袁前超 鄭志陽 齊 宇

肺癌起源于支氣管黏膜及腺體，具有高度分子異質(zhì)性，其發(fā)病與遺傳、表觀遺傳、染色體畸變、基因組不穩(wěn)定性、突變等位基因特異性失衡、腫瘤突變負(fù)荷以及非遺傳等不同機(jī)制有關(guān)[1]。隨著肺癌發(fā)病率的不斷增加，越來越多的學(xué)者開始探索肺癌發(fā)病的分子機(jī)制[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是近些年來新發(fā)現(xiàn)的一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA分子[3]，可有效調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)及染色質(zhì)重塑，與大量的細(xì)胞功能有關(guān)，并在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[4]，與細(xì)胞內(nèi)的多種MicroRNAs分子、蛋白質(zhì)及多種核苷酸受體相互作用進(jìn)而調(diào)控腫瘤進(jìn)展[5]。TCF7作為LncRNAs家族的一員，也被證實(shí)參與介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長、增殖、遷移、侵襲以及凋亡等過程[6]。本次研究收集臨床肺癌組織樣本并對其進(jìn)行檢測，探究LncRNA TCF7在肺癌組織和細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及亞細(xì)胞定位，深入了解TCF7對肺癌細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)調(diào)控機(jī)制，具體內(nèi)容如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2016年6月至2017年12月期間我院收治的肺癌手術(shù)切除患者22例，術(shù)后經(jīng)臨床確診為肺癌，其中男性14例，女性8例，年齡為32～69歲，平均年齡為(46.72±8.47)歲；肺腺癌5例，鱗癌6例，腺鱗癌2例，非小細(xì)胞肺癌9例。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放療、化療以及生物免疫治療，未見其他并發(fā)疾病，臨床資料完整，經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)并簽署知情同意書，對所有患者進(jìn)行為期3年的電話隨訪。所有肺癌腫瘤組織及癌旁正常組織均為手術(shù)切除物及配對物，且在術(shù)后10 min內(nèi)取材并于-80 ℃的液氮中保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE細(xì)胞、肺癌細(xì)胞株A549、H1688、H1299和H1975均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所(協(xié)和細(xì)胞庫)。將上述細(xì)胞置于培養(yǎng)基(37 ℃、5%CO2、10%胎牛血清、10%青霉素/鏈霉素混合物)中培養(yǎng)，每隔3 d更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞貼壁生長至90%融合時，采用0.25%的胰蛋白酶(美國賽默飛世爾科技公司)進(jìn)行消化傳代。取對數(shù)生長期肺癌細(xì)胞，以5×106個/孔的密度種植在6孔板中，采用Lipo 2000試劑盒(美國英杰生命技術(shù)有限公司)對肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞內(nèi)的LncRNA TCF7進(jìn)行沉默，并按照羅氏FuGENE?HD 轉(zhuǎn)染試劑(上海羅氏制藥有限公司)說明書將TCF7低表達(dá)質(zhì)粒(si-TCF7)、陰性對照(si-NC)和空白對照(vector)分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后將各組細(xì)胞繼續(xù)于37 ℃、5%CO2下進(jìn)行培養(yǎng)，取穩(wěn)定生長細(xì)胞待用。

1.3 熒光實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)檢測組織和細(xì)胞中TCF7的mRNA表達(dá)

采用TRIzol試劑(美國英杰生命技術(shù)有限公司)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript-RT Kit(美國麥迪遜公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用SYBR GreenPCR顯色試劑(美國MedChemexpress生物科技公司)和ABI7500FAST Real-Time PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)以2-ΔΔCt方法[7]評估用GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參后TCF7的mRNA表達(dá)。引物序列如表1所示。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.4 TCF7亞細(xì)胞定位

通過查閱Locator數(shù)據(jù)庫(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/)預(yù)測TCF7的亞細(xì)胞定位，此外參考熒光定量PCR法分離和抽提肺癌細(xì)胞的總RNA和胞質(zhì)/核RNA，2-ΔΔCt方法計算TCF7的表達(dá)水平，當(dāng)TCF7的表達(dá)為正數(shù)時代表其主要分布于細(xì)胞核中，而當(dāng)TCF7的表達(dá)為負(fù)數(shù)時代表其主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。

1.5 Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒檢測A549細(xì)胞的增殖活性

取各組肺癌細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后接種于96孔板中。37 ℃、5%CO2下置于含有200 μl的改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM)(美國賽默飛世爾科技公司)中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至50%融合時將DMEM換成無血清培養(yǎng)基，24 h后向培養(yǎng)基中加入血清。培養(yǎng)24 h后加入10 μl的CCK8溶液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，按照CCK8試劑盒說明書分別測量肺癌細(xì)胞在不同時間(24 h、48 h、72 h)下450 nm波長處的吸光度值。

1.6 Western Blot檢測JAK/STAT通路的蛋白表達(dá)

取上述各組肺癌細(xì)胞2×106個，采用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次后，加入裂解液(Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA)對細(xì)胞進(jìn)行裂解，取50 g總蛋白凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(poly vinylidene fluoride，PVDF)膜后使用5%的脫脂奶粉封閉2 h，用0.05%的緩沖液(Tris-Buffered Sal ine Tween20，TBST)洗滌3次。與JAK、STAT、p-JAK、p-STAT、β-actin一抗[均購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]在4 ℃下孵育過夜。Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜后，加入辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標(biāo)記的濃度為1∶3000的兔抗二抗孵育1 h。再次洗膜3次后用Western blot專用試劑(美國賽默飛世爾科技公司)顯色成像并分析灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，TCF7的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系采用(n,%)表示，卡方檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法分析患者預(yù)后情況，P<0.05時為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 TCF在肺癌組織中的表達(dá)和預(yù)后

與癌旁正常組織相比，TCF7在肺癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1。Kaplan-Meier分析顯示TCF7高表達(dá)患者預(yù)后更差(圖2，P=0.043)。

注： ***為與腫瘤組織相比，P<0.001。

圖2 TCF的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

2.2 TCF在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位

如圖3所示，與支氣管上皮細(xì)胞株16HBE細(xì)胞相比，A549、H1688、H1299以及H1975細(xì)胞中TCF7的表達(dá)均顯著上調(diào)，且A549細(xì)胞中TCF7的表達(dá)水平最高(P<0.05)。如表2所示，Locator數(shù)據(jù)庫的查詢結(jié)果顯示，TCF7主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。此外，RT-PCR結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，TCF7在A549細(xì)胞中的表達(dá)水平為(0.83±0.11)，進(jìn)一步證實(shí)TCF7主要分布于A549細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。

注：**為與支氣管上皮細(xì)胞株16HBE細(xì)胞相比P<0.01，***為與支氣管上皮細(xì)胞株16HBE細(xì)胞相比P<0.001。

表2 TCF7亞細(xì)胞定位

2.3 TCF7的表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系

TCF7的表達(dá)水平與肺癌患者的TNM分期有明顯相關(guān)性(P<0.05)，而與患者的性別、年齡以及腫瘤病理分型無關(guān)(P>0.05)，見表3。

表3 TCF7表達(dá)水平與患者臨床指標(biāo)的關(guān)系(例，%)

2.4 沉默TCF7對A549細(xì)胞中TCF7表達(dá)的影響

如圖4所示，分別對TCF7進(jìn)行3個片段的沉默，RT-PCR結(jié)果顯示沉默TCF7后A549細(xì)胞中TCF7的表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)。

注：與si-NC組相比，NSP>0.04，**為P<0.01，***為P<0.001。

2.5 沉默TCF7對A549細(xì)胞增殖的影響

為了驗(yàn)證低表達(dá)TCF7對肺癌細(xì)胞增殖的影響，采用CCK8檢測細(xì)胞增殖活力，結(jié)果如圖5所示，沉默TCF7可顯著抑制A549細(xì)胞的增殖能力(P<0.05)。

2.6 沉默TCF7對JAK/STAT信號通路的影響

為了進(jìn)一步探究TCF7調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制，采用Western Blot檢測沉默TCF7后JAK/STAT通路的蛋白表達(dá)，如圖6所示，低表達(dá)TCF7可顯著抑制JAK/STAT3信號通路的磷酸化水平(P<0.05)。

圖6 沉默TCF7對JAK/STAT信號通路的影響

3 討論

注： 與si-NC組相比，*為P<0.05。

肺癌可分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌以及小細(xì)胞肺癌[8]。不同組織學(xué)亞型的肺癌分子特征不同，發(fā)病機(jī)制也不盡相同[9]。楔形切除、節(jié)段切除、肺葉切除術(shù)及肺切除術(shù)等外科技術(shù)適用于早期肺癌的診斷和臨床治療，并被認(rèn)為是最佳治療方案[10]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，免疫檢查點(diǎn)抑制劑可有效提高轉(zhuǎn)移性和局部晚期肺癌患者的生存率，放射治療可發(fā)揮輔助免疫治療的效果，通過免疫刺激提高免疫治療的療效[11]。近20年來，免疫治療和靶向分子治療改變了肺癌治療的傳統(tǒng)模式[12]，因此，尋找合適的免疫檢查點(diǎn)抑制劑對肺癌的特異性治療十分重要。

隨著基因組測序技術(shù)的出現(xiàn)，真核生物基因組被轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA。LncRNA是非編碼RNA的一種，參與基因轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳學(xué)基因組印記等功能，還參與調(diào)控染色質(zhì)循環(huán)、信使RNA降解、翻譯及蛋白質(zhì)動力學(xué)，進(jìn)而影響多種疾病的發(fā)生發(fā)展[13]。TCF7作為新發(fā)現(xiàn)的LncRNA家族的一員，被過往研究證實(shí)參與調(diào)控多種腫瘤的疾病進(jìn)展，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡[14]。本次研究發(fā)現(xiàn)，TCF7在肺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，且與患者的不良預(yù)后有關(guān)，TCF7主要分布于肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，其表達(dá)水平與肺癌患者的TNM分期有明顯相關(guān)性(P<0.05)。沉默TCF7后A549細(xì)胞中TCF7的表達(dá)顯著下調(diào)，低表達(dá)TCF7顯著抑制了A549細(xì)胞的體外增殖。原因可能在于TCF7在肺癌細(xì)胞中作為原癌基因存在，患者腫瘤組織內(nèi)TCF7的表達(dá)水平越高，臨床TNM分期越晚，預(yù)后越差。惡性腫瘤的主要特征是腫瘤細(xì)胞的快速增殖，原癌基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的增殖有著明顯的促進(jìn)作用，敲低TCF7時A549細(xì)胞的體外增殖被顯著抑制也進(jìn)一步證實(shí)了TCF7在肺癌中的促癌效應(yīng)，這也與Jin FS等[15]的研究結(jié)果相符。

Janus Kinase激酶家族JAK和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)率激活因子STAT是細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游通路之一，也是哺乳動物免疫系統(tǒng)膜核信號傳遞的重要途徑，通過免疫調(diào)節(jié)參與多種炎癥疾病、自身免疫性疾病以及惡性腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展[16]。Mohrherr J等[17]報道稱，JAK/STAT信號通路的激活與肺腺癌中K-RAS基因的驅(qū)動有關(guān)，抑制JAK/STAT通路可顯著抑制K-RAS驅(qū)動的免疫缺陷肺腺癌小鼠的腫瘤細(xì)胞增殖，并抑制腫瘤進(jìn)展。本次研究結(jié)果也表明，下調(diào)TCF7顯著抑制了JAK/STAT通路的磷酸化水平，進(jìn)而在肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞中發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)。推測其原因可能為JAK/STAT通路的活化介導(dǎo)了肺癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步證實(shí)TCF7的確通過調(diào)控JAK/STAT信號通路影響肺癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，LncRNA TCF7在肺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)中，與患者的腫瘤TNM分期及不良預(yù)后有關(guān)，下調(diào)TCF7可通過抑制JAK/STAT信號通路的活化發(fā)揮抑制肺癌細(xì)胞的增殖的效應(yīng)，提示TCF7或許是肺癌治療的潛在生物標(biāo)志物。