劉佩萸 張萬福 李曉剛 楊家娟 方醒藝 李 波

CCL18是由腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌的趨化因子，研究表明其與癌癥的不良預(yù)后相關(guān)[1,2]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程[3]。其主要特征有細(xì)胞黏附分子(如E-鈣黏蛋白)表達(dá)的減少、細(xì)胞角蛋白細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白(Vimentin)為主的細(xì)胞骨架等[4]。EMT在胚胎發(fā)育、組織重建、多種纖維化疾病和癌癥轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用[5,6]。本研究旨在探索趨化因子CCL18與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系及其在促進(jìn)腫瘤發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2018年12月，于我院普外科行手術(shù)切除治療的乳腺癌患者50例。所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為乳腺癌并首次治療，術(shù)前未接受放化療及內(nèi)分泌治療等輔助治療。納入研究的患者年齡35～78歲，平均年齡為(55.5±12.0)歲，TNM分期:Ⅰ期3例，Ⅱ～Ⅲ期28例，Ⅳ期19例。雌激素受體陽性者41例，陰性者9例。各分期患者年齡、性別等基本資料之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):①病理學(xué)檢查確定其為乳腺癌;②符合WHO乳腺癌分類標(biāo)準(zhǔn);③無腫瘤病史者;④獲得患者及其親屬的認(rèn)同。排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病;②有其他惡性腫瘤并發(fā)患者;③已治療患者;④無完整臨床資料者。本研究經(jīng)我院的倫理委員會(huì)審核通過。所有患者均行乳腺癌根治術(shù)治療，手術(shù)中留取癌組織。

1.2 細(xì)胞、試劑與儀器

人乳腺癌細(xì)胞株BT-474、MDA-MB-231(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所)；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Transwell小室(美國Corning)；Matrigel膠(美國Corning)；q-RT-PCR檢測試劑盒(昆明贊納生物科技有限公司)；兔抗人CCL18多克隆抗體(英國Abcam)；兔抗人E-cadherin和Vimentin多克隆抗體(美國PeproTech)；RM2245半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國LeicaBiosystems)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 乳腺腫瘤組織切片水化后高溫法修復(fù)抗原，血清封閉，兔抗人CCL18一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育5 min，DBA顯色，蘇木精復(fù)染，脫水封片后鏡下觀察。結(jié)果判定：以顯微鏡下棕黃色胞質(zhì)染色細(xì)胞為陽性反應(yīng),計(jì)數(shù)全視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取液氮保存的細(xì)胞，于37 ℃水浴鍋中快速解凍，將細(xì)胞接種至含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1 h。細(xì)胞貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)直到形成單層，即可傳代。

1.3.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) -20 ℃保存的Matrigel膠置于4 ℃過夜融化。用不含血清的培養(yǎng)基稀釋后加入小室中,覆蓋整個(gè)聚碳酸酯膜。37 ℃下放置30 min,使Matrigel膠凝固。制備單細(xì)胞懸液濃度為2×105個(gè)/ml，將200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室中，下室加入600 μl含CCL18濃度梯度的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)細(xì)胞，甲醇固定下室細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.3.4 Western Blot 收集細(xì)胞，RIPA裂解液提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5 min×6次，加入二抗室溫下孵育1 h，TBST洗滌5 min×6次，ECL發(fā)光液顯影。

1.3.5 q-RT-PCR 收集細(xì)胞，加入Trizol按說明書步驟提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用20 μl體系進(jìn)行q-RT-PCR。所用引物序列：SNAIL:F:5'-CATCCTTCTCACTGCCATGGA-3',R:5'-AGGCAGAGGACACAGAACCAGA-3';SLUG:F:5'-CAGCTCAGGAGCATACAG-3',R:5'-GAGGAGGTGTCAGATGGA-3';TWIST:F:5'-GCCGGAGACCTAGATGTCATT-3',R:5'-CCCACGCCCTGTTTCTTTGA-3'。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間采用單因素方差分析進(jìn)行比較，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 癌組織、癌旁組織內(nèi)CCL18的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)相關(guān)性

CCL18在乳腺癌組織中陽性表達(dá)率為64.00%，在癌旁組織中不表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。且CCL18表達(dá)量與乳腺癌患者年齡、絕經(jīng)情況無關(guān)(P>0.05)，與TNM分期有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表1 CCL18在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)(例，%)

2.2 CCL18對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)顯示，低濃度和高濃度CCL18均促進(jìn)了BT-474細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力(P<0.05)。

圖1 CCL18對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

2.3 CCL18通過激活SNAIL轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT

CCL18促進(jìn)BT-474細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)Vimentin蛋白，抑制E-cadherin蛋白的表達(dá)(P<0.05)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT(圖2)。

圖2 CCL18對(duì)乳腺癌細(xì)胞E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平的影響

EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子中，CCL18激活了SNAIL轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)(P<0.05)，促進(jìn)BT-474細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生EMT(圖3)。

圖3 CCL18對(duì)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子激活水平比較

3 討論

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的癌癥，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因[7]。因此對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的探索對(duì)提高乳腺癌患者的生存至關(guān)重要。腫瘤轉(zhuǎn)移過程主要包括原位侵襲，外滲，循環(huán)生存和遠(yuǎn)處器官定植等一序列順序事件[8]。EMT對(duì)轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)初始步驟的發(fā)生有著至關(guān)重要的作用[9]。腫瘤細(xì)胞經(jīng)過EMT過程，失去上皮細(xì)胞連接和極性，獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型以及遷徙和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生[10]。

趨化因子是腫瘤微環(huán)境中的重要調(diào)控因子，在癌癥相關(guān)炎癥和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[11]。多種趨化因子被證實(shí)參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12]。如趨化因子CXCL8通過調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的增值和自我更新能力，在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[13]。CXCL12則被證明在促進(jìn)腫瘤血管生成過程中扮演著重要角色[14]。除此之外，趨化因子還可以直接促進(jìn)腫瘤的增值能力和侵襲能力[15-17]。之前的研究表明，乳腺癌組織中的M2型巨噬細(xì)胞分泌CCL18[18]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CCL18在乳腺癌組織中的表達(dá)比在癌旁組織中明顯升高，且與腫瘤的TNM分期顯著相關(guān)。且Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)，CCL18的表達(dá)量與反應(yīng)細(xì)胞增殖能力的Ki67的表達(dá)量相關(guān)性不顯著。因此，我們檢測了CCL18對(duì)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，發(fā)現(xiàn)低水平和高水平的CCL18都能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，確定了CCL18通過促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力影響腫瘤的發(fā)展。之后我們檢測了與腫瘤侵襲能力相關(guān)的EMT相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)波形蛋白，而E-鈣黏蛋白表達(dá)量下降。由此我們確定趨化因子CCL18通過促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。為了明確CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT的途徑，我們檢測了EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)SNAIL轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)。這表明趨化因子CCL18通過激活SNAIL轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT。

綜上所述，乳腺癌組織中高表達(dá)趨化因子CCL18，且與腫瘤TNM分期顯著相關(guān)。在乳腺癌中CCL18可能通過激活SNAIL轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的發(fā)生。