楊 明 鄧婷婷 王雨潔 聶國輝 范小琴

在中國，鼻咽癌的發(fā)生率和死亡率居世界之首，是我國重點(diǎn)防治的惡性腫瘤之一[1]。鼻咽癌發(fā)病位置隱匿，臨床確診時多為中晚期[2]。在臨床，對中晚期患者的治療效果不佳，5年生存率低[3]。因此，深入研究鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，尋找有效的潛在治療靶點(diǎn)對提高鼻咽癌患者生存率具有非常重要的意義。核酸結(jié)合蛋白3(Y-box protein 3，YBX3)，又稱DNA結(jié)合蛋白A(DNA binding protein A，DBPA)、冷休克蛋白A(cold shock domain protein A,CSDA)，是核酸結(jié)合蛋白家族重要成員之一[4]。研究顯示YBX3具有多種生物學(xué)功能，在肝癌、結(jié)直腸癌、腎癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[5,6]。如在肝癌中，YBX3的表達(dá)與肝癌分期顯著相關(guān)，可作為炎癥誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的候選蛋白標(biāo)準(zhǔn)物[7]。在個體發(fā)育中，YBX3 作為重要轉(zhuǎn)錄因子，通過Myc21和E2F促進(jìn)cyclinD1和PCNA的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖[8]。然而，YBX3參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的功能和作用目前尚不完全清楚。本研究通過Q-PCR 和Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測YBX3在多種鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并結(jié)合體外分子實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)探索YBX3對鼻咽癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長的作用；并進(jìn)一步探索其對鼻咽癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，以期為臨床鼻咽癌治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常鼻咽上皮細(xì)胞NP460受贈于香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院曹世華教授，鼻咽癌細(xì)胞SUNE1，CNE1，CNE2，5-8F本實(shí)驗(yàn)室保存。DKSF培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、雙抗、0.25%胰酶購買于美國Hyclone公司。CFSE試劑盒、Trizol試劑購于美國Life公司；CCK8試劑盒購于日本Dojindo公司；YBX3，p38，p-p38，PCNA，GAPDH，兔二抗，鼠二抗購買于CST公司；逆轉(zhuǎn)錄和SYBR熒光定量試劑盒購買于美國Roche公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

正常鼻咽上皮NP460細(xì)胞用DKSF培養(yǎng)基培養(yǎng)；鼻咽癌細(xì)胞SUNE1，CNE1，CNE2，5-8F用加1%青鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；培養(yǎng)箱條件37 ℃，5%CO2，細(xì)胞培養(yǎng)到融合率達(dá)90%以上時，加胰酶消化傳代或?qū)嶒?yàn)。

1.3 細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)/穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾試驗(yàn)

YBX3 SiRNA瞬轉(zhuǎn)干擾試劑盒和慢病毒ShRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)試劑盒購買于中國吉瑪公司和上海吉凱基因。瞬轉(zhuǎn)時，5-8F細(xì)胞用轉(zhuǎn)染試劑lip2000按試劑盒說明書操作，24小時后繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。穩(wěn)轉(zhuǎn)時，5-8F細(xì)胞按試慢病毒劑盒說明書操作，48小時后用1 μg/ml嘌呤霉素篩選穩(wěn)定敲除YBX3的細(xì)胞并驗(yàn)證后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CFSE細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

瞬轉(zhuǎn)YBX3 SiRNA的5-8F細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)后，制備1×106/100 μl 濃度的細(xì)胞懸液，加入CFSE染料至終濃度為5 μM，置于室溫避光孵育10 min，加完全培養(yǎng)基終止離心，鋪板，48 h后，消化上流式檢查，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

穩(wěn)轉(zhuǎn)YBX3 ShRNA的5-8F細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)后，鋪于96孔板每孔2000個細(xì)胞，每組每個時間點(diǎn)做3個復(fù)孔，分別在24 h、48 h、72 h后棄培養(yǎng)基，加入100 μl含有10 μl CCK8試劑，37 ℃孵育3 h后，上酶標(biāo)儀檢測吸收波長為OD 450 nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 克隆形成細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

穩(wěn)轉(zhuǎn)YBX3 ShRNA的5-8F細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)后，鋪于6孔板每孔400個細(xì)胞，每組做3個復(fù)孔，1周后棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)克隆個數(shù)。

1.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞和組織總蛋白用RIPA ( 加入1×蛋白酶抑制劑和1×磷酸酶抑制劑) 裂解液裂解提取?？偟鞍诐舛扔肂CA蛋白定量法提取。總蛋白10 μg用10%的SDS-PAGE跑膠分離后，轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜、二抗(1∶2000)室溫孵育2 h、ECL顯影。

1.8 Q-PCR實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞總RNA通過Trizol試劑常規(guī)提取方法，總RNA濃度用酶標(biāo)儀定量后，取1μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)成cDNA，相對熒光定量檢測目的基因RNA表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)所用引物如下：YBX3上游引物：5'-ACCGGCGTCCCTACAATTAC-3'，下游引物：5'-GGTTCTCAGTTGGTGCTTCAC-3' ； GAPDH上游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'， 下游引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

1.9 動物實(shí)驗(yàn)

所有動物實(shí)驗(yàn)均按照深圳大學(xué)動物倫理要求實(shí)驗(yàn)。5～6周雌性裸鼠購于北京華富康動物有限公司，動物許可證批號：SCXK(京)2019-0008。鼻咽癌荷瘤形成實(shí)驗(yàn)，5-8F YBX3-Control組和5-8F YBX3-ShRNA組細(xì)胞2×106個細(xì)胞用30 μl PBS重懸，注射器打于小鼠背部皮下，10天后開始測量腫瘤，間隔4天測量一次，30天后安樂處死小鼠，收集腫瘤，稱腫瘤重量，拍照后，取腫瘤組織保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.10 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均用Graphpad Prism 7.0 軟件分析。所有計(jì)量資料均用均數(shù)(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，不同組間比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YBX3在鼻咽癌細(xì)胞中高表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示與正常鼻咽上皮細(xì)胞NP460相比，YBX3在鼻咽癌細(xì)胞中的蛋白水平表達(dá)顯著升高，且在惡性程度比較高的5-8F細(xì)胞中表達(dá)最高(圖1A)。進(jìn)一步Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示YBX3在鼻咽癌細(xì)胞RNA水平也得到相似得結(jié)論，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1B)。綜合考慮，選取5-8F細(xì)胞用于后續(xù)功能和分子機(jī)制的研究。

注：A為Western blot 檢測YBX3在正常鼻咽上皮和鼻咽癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況；B為Q-PCR 檢查YBX3在正常鼻咽上皮和鼻咽癌細(xì)胞中的mRNA表達(dá)情況。

2.2 YBX3干擾效率檢測

采用SiRNA 瞬轉(zhuǎn)和慢病毒ShRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾5-8F細(xì)胞YBX3的表達(dá)。Western blot 結(jié)果顯示與YBX3-Control 組比較，三條SiRNA瞬轉(zhuǎn)干擾YBX3的蛋白水平表達(dá)情況，其中第二和第三條SiRNA效果顯著(圖2A)；而三條慢病毒ShRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾YBX3的蛋白水平表達(dá)情況，三條ShRNA的敲除效果都很顯著(圖2C)。進(jìn)一步Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SiRNA和ShRNA干擾YBX3表達(dá)在RNA水平也得到與Western blot相似得結(jié)果，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2B和2D)。綜合考慮，分別選擇了SiRNA和ShRNA干擾效果最顯著的第二條和第三條用于后續(xù)體內(nèi)外功能和分子機(jī)制的研究。

2.3 YBX3促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖

將上述瞬時干擾YBX3表達(dá)后的5-8F細(xì)胞進(jìn)行CFSE細(xì)胞流式增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在CFSE染色48小時后，YBX3-SiRNA 組細(xì)胞熒光強(qiáng)度遞減顯著減慢，提示細(xì)胞增殖減慢(圖3A)。之后再利用穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾YBX3表達(dá)的5-8F細(xì)胞進(jìn)行CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)。在CCK8實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示與YBX3-Control組相比，YBX3-ShRNA組細(xì)胞增殖活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3B)。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示與YBX3-Control組相比，YBX3-ShRNA組細(xì)胞單克隆形成數(shù)目也顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3C、3D)?？傊陨霞?xì)胞增殖相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)表明YBX3能促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖。

2.4 YBX3促進(jìn)鼻咽癌腫瘤生長

將YBX3-Control和YBX3-ShRNA的5-8F細(xì)胞注射裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與YBX3-Control組比較，YBX3-ShRNA組顯著抑制鼻咽癌腫瘤生長的重量和大小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4A-4C)。以上在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)敲除YBX3的表達(dá)顯著抑制鼻咽癌腫瘤生長。

注：A為Western blot 檢測5-8F細(xì)胞siRNA瞬轉(zhuǎn)干擾YBX3蛋白表達(dá)情況；B為Q-PCR 檢測5-8F細(xì)胞SiRNA瞬轉(zhuǎn)干擾YBX3 mRNA表達(dá)情況；C為Western blot 檢測5-8F細(xì)胞慢病毒shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾YBX3蛋白表達(dá)情況；D為 Q-PCR 檢測5-8F細(xì)胞慢病毒shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾YBX3 mRNA表達(dá)情況。

2.5 YBX3促進(jìn)鼻咽癌腫瘤生長的分子機(jī)制

通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測觀察到干擾YBX3后細(xì)胞總p38無顯著變化，但p-p-38顯著降低，明顯改變了MAPK p-38通路的活性(圖5)。進(jìn)一步下游增殖關(guān)鍵蛋白Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)干擾YBX3的表達(dá)后顯著降低PCNA的表達(dá)(圖5)。以上結(jié)果表明，YBX3可通過調(diào)節(jié)MAPK p38/PCNA途徑促進(jìn)鼻咽癌腫瘤生長。

圖5 YBX3促進(jìn)鼻咽癌腫瘤生長的分子機(jī)制

3 討論

鼻咽癌是一種具有明顯地域性的腫瘤，也是我國重點(diǎn)防治的惡性腫瘤之一[9]。鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移受多種因素參與，其中腫瘤細(xì)胞異常增殖是影響腫瘤生長的最重要的因素[10]。近年，研究顯示YBX3在多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，并參與腫瘤細(xì)胞多種生物學(xué)過程[11,12]。而在鼻咽癌中，目前只有馬俊教授團(tuán)隊(duì)利用臨床鼻咽癌轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者組織通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)YBX3 可能是鼻咽癌轉(zhuǎn)移的一個候選蛋白，但有關(guān)YBX3與鼻咽癌細(xì)胞增殖和生長的生物學(xué)作用和機(jī)制目前尚未見報道[13]。

本研究首先對比正常鼻咽上皮細(xì)胞NP460和不同鼻咽癌細(xì)胞中YBX3的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NP460相比，鼻咽癌細(xì)胞中YBX3蛋白和RNA的表達(dá)顯著升高，且惡性程度較高的5-8F細(xì)胞中YBX3表達(dá)最高，由此推測YBX3基因異常高表達(dá)可能參與了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。腫瘤細(xì)胞異常增殖是腫瘤生長的核心機(jī)制，而腫瘤細(xì)胞增殖受多種信號通路共同調(diào)控[14]。本研究通過多種細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾YBX3的表達(dá)顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖；同時，小鼠在體的荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)YBX3-ShRNA組顯著抑制了腫瘤生長。這些體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)YBX3在鼻咽癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長中發(fā)揮了重要作用。

隨后，本項(xiàng)目對YBX3促進(jìn)鼻咽癌增殖的分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究。研究顯示 MAPK通路的激活參與細(xì)胞多種生物學(xué)功能，如細(xì)胞增殖、遷移、生長和凋亡[15]。MAPK通路主要包括三類激酶：MAPK/p38、MAPK/ERK和MAPK/JNK，它們分別通過磷酸化形式改變其活性而發(fā)揮生物學(xué)作用[16]。此外，MAPK途徑在腫瘤中異常激活已被證實(shí)可作為抗腫瘤治療的靶標(biāo)；近年發(fā)現(xiàn)其在鼻咽癌中異常激活并對鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展起了重要作用[17,18]。本研究發(fā)現(xiàn)與YBX3-Control 組相比，YBX3-ShRNA組顯著抑制MAPK p38通路活性。此外，本研究還檢測了細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)與YBX3-Control 組相比，YBX3-ShRNA組PCNA的表達(dá)顯著抑制[19,20]。 PCNA是一種高度保守的36～37kD的蛋白，其作為細(xì)胞增殖活性的下游指標(biāo)已被廣泛應(yīng)用，尤其在腫瘤細(xì)胞增殖中的異常表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[21,22]。以上結(jié)果證實(shí)YBX3參與鼻咽癌細(xì)胞增殖通過MAPK p38/PCNA是其一個新的下游分子機(jī)制。

注：A為CFSE檢查siRNA干擾YBX3后對細(xì)胞增殖的影響。B為CCK8檢查shRNA干擾YBX3后對細(xì)胞增殖活性的影響。C為單克隆形成實(shí)驗(yàn)檢查shRNA干擾YBX3后對細(xì)胞增殖的影響。D為單克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

綜上，本研究證實(shí)YBX3基因異常高表達(dá)參與了鼻咽癌的生長。在鼻咽癌中YBX3通過MAPK p38/PCNA途徑參與調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長。項(xiàng)目下一步將探討YBX3在鼻咽癌患者中的表達(dá)及與患者的生存相關(guān)性分析，以期為臨床治療提供有力證據(jù)。

注：A為5-8F荷瘤組織圖(每組6只老鼠6個腫瘤)；B為5-8F腫瘤重量圖(每組6只老鼠6個腫瘤)；C為5-8F腫瘤生長曲線圖(每組6只老鼠6個腫瘤)。