崔亭亭，紀(jì)昌麗，楊陽(yáng)，晁嵐

1山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250012；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心

玻璃化冷凍技術(shù)的出現(xiàn)使得囊胚的冷凍效率及復(fù)蘇成功率大大提高。然而研究顯示，胚胎在冷凍及解凍過程中，透明帶（ZP）的張力會(huì)變差，彈性會(huì)降低，從而導(dǎo)致胚胎孵出困難［1］。眾所周知，囊胚形成后適時(shí)從ZP中孵出是胚胎在宮內(nèi)種植的先決條件［2］，因此，有學(xué)者提出對(duì)冷凍胚胎進(jìn)行輔助孵化（AH）。激光AH即利用激光在ZP上操作，從而幫助胚胎從ZP中孵出。關(guān)于激光AH能否改善復(fù)蘇周期囊胚移植的妊娠結(jié)局，至今仍存在爭(zhēng)議［3-4］。我們分析444例復(fù)蘇周期囊胚移植患者的資料，觀察激光AH在復(fù)蘇周期囊胚移植中的作用，為激光AH技術(shù)在臨床中的應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年6月—2016年12月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院行復(fù)蘇周期囊胚移植的患者444例，入選標(biāo)準(zhǔn)：移植胚胎數(shù)為1～2枚；采用自然周期（NC）方案或激素替代方案（HRT）準(zhǔn)備內(nèi)膜；年齡≤40歲；所移植囊胚均為前1天復(fù)蘇，過夜培養(yǎng)18～20 h，次日移植。排除標(biāo)準(zhǔn)：夫婦雙方任一方存在染色體異常；子宮畸形；臨床資料不完整。其中，2014年1月—2015年5月，行復(fù)蘇周期囊胚移植且未行激光AH的患者194例，作為NAH組；2015年6月—2016年12月，行復(fù)蘇周期囊胚移植且行激光AH的患者250例，作為AH組。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 囊胚的玻璃化冷凍及解凍 采用KITAZATO玻璃化冷凍液套裝和玻璃化解凍套裝，按照操作規(guī)程進(jìn)行冷凍及解凍操作。囊胚解凍后，繼續(xù)培養(yǎng)18～20 h后行胚胎移植。玻璃化冷凍：將囊胚放到平衡液表面，使其自然下沉平衡5 min；將囊胚移入冷凍液1不同位置中快速洗滌，反復(fù)洗滌30～40 s；裝管，1～2枚胚胎/管，保留少許液體，胚胎裝載完成后，投入液氮中。玻璃化解凍：在37℃下，迅速將冷凍載桿從液氮中取出并直接投入復(fù)蘇液1中1 min，快速解凍；在室溫下，將胚胎移到復(fù)蘇液2表面，使其自然下沉，計(jì)時(shí)3 min；在室溫下，將胚胎移到洗滌液1使其自然下沉，計(jì)時(shí)5 min；在室溫下，將胚胎帶盡可能少的液體量轉(zhuǎn)移到洗滌液2，計(jì)時(shí)5 min；將胚胎轉(zhuǎn)移到預(yù)先平衡過的培養(yǎng)液中，移至帶有激光的倒置顯微鏡下，行AH。

1.3 激光AH 打開激光發(fā)射器（型號(hào)：OCTAX Laser ShotTM，德國(guó)）的電源，待激光發(fā)射器初始化完成后，調(diào)節(jié)激光的脈沖時(shí)間5～8 ms，將激光鏡頭調(diào)至看清楚胚胎ZP，并將激光發(fā)射點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)沿著ZP安全區(qū)域，削除范圍為ZP周長(zhǎng)的1/8。

1.4 胚胎移植 月經(jīng)周期規(guī)律且排卵正常者采用自然周期方案，排卵后第5天移植囊胚；自然周期無(wú)排卵或排卵不規(guī)律者采用激素替代周期方案，于月經(jīng)第19天復(fù)蘇囊胚，月經(jīng)第20天移植囊胚。

1.5 結(jié)局觀察

1.5.1 囊胚孵化程度 采用Gardner評(píng)分系統(tǒng)對(duì)囊胚分期進(jìn)行評(píng)價(jià)［5］。1期：早期囊胚，囊胚腔小于胚胎體積的1/2；2期：囊胚，囊胚腔大于等于胚胎體積的1/2；3期：完全囊胚，囊胚腔充滿整個(gè)胚胎；4期：擴(kuò)張囊胚，囊胚大于早期胚胎，ZP變薄；5期：正孵出的囊胚，滋養(yǎng)細(xì)胞開始從ZP突出；6期：已孵出的囊胚，囊胚完全從ZP中孵出。

1.5.2 妊娠及新生兒結(jié)局指標(biāo) 胚胎移植后12～14 d檢測(cè)血清β-HCG水平，血β-HCG＞10 mIU/mL為生化妊娠；胚胎移植4～5周行B超檢查，若在宮腔內(nèi)見妊娠囊，為臨床妊娠；妊娠＜28周或胎兒體質(zhì)量＜1 000 g為流產(chǎn)；妊娠滿28周后分娩且存活的新生兒為活產(chǎn)；妊娠滿28周且不滿37周為早產(chǎn)；出生體質(zhì)量＜2 500 g為低出生體質(zhì)量；出生體質(zhì)量≥4 000 g為巨大兒。胚胎植入率=（孕囊總數(shù)/總移植胚胎數(shù)）×100%；生化妊娠率=（生化妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)）×100%；臨床妊娠率=（臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)）×100%；活產(chǎn)率=（活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)）×100%；流產(chǎn)率=（流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)）×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。用二元Logistic回歸模型調(diào)整混雜因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較 兩組年齡、BMI、不孕年限、基礎(chǔ)FSH值、不孕類型、移植囊胚數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；AH組子宮內(nèi)膜厚度薄于NAH組，自然周期方案占比高于NAH組（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組基線資料比較

2.2 兩組移植前囊胚孵化程度比較 囊胚解凍后繼續(xù)培養(yǎng)18～20 h行胚胎移植，移植前AH組和NAH組的4、5、6期囊胚比例比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 兩組移植前囊胚分期比較［例（%）］

2.3 兩組妊娠結(jié)局比較 NAH組移植胚胎310個(gè)，AH組移植胚胎388個(gè)。用二元Logistic回歸模型調(diào)整混雜因素，AH組的胚胎植入率、生化妊娠率、臨床妊娠率、總活產(chǎn)率、單胎活產(chǎn)率均高于NAH組（P均＜0.05），兩組的雙胎活產(chǎn)率、流產(chǎn)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表3。

表3 兩組妊娠結(jié)局比較［例（%）］

2.4 兩組新生兒結(jié)局比較 AH組巨大兒12例（6.67%），新生兒出生體質(zhì)量（3 058.67±715.94）g，早產(chǎn)兒60例（33.33%），低出生體質(zhì)量?jī)?9例（16.11%）。NAH組巨大兒18例（15.79%），新生兒出生體質(zhì)量（3 130.18±752.79）g，早產(chǎn)兒28例（24.56%），低出生體質(zhì)量?jī)?9例（16.67%）。與NAH組比較，AH組巨大兒比例低（P＜0.05），兩組新生兒出生體質(zhì)量、早產(chǎn)兒比例、低出生體質(zhì)量?jī)罕壤容^差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，ZP的硬化可能與多種因素相關(guān)，如高齡、體外培養(yǎng)環(huán)境、冷凍—復(fù)蘇過程［6］等。因此，有學(xué)者提出對(duì)冷凍胚胎進(jìn)行AH來幫助其從ZP中順利孵出。AH即利用人工的方法在ZP上打孔或削薄ZP來加速胚胎孵出。AH的方法有很多，如化學(xué)法、機(jī)械法和激光法等。其中激光法因其操作簡(jiǎn)單快捷、定位準(zhǔn)確、成本低、受人為因素影響小，現(xiàn)已被大多數(shù)生殖中心所采用。

目前關(guān)于AH促進(jìn)囊胚著床的機(jī)制尚不完全清楚，但可以從以下幾點(diǎn)給出解釋。AH加快了胚胎孵出的速度，延長(zhǎng)了胚胎與子宮內(nèi)膜的作用時(shí)間，從而改善胚胎與子宮內(nèi)膜的黏附，胚胎與子宮內(nèi)膜的同步性是胚胎著床的關(guān)鍵。此外，植入窗內(nèi)的早期植入與隨后的活產(chǎn)率相關(guān)，而延遲植入則與高流產(chǎn)率相關(guān)［7］。本研究納入的群體均為復(fù)蘇周期囊胚移植的患者，分為AH組和NAH組，其中AH組250個(gè)周期，NAH組194個(gè)周期。結(jié)果顯示，AH組移植前囊胚孵化程度主要集中在5期和6期，而NAH組主要集中在4期和5期，進(jìn)一步論證了AH可以加快囊胚孵出速度。此外，我中心均采取前一天復(fù)蘇囊胚，次日移植的方式，從胚胎開始復(fù)蘇到移植到患者體內(nèi)間隔時(shí)長(zhǎng)為18～20 h。

研究證實(shí)，通過ZP打孔法的激光AH可以改善冷凍-解凍胚胎患者的臨床妊娠率和植入率［8］。本研究同樣采用了激光打孔的AH法去除1/8周長(zhǎng)ZP。此方法操作簡(jiǎn)易、不會(huì)損傷囊胚的滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，且ZP開孔的大小有利于囊胚孵出。國(guó)外一項(xiàng)薈萃分析顯示［9］，在有反復(fù)移植失敗史或移植冷凍胚胎的患者中，AH能增加臨床妊娠率和多胎妊娠率。本研究尚未統(tǒng)計(jì)多胎妊娠率的差異，但AH組的臨床妊娠率高于NAH組。研究表明，人類輔助生殖技術(shù)中的活產(chǎn)率會(huì)隨著囊胚擴(kuò)張程度的增加而升高［10］。此外，囊胚擴(kuò)張程度是預(yù)測(cè)成功率的指標(biāo)［11］?；谝陨辖Y(jié)論，我們推測(cè)，AH組的妊娠率之所以高于NAH組，可能是因?yàn)锳H加快了囊胚孵化，提高了囊胚擴(kuò)張程度，使得胚胎在種植窗內(nèi)著床的概率更大。本研究中兩組研究對(duì)象的內(nèi)膜厚度及內(nèi)膜治療方案存在差異，故采用二元Logistic回歸分析法去除混雜因素影響后，AH組的上述幾項(xiàng)指標(biāo)（胚胎植入率、生化妊娠率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率）仍高于NAH組，說明AH可以改善復(fù)蘇周期囊胚移植的妊娠結(jié)局。然而，一項(xiàng)納入了2 165例冷凍囊胚資料的研究卻認(rèn)為AH與妊娠率的改善無(wú)關(guān)［3］；DEBROCK等［12］的研究也顯示激光AH并不能提高胚胎植入率。這與我們的結(jié)果恰好相反，一部分原因可能來自于各中心AH的具體方式不同，如激光打孔法時(shí)開孔的大小以及不同的ZP削除范圍等。ZHANG等［13］對(duì)比了不同減薄厚度的ZP（40、80μm）的妊娠率，發(fā)現(xiàn)80μm組的妊娠率和胚胎植入率明顯高于40μm組。表明激光減薄ZP的大小可能影響冷凍-解凍卵裂期胚胎移植后的妊娠率和植入率。但激光AH對(duì)冷凍囊胚移植結(jié)局的影響仍需要進(jìn)一步探討。

有研究考慮到激光的熱效應(yīng)，質(zhì)疑激光AH對(duì)后代的安全性［14］。我們的操作均由經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)室人員在室溫下進(jìn)行，且將胚胎的體外暴露時(shí)間控制在一定范圍內(nèi)，因此熱損傷的發(fā)生概率很低。此外，本研究結(jié)果也顯示，兩組新生兒出生體質(zhì)量、低出生體質(zhì)量?jī)罕壤?、早產(chǎn)率差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與JUNNA等［15］的研究一致。但AH組的巨大兒比例低于NAH組。對(duì)此，我們將AH組和NAH組按照不同內(nèi)膜方案做了分層分析，排除基線資料差異后，各組內(nèi)不同內(nèi)膜方案的新生兒結(jié)局并未有顯著差異。然而，最新的一項(xiàng)系統(tǒng)綜述顯示HRT方案相較NC方案，增加了子癇前期、產(chǎn)后出血、巨大兒及過期產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)［16］。推測(cè)原因之一是HRT方案適用的群體多無(wú)正常排卵，因此無(wú)黃體產(chǎn)生，而黃體不僅能產(chǎn)生雌激素和孕激素，還可以產(chǎn)生血管活性產(chǎn)物（松弛素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子），它們對(duì)初始胎盤形成尤為重要。而缺乏黃體則會(huì)導(dǎo)致血管活性物質(zhì)減少，降低動(dòng)脈的順應(yīng)性，因此可能與妊娠期子癇前期的發(fā)生有密切關(guān)系［17］。此外，HRT方案需要外源性給予雌激素來促使內(nèi)膜增長(zhǎng)，然而胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育過程中大劑量雌激素可能會(huì)造成子宮螺旋動(dòng)脈重塑異常，胎盤血供不足，進(jìn)而增加了圍產(chǎn)期母嬰并發(fā)癥概率［18］。

總之，激光AH總體改善了冷凍復(fù)蘇周期囊胚移植的妊娠結(jié)局，且未會(huì)對(duì)新生兒造成不利影響。本研究的不足之處是納入樣本量偏小，未能統(tǒng)計(jì)兩組的單卵雙胎率和異位妊娠率等指標(biāo)。故AH對(duì)妊娠結(jié)局的影響有待更大樣本的研究來證實(shí)。