石 楊 李家豪 于 月 楊雨薇 李 斌 陳思奇 陳 稷 趙 珂 黃 進(jìn)#

(1.成都理工大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610059；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，四川 成都 611130)

隨著工業(yè)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，土壤重金屬污染已成為重要的環(huán)境問(wèn)題之一[1]。土壤重金屬污染會(huì)通過(guò)食物鏈傳遞進(jìn)入人體，從而影響人體健康。因此，進(jìn)行重金屬污染土壤的修復(fù)至關(guān)重要。目前，重金屬污染土壤的修復(fù)技術(shù)有很多，如土壤置換修復(fù)技術(shù)、電化學(xué)修復(fù)技術(shù)等，但這些技術(shù)勞動(dòng)強(qiáng)度大，對(duì)環(huán)境二次污染嚴(yán)重[2-3]。植物修復(fù)技術(shù)作為一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的修復(fù)技術(shù)，有著廣闊的應(yīng)用前景，受到廣泛關(guān)注和認(rèn)可[4]。利用雞冠花(CelosiaargenteaLinn.)對(duì)Cd污染的農(nóng)田土壤進(jìn)行3年的植物修復(fù)后，土壤中的Cd可以下降6.34%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))[5]。運(yùn)用伴礦景天(Sedumplumbizincicola)對(duì)Cd污染土壤進(jìn)行植物修復(fù)，土壤Cd去除率可高達(dá)84.5%[6]。盡管植物修復(fù)技術(shù)對(duì)環(huán)境二次污染小、運(yùn)行成本低、修復(fù)效果也較好，但可用于土壤修復(fù)的植物資源稀少，修復(fù)植物的選擇僅限于某些超富集植物。目前，可利用基因工程技術(shù)對(duì)植物重金屬吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因進(jìn)行改造，增強(qiáng)植物對(duì)重金屬的吸收以及對(duì)重金屬脅迫的耐受性；通過(guò)接種微生物或利用材料化學(xué)技術(shù)可改善重金屬脅迫下的植物生長(zhǎng)狀況，提高其存活率，也能擴(kuò)展修復(fù)植物的選擇。因此，本研究重點(diǎn)綜述了基因工程、微生物、材料化學(xué)技術(shù)與植物修復(fù)技術(shù)聯(lián)用的進(jìn)展與前景，以期為實(shí)際應(yīng)用中的植物修復(fù)技術(shù)提供更多新的思路和參考。

1 基因工程技術(shù)與植物修復(fù)技術(shù)聯(lián)用進(jìn)展

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，從分子水平上對(duì)重金屬在植物中的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、積累機(jī)制進(jìn)行研究，并利用控制這些過(guò)程的關(guān)鍵基因提高植物修復(fù)重金屬污染土壤的能力，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者正在探索的一個(gè)新領(lǐng)域。

在全基因關(guān)聯(lián)分析、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等高通量測(cè)序技術(shù)的幫助下，許多與重金屬吸收、耐受性相關(guān)的基因及蛋白質(zhì)已被鑒定出來(lái)[7-9]，主要表達(dá)產(chǎn)物包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、配體、金屬還原酶、金屬硫蛋白等，在植物對(duì)重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒等調(diào)控通路中發(fā)揮作用。目前，利用基因工程技術(shù)提高植物修復(fù)重金屬污染土壤能力的研究主要集中于金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括參與重金屬?gòu)母奈盏角o的轉(zhuǎn)運(yùn)的鐵鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(ZIP)，可幫助重金屬穿過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜的自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白家族(NRAMP)，被證明在重金屬吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒過(guò)程中發(fā)揮功能的重金屬三磷酸腺苷(ATP)酶蛋白家族與陽(yáng)離子擴(kuò)散促進(jìn)子蛋白家族(CDF)等[10]。在Cd污染的土壤中生長(zhǎng)的龍葵(SolanumnigrumL.)體內(nèi)NRAMP基因的表達(dá)量會(huì)升高，高表達(dá)量的NRAMP基因會(huì)增加龍葵對(duì)Cd的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，而且NRAMP基因在龍葵不同部位的表達(dá)量與Cd在該部位的積累量相關(guān)[11]。DITUSA等[12]還發(fā)現(xiàn)，砷酸鹽可誘導(dǎo)蜈蚣草(Pterisvittata)中編碼磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的PvPht蛋白的PvPht1、PvPht3基因的表達(dá)，并提高蜈蚣草對(duì)As的吸收能力。

由于植物的基因型基本上決定了植物對(duì)重金屬污染土壤修復(fù)的效率，加上植物基因組復(fù)雜且植物育種周期長(zhǎng)，使得重金屬超富集植物的篩選和培育一直進(jìn)展緩慢。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可同時(shí)針對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行靶向編輯，即可對(duì)NRAMP、CDF、ZIP等多個(gè)蛋白家族的基因進(jìn)行編輯，以改變它們的表達(dá)方式或表達(dá)量，從而提高植物對(duì)重金屬的吸收或耐受性[13-14]。WANG等[15]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)水稻(Oryzasativa)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的OsARM1基因敲除后，提高了水稻對(duì)As的耐受性。盡管CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)發(fā)展?jié)摿薮?，但由于精?xì)基因組信息的缺失及目前CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)適用性存在不確定性，因此該技術(shù)仍有待檢驗(yàn)。

另有研究表明，將一些負(fù)責(zé)調(diào)控植物螯合素、金屬配體的基因轉(zhuǎn)入植物后，植物修復(fù)重金屬污染土壤的能力會(huì)明顯提升[16]。金屬硫蛋白基因MT2b的轉(zhuǎn)入可提高短腳芥菜(Hirschfeldiaincana)對(duì)Pb的耐受性和積累能力[17]；油菜(BrassicanapusL.)中轉(zhuǎn)入分別編碼ATP磺?；负臀腚装彼峒谆D(zhuǎn)移酶的APS和SMT基因，油菜中Se的積累量就會(huì)有明顯提高[18]；將厚藤(Ipomoeapes-caprae)螯合素基因IpPCS1t轉(zhuǎn)入擬南芥(Arabidopsisthaliana)后，可明顯提高擬南芥的Cd耐受性[19]。然而，目前對(duì)于大多數(shù)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物中的具體基因位置、體內(nèi)效應(yīng)、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制等了解尚不深入，因此需要對(duì)此類蛋白質(zhì)的功能、作用機(jī)制等進(jìn)行進(jìn)一步的研究。盡管基因工程技術(shù)在重金屬污染土壤植物修復(fù)中的應(yīng)用潛力巨大，但面臨的困難和風(fēng)險(xiǎn)不可忽視。由于植物對(duì)重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累機(jī)制復(fù)雜，涉及的基因多，因此科研和應(yīng)用的難度很大。近年來(lái)，在植物代謝產(chǎn)物研究較為熱門的系統(tǒng)生物學(xué)中的研究方法也許可以為系統(tǒng)性地提高植物的重金屬吸收、耐受性提供一些參考。另外，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，基于食品安全和生態(tài)安全方面的考慮，轉(zhuǎn)基因植物獲得商業(yè)化應(yīng)用許可還存在一些技術(shù)和制度的壁壘，轉(zhuǎn)基因植物在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)食品安全和生態(tài)安全問(wèn)題必須進(jìn)行充分論證。

2 微生物技術(shù)與植物修復(fù)技術(shù)聯(lián)用進(jìn)展

植物根際是植物-土壤-微生物相互作用的復(fù)雜區(qū)域，其中的微生物對(duì)植物在重金屬污染土壤修復(fù)過(guò)程中有著非常重要的影響。微生物可以改變土壤的理化性質(zhì)進(jìn)而改變重金屬形態(tài)，也可以分泌有機(jī)酸、表面活性劑等對(duì)重金屬形態(tài)進(jìn)行改變，使植物可以更容易吸收土壤重金屬，從而提高植物修復(fù)效率[20-21]。

2.1 植物根際促生細(xì)菌(PGPR)的作用

PGPR因其對(duì)重金屬等外部不利環(huán)境有一定抗性，并具備維持土壤肥力、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的能力，因此可增強(qiáng)植物對(duì)重金屬污染的修復(fù)能力[22-24]。

PGPR產(chǎn)生的生物表面活性劑是既含有親水基團(tuán)又含有疏水基團(tuán)的兩親化合物，可在土壤界面與重金屬形成復(fù)合物，然后通過(guò)降低土壤與水的界面張力將土壤中的重金屬解吸，提高重金屬的生物有效性，進(jìn)而提高植物修復(fù)效率[25-26]。此外，PGPR分泌的胞外多糖(EPS)是一種由多糖、蛋白質(zhì)、腐殖質(zhì)和糖蛋白等組成的高分子量次生代謝復(fù)合物[27-28]，因具有羥基、磷酸根等功能基團(tuán)可與Cd、Cu、Pb等重金屬進(jìn)行絡(luò)合，從而降低重金屬的毒性，也可提高植物修復(fù)重金屬污染土壤的能力[29-31]。由此，將PGPR與修復(fù)植物結(jié)合的植物-微生物修復(fù)技術(shù)得以發(fā)展[32]。

另一方面，PGPR對(duì)植物的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，包括固氮作用、溶磷作用和分泌植物激素的促生作用等。PGPR分泌的生長(zhǎng)素(IAA)可促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物應(yīng)對(duì)不良環(huán)境的能力[33]。當(dāng)植物處于重金屬脅迫時(shí)，植物根系受到抑制，PGPR可通過(guò)ipdC基因參與IAA的生物合成調(diào)控，在植物的根系發(fā)育、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及誘導(dǎo)植物抗病性等方面發(fā)揮積極作用[34-35]。另外，在植物處于重金屬脅迫時(shí)，具有1-氨基環(huán)丙基-1-羧酸(ACC)脫氨酶活性的PGPR可將植物中乙烯前體ACC裂解成氨和α-酮丁酸酯，從而降低植物乙烯水平，使植物內(nèi)部的乙烯水平不至于抑制植物的生長(zhǎng)，進(jìn)而提高植物在重金屬脅迫下的存活能力[36-38]。同時(shí)，植物又為PGPR提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)具有ACC脫氨酶活性的PGPR生長(zhǎng)，因此PGPR與植物組成了一個(gè)應(yīng)對(duì)重金屬脅迫的正向反饋系統(tǒng)[39-40]。已有研究發(fā)現(xiàn)，PGPR中存在多個(gè)基因參與調(diào)控植物激素、鐵載體、固氮酶復(fù)合物等的分泌[41-42]，因此也可用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)PGPR進(jìn)行基因編輯，以增強(qiáng)植物固氮、固鐵能力，從而改善植物的生長(zhǎng)和對(duì)重金屬的富集。當(dāng)然在實(shí)際操作過(guò)程中，對(duì)于基因編輯后的PGPR的風(fēng)險(xiǎn)仍要進(jìn)行充分的評(píng)估，包括可控性、安全性等。綜上所述，重金屬脅迫下PGPR-植物系統(tǒng)的基本調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖1。

圖1 重金屬脅迫下PGPR-植物系統(tǒng)基本調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

當(dāng)植物處于重金屬脅迫時(shí)，PGPR對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的促進(jìn)作用已被大量研究所證實(shí)。因此，如何使PGPR在植物根系周圍更好地定植，在提高植物對(duì)重金屬耐受性方面有著重要的意義。根系分泌物作為PGPR與植物之間進(jìn)行信息交流的媒介，對(duì)PGPR更好地定植在植物根系周圍有著重要的作用[43]。因此，積極探索PGPR-根系分泌物-植物三者之間的物質(zhì)交換與信息交流機(jī)制，可能成為今后的一個(gè)研究重點(diǎn)，對(duì)于提高植物在重金屬脅迫下的存活率及富集能力有重要意義。

2.2 菌根真菌的作用

菌根真菌是另一類重要的影響植物修復(fù)重金屬污染土壤過(guò)程的微生物，在改善處于重金屬脅迫下的植物的生長(zhǎng)發(fā)育方面表現(xiàn)出巨大的潛力。在自然條件下，土壤中的菌根真菌會(huì)與植物根系形成一個(gè)共生體結(jié)構(gòu)——菌根。菌根真菌除為它們的寄主植物提供無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)以交換有機(jī)營(yíng)養(yǎng)外，也在寄主植物對(duì)重金屬的富集過(guò)程中發(fā)揮重要作用[44-46]。最近，如何利用菌根真菌與寄主植物之間的共生關(guān)系提高植物修復(fù)重金屬污染土壤的效率逐漸成為研究熱點(diǎn)。

菌根對(duì)植物修復(fù)重金屬污染土壤能力的改善是通過(guò)其對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)吸收、重金屬耐受能力、激素水平、重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力的影響而實(shí)現(xiàn)的[47]。在研究菌根對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)吸收能力的影響過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，菌根植物的營(yíng)養(yǎng)狀況大多優(yōu)于非菌根植物，這是因?yàn)橹参锿ㄟ^(guò)菌根菌絲擴(kuò)大了根系吸收的有效面積[48]。菌根對(duì)植物應(yīng)對(duì)重金屬脅迫能力的影響主要表現(xiàn)為菌根可以刺激寄主植物合成多種具有抗逆作用的代謝產(chǎn)物，如谷胱甘肽、脯氨酸和酚類化合物等，并可以提高寄主植物體內(nèi)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等抗氧化酶活性，清除過(guò)量活性氧從而提高寄主植物對(duì)重金屬的耐受性[49-50]。至于菌根對(duì)植物激素水平的影響方面，有研究表明，菌根可顯著上調(diào)枳橘(Poncirustrifoliata)根系中吲哚-3-丙酮酸單加氧酶基因和生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3基因的表達(dá)或顯著降低IAA外流載體2和8的轉(zhuǎn)錄水平，從而間接影響重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力[51]。另外，菌根真菌還參與植物中與重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)、積累相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[52]。有研究表明，菌根可通過(guò)上調(diào)根瘤菌SrPCS3基因的表達(dá)水平而提高植物對(duì)重金屬的耐受性[53]。銀灰楊(Populuscanescens)在與外生菌根真菌共生形成菌根后，與重金屬吸收、易位、解毒和分離有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平提高，植株中的Cd積累量明顯提高[54]。此外，菌根還可誘導(dǎo)銀灰楊中編碼H+-ATP酶的HA2.1和AHA10.1基因轉(zhuǎn)錄水平的提高，并進(jìn)一步活化Ca2+通道，最終刺激銀灰楊對(duì)Cd2+的吸收[55]。蚯蚓(Eiseniafetida)可進(jìn)一步提高菌根的植物修復(fù)重金屬污染土壤的效率[56]。在Cd污染土壤中，同時(shí)接種菌根真菌和蚯蚓后，龍葵(Solanumnigrum)植株地上部分的生物量增加，同時(shí)其Cd積累量也提高[57]。因此，在研究思路上可以進(jìn)一步打破物種界限，將動(dòng)物、植物、微生物之間的相互促進(jìn)關(guān)系應(yīng)用于植物修復(fù)重金屬污染土壤中。

3 材料化學(xué)技術(shù)與植物修復(fù)技術(shù)聯(lián)用進(jìn)展

在受重金屬污染嚴(yán)重的土壤中，修復(fù)植物常常面臨無(wú)法正常生長(zhǎng)的問(wèn)題，生存率很低，土壤改良劑、螯合劑能很好地緩解此難題。

3.1 土壤改良劑的應(yīng)用

土壤改良劑可顯著提高植物的重金屬污染土壤修復(fù)能力[58]。農(nóng)作物殘?jiān)?、家禽糞便等燃燒產(chǎn)生的生物炭是一種很好的土壤改良劑，不僅能夠吸附土壤重金屬，而且可以提高土壤肥力[59]。GU等[60]發(fā)現(xiàn)，重金屬污染土壤中加入玉米秸稈生物炭后，甜菜(Betavulgarisvar.ciclaL.)對(duì)Cd的積累量提高到206%。同樣，ZHANG等[61]在種植紫花苜蓿(MedicagosativaL.)的Cd污染土壤中添加生物炭后發(fā)現(xiàn)，土壤中的Cd含量顯著降低。

海泡石因其表面具有豐富的官能團(tuán)、礦物質(zhì)等可顯著降低重金屬對(duì)植物的危害，也可作為土壤改良劑。BASHIR等[62]研究海泡石對(duì)土壤中Cd溶解度的影響，發(fā)現(xiàn)海泡石投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，可溶性Cd減少了42.8%，而殘?jiān)鼞B(tài)Cd增加了30.8%，在一定程度上緩解了重金屬對(duì)修復(fù)植物的危害。ZHAN等[63]利用海泡石和生物炭對(duì)Cd、Pb污染的玉米田土壤進(jìn)行處理，增加了農(nóng)田土壤的有效養(yǎng)分含量和玉米產(chǎn)量。

大量研究成果已經(jīng)表明，土壤改良劑不僅可以吸附重金屬，同時(shí)可以為植物提供營(yíng)養(yǎng)成分或促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在改善修復(fù)植物初期生存率低問(wèn)題上有明顯效果。

3.2 螯合劑的應(yīng)用

螯合劑在提高植物修復(fù)重金屬污染土壤能力方面一直有著較好的表現(xiàn)，主要通過(guò)與重金屬形成水溶性螯合物而使重金屬具有較高的流動(dòng)性，易于被植物吸收，從而提高植物的富集效率[64-65]。LI等[66]研究發(fā)現(xiàn)，5 mmol/kg乙二胺四乙酸(EDTA)降低了土壤9.7%的陽(yáng)離子交換能力，增加了8.6%的土壤有機(jī)質(zhì)，同時(shí)使黑麥草(LoliumperenneL.)對(duì)重金屬的吸收能力增強(qiáng)。

雖然螯合劑可一定程度上促進(jìn)受重金屬脅迫的植物生長(zhǎng)，并提高植物修復(fù)重金屬污染土壤的效率，但高劑量的螯合劑對(duì)植物生長(zhǎng)也會(huì)有抑制作用，并在施用過(guò)程中容易出現(xiàn)重金屬的解吸速率大于植物吸收速率而造成污染擴(kuò)大的情況，同時(shí)螯合劑的毒性、難降解性也不容忽視[67]，因此螯合劑在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性。目前，可利用響應(yīng)面法、人工智能法等對(duì)螯合劑用量進(jìn)行科學(xué)、合理的定制。最近，HU等[68]通過(guò)科學(xué)設(shè)計(jì)，量化確定了10.0 mmol/kg檸檬酸和5.0 mmol/kg S,S-乙二胺二琥珀酸可以不抑制博落回(Macleayacordata)生長(zhǎng)，并可最大限度地提高對(duì)U污染土壤的植物修復(fù)效果。研發(fā)可降解螯合劑并固定到載體材料中同時(shí)進(jìn)行科學(xué)的用量控制已成為當(dāng)下的研究趨勢(shì)。

4 前景展望

(1) 進(jìn)一步完善植物對(duì)重金屬吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究，并通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行定向改良，設(shè)計(jì)生長(zhǎng)快、根系發(fā)達(dá)、吸收重金屬能力強(qiáng)、耐重金屬能力強(qiáng)的理想植物品種應(yīng)用于植物修復(fù)技術(shù)。但對(duì)植物進(jìn)行基因改造后，必須對(duì)其安全性進(jìn)行充分的論證。

(2) 深入研究動(dòng)物、植物、微生物和根系分泌物之間的相互作用機(jī)制，重點(diǎn)尋找可有效提高植物修復(fù)能力的微生物用于促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)吸收，改變土壤理化性質(zhì)和重金屬生物有效性等，使得植物更好地適應(yīng)重金屬污染土壤。

(3) 研發(fā)新的能夠降低重金屬毒性、有利于植物富集重金屬且對(duì)環(huán)境二次污染小的化學(xué)材料，精準(zhǔn)設(shè)計(jì)其用量。