐素對Nigericin誘導(dǎo)NLRP3活化后細胞死亡的影響 空白對照組、LPS組、LPS+Nigericin組、LPS+2.5μmol/L刺槐素+Nigericin組、LPS+5μmol/L刺槐素+Nigericin組、LPS+10μmol/L刺槐素+Nigericin組LDH活性分別為（205.797±101.532）、（991.304±287.483）、（1 759.420±331.387）、（1 388.406±358.777）、（985.507±302.770）、（1 063.768±315.010）U/L。與空白對照組比較，LPS組LDH活性高（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+Nigericin組LDH活性高（P＜0.05）；LPS+Nigericin組LDH活性與LPS+2.5μmol/L刺槐素+Nigericin組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與LPS+Nigericin組比較，LPS+5μmol/L刺槐素+Nigericin組、LPS+10μmol/L刺槐素+Nigericin組LDH活性低（P均＜0.05）；LPS+2.5μmol/L刺槐素+Nigericin組、LPS+5μmol/L刺槐素+Nigericin組、LPS+10μmol/L刺槐素+Nigericin組LDH活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

多項研究表明，刺槐素具有抗炎作用。在細胞實驗中，刺槐素可抑制活性氧（ROS）的產(chǎn)生，增加血紅素氧合酶1和轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2的活性，抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達，從而減輕LPS誘導(dǎo)的肺損傷［9］。研究發(fā)現(xiàn)，刺槐素抑制脂肪細胞和肥胖小鼠的脂肪形成，降低炎癥介質(zhì)的水平和促分裂原活化蛋白激酶、NF-κB的活性［10］。刺槐素可調(diào)節(jié)輔助性T細胞17和調(diào)節(jié)性T細胞的分化，減輕膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠的癥狀［11］。離體實驗發(fā)現(xiàn)，刺槐素能抑制LPS刺激小膠質(zhì)細胞細胞后一氧化氮、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、前列腺素E2、環(huán)氧化酶、TNF-α、IL-1β的表達［12］。除此之外，刺槐素對炎性疾病PD［13］、AD［14］和糖尿?。?5］等具有很好的治療效果。但刺槐素的抗炎機制并不明確。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，刺槐素可增加氧糖剝奪后人神經(jīng)母細胞瘤（SH-SY5Y）細胞的存活率，降低細胞死亡率，減少缺血再灌注損傷后的腦梗死體積，改善神經(jīng)功能評分，抑制小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，進而抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路，對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮治療作用。

NLRP3炎癥小體在炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色，而刺槐素對該類疾病具有顯著的治療作用，且同時伴隨NLRP3炎癥小體活性的降低和IL-1β表達的減少。推測刺槐素的抗炎癥作用與NLRP3炎癥小體存在聯(lián)系。我們通過分離培養(yǎng)小鼠BMDM，采用NLRP3炎癥小體經(jīng)典活化劑Nigercin活化NLRP3，觀察刺槐素對NLRP3炎癥小體活化導(dǎo)致的caspase-1活化以及IL-1β分泌的影響，結(jié)果顯示刺槐素可以抑制caspase-1活化，10μmol/L刺槐素干預(yù)可顯著抑制IL-1β分泌。因此，我們推測刺槐素可作為NLRP3炎癥小體的候選抑制劑。并且研究發(fā)現(xiàn)，10μmol/L對NLRP3炎癥小體活化具有很好的抑制效果，為后續(xù)實驗劑量的選擇奠定了基礎(chǔ)。但是刺槐素能否特異性抑制NLRP3炎癥小體，刺槐素對其他炎癥小體是否有抑制作用還需要進一步研究。

目前研究認為NLRP3炎癥小體的活化需要兩個過程，第一信號是預(yù)刺激，第二信號是活化過程。預(yù)刺激是由Toll樣受體、核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域2、Ⅰ型腫瘤壞死因子受體或Ⅱ型腫瘤壞死因子受體介導(dǎo)，其目的是為了激活NF-κB信號通路，從而上調(diào)NLRP3和Pro-IL-1β的表達。活化過程，細胞外源的病原相關(guān)分子模式或機體內(nèi)部的危險相關(guān)分子模式刺激，激活NLRP3招募各種相關(guān)蛋白組裝炎癥小體，隨后caspase-1自剪切激活并導(dǎo)致IL-1β和IL-18成熟和分泌，伴隨著細胞焦亡的發(fā)生［15］。因此我們進一步采用ELISA法觀察刺槐素對LPS預(yù)刺激過程中TNF-α的影響以及對活化過程中IL-1β、IL-18的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅10μmol/L的刺槐素能下調(diào)預(yù)刺激過程中產(chǎn)生的TNF-α，而刺槐素可以濃度依賴性抑制活化過程中IL-1β、IL-18的表達。說明刺槐素在NLRP3炎癥小體活化的兩個過程中都發(fā)揮了作用，為進一步深入機制研究提供了方向。

正常情況下LDH存在于細胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細胞損傷或死亡時釋放到細胞外，所以細胞死亡數(shù)目與細胞培養(yǎng)上清中LDH活性呈正比。本研究采用LDH法分析了刺槐素對NLRP3炎癥小體活化后引起的細胞死亡的影響，發(fā)現(xiàn)刺槐素能明顯下調(diào)LDH的釋放，從而抑制細胞死亡，進一步證明刺槐素抑制了NLRP3炎癥小體活化。

綜上所述，本研究證實刺槐素可以抑制Nigercin誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活，但抑制NLRP3炎癥小體激活的機制還需要深入研究。