尹樂斌，何 平，劉椏麗，李樂樂，羅雪韻，楊學(xué)為

（1.邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽 422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南 邵陽 422000）

豌豆（Pisum sativumL.）屬于豆科豌豆屬植物，主要分布在我國中部，東北部。干豌豆含有蛋白質(zhì)14%～31%、淀粉30%～50%，膳食纖維3%～27%和其他生物活性物質(zhì)[1]，可用于生產(chǎn)面粉、蛋白質(zhì)、淀粉和纖維等以營養(yǎng)豐富為生產(chǎn)需求的高市場價值交易食品，但干豌豆作為面粉形式，因其令人不快的味道而受到高度限制[2]。將豌豆成分分離后加以利用可以盡可能地去除異味，有效提高其生產(chǎn)價值。豌豆淀粉提取簡單易得，直鏈淀粉含量相對較高（35%～65%）[3]。高直鏈淀粉糊化時會出現(xiàn)吸水溶脹力弱，再生后凝膠脆度大等缺點[1]，在食品加工領(lǐng)域受到嚴(yán)重限制。因此，為了擴(kuò)大應(yīng)用范圍人們常常采用物理、化學(xué)、酶法[4]對豌豆淀粉進(jìn)行改性。其中酶解法是一種提高慢消化淀粉含量的高效環(huán)保法。常用于該方法的酶主要是專一作用于淀粉中α-1,6糖苷鍵普魯蘭酶，一種重要脫支酶。淀粉分子經(jīng)過脫支處理后，可使淀粉充分水解，產(chǎn)生更多的短鏈；脫支淀粉回生使得短鏈相互聚集，重新排列，形成抗性淀粉，提高淀粉原料利用率，具有良好的應(yīng)用和研究價值。

抗性淀粉（resistant starch，RS）又名抗酶解淀粉，一種不能在小腸內(nèi)消化，被大腸細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸、乳酸和少量氣體等人體有益物質(zhì)的一種淀粉[5]。根據(jù)抗性淀粉來源和性質(zhì)差異，RS被分成：物理包埋淀粉（RS1）、生淀粉顆粒（RS2）、老化回生淀粉（RS3）、化學(xué)改性淀粉（RS4）、直鏈淀粉-脂肪復(fù)合淀粉（RS5）5種類型[6]。RS具有促進(jìn)腸道有益菌繁殖改變結(jié)腸微生物分布情況、預(yù)防結(jié)腸癌[7]、改善炎癥[8]等潛在生理功能。此外，RS在調(diào)節(jié)糖脂代謝基因表達(dá)[9]，改善人體胰島素敏感性[10]等方面也發(fā)揮重要作用。目前，抗性淀粉制備方法主要有水熱處理法、脫支處理法、機械輔助法[11]，單一的方法產(chǎn)量較小、生產(chǎn)成本高、反應(yīng)速率低、生產(chǎn)時間長等缺點，與之相比，兩種方法協(xié)同得到抗性淀粉含量更高，溶解度、黏度、膨脹力等性質(zhì)更好。本研究采用壓熱-普魯蘭酶酶解豌豆淀粉制備豌豆抗性淀粉，對其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并分析檢測最佳工藝條件下豌豆抗性淀粉的理化性質(zhì)，為豌豆淀粉的利用以及抗性淀粉的開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆：唐山德健生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；胃蛋白酶（酶活1 000 U/g）：河北格貝達(dá)生物科技有限公司；普魯蘭酶（酶活50 000 U/g）：河南匯之全實業(yè)有限公司；葡萄糖淀粉酶（酶活100 000 U/g）：河南糖柜食品有限公司；其他試劑均為分析純；試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

IS-RSD3臺式恒溫振蕩器：蘇州捷美電子有限公司；3H16RI臺式高速冷凍離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；D-7紫外可見分光光度計：南京菲勒儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

葡萄糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法[12]。取1 mL不同質(zhì)量濃度0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL的葡萄糖，分別加入1 mL DNS顯色試劑，沸水浴6 min，定容至10 mL，顯色10 min，測定溶液吸光度值（A540nm），以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.812 1x-0.008 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。

1.3.2 豌豆淀粉制備

參照裴亞瓊等[13]方法并進(jìn)行部分修改提取豌豆淀粉。將豌豆去皮，烘干粉碎，按照1∶7（g∶mL）料液比加入0.4%氫氧化鈉溶液，35 ℃、180 r/min搖床18 h，3 000 r/min離心10 min得沉淀，用約沉淀質(zhì)量3倍的水洗滌2次，調(diào)pH至7.0，離心洗滌沉淀，50 ℃干燥24 h，粉碎過160目篩，得到豌豆淀粉。

1.3.3 豌豆抗性淀粉制備工藝優(yōu)化單因素試驗

稱取7.5 g豌豆豆淀粉工藝優(yōu)化并加入50 mL水于錐形瓶中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%豌豆淀粉乳，分別調(diào)節(jié)豌豆淀粉溶液pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，添加酶活為50 000 U/g普魯蘭酶0.005 g、0.010 g、0.015 g、0.020 g、0.025 g，在溫度40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃恒溫振蕩酶解24 h。121 ℃壓熱20 min，流水冷卻至室溫，4 ℃老化16 h、19 h、22 h、25 h、28 h。烘干老化淀粉（50 ℃，12 h），高速粉碎、過160目篩，即得豌豆抗性淀粉，于4 ℃保存。

1.3.4 豌豆抗性淀粉制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以酶解pH（A）、酶添加量（B）、酶解溫度（C）及老化時間（D）作為自變量，以抗性淀粉產(chǎn)率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)置低（-1）、中（0）、高（1）三個水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗。應(yīng)用Box-Behnken試驗設(shè)計，通過Design-Expert 8.0.6.1軟件確定最佳制備工藝，Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.5 豌豆抗性淀粉含量及產(chǎn)率的測定

根據(jù)姜志杰等[14]的方法并進(jìn)行適度修改。稱取100 mg豌豆抗性淀粉；加入1 mol/L鹽酸-氯化鉀緩沖液10 mL（pH 1.5）、1 000 U/g胃蛋白酶溶液0.2 g；40 ℃、180 r/min搖床振蕩60 min；加入0.2 mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液9 mL（pH 6.2）、18 U/mL耐高溫α-淀粉酶溶液1 mL；100 ℃振蕩30 min；加入3 U/mL葡萄糖淀粉酶溶液4 mL；60 ℃、180 r/min在搖床振蕩60 min；10 000 r/min離心10 min，得到沉淀；加入2 mol/L氫氧化鉀溶液6 mL；25 ℃、180 r/min搖床振蕩30 min；加入2 mol/L鹽酸溶液5.5 mL、1.2 mol/L醋酸鈉緩沖溶液3 mL（pH 3.8）；調(diào)節(jié)pH至4.75；加入330 U/g葡萄糖淀粉酶液0.4 mL；60 ℃、180 r/min搖床振蕩45 min；定容至50 mL，10 000 r/min離心15 min，收集上清液；測定樣品溶液吸光度值（A540nm）。按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算豌豆抗性淀粉含量，豌豆抗性淀粉產(chǎn)率計算公式如下：

式中：YRS為抗性淀粉產(chǎn)率，%；GC為葡萄糖含量，mg/mL；50為測定溶液體積，mL；100為測定豌豆抗性淀粉質(zhì)量，g；0.9為游離葡萄糖與脫水葡萄糖之間的換算系數(shù)。

1.3.6 豌豆抗性淀粉純化

將未純化豌豆抗性淀粉配制成10%的抗性淀粉乳液，用檸檬酸-磷酸氫二鈉調(diào)至pH 6.5，加入90 ℃耐高溫α-淀粉酶酶解2 h，100 ℃滅酶10 min，冷卻至室溫，加入體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇靜置4 h，4 000 r/min離心15 min，并用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇洗滌得沉淀，50 ℃烘干，粉碎，過160目篩，得到純化的豌豆抗性淀粉。

1.3.7 豌豆抗性淀粉理化性質(zhì)檢測

（1）透明度

抗性淀粉的透明度以透光率值表示。稱取0.1 g的抗性淀粉配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的抗性淀粉乳，沸水浴30 min，水調(diào)整至10 mL。將樣品儲存在4 ℃中密封保存0、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h，分別在波長620 nm處測定淀粉糊的透光率。

（2）凍融穩(wěn)定性

1.5g抗性淀粉樣品，加入蒸餾水25mL，95℃水浴30min，得到糊化物質(zhì)，4 ℃冷藏24 h后-18 ℃冷凍12 h，加入蒸餾水溶解，4 000 r/min離心20 min，稱取沉淀質(zhì)量，析水率計算公式如下：

式中：m1為淀粉糊質(zhì)量，g；m2為沉淀質(zhì)量，g。

（3）溶解度與膨潤度

取0.5 g抗性淀粉樣品蒸餾水40 mL，水?。?0 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃）加熱30 min，4 000 r/min離心10 min，將上清液與沉淀分別于120 ℃干燥至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量，溶解度與膨潤度計算公式如下：

式中：SA為溶解度；SP為膨潤度；m3為上清液干燥后質(zhì)量，g；m4為沉淀干燥后質(zhì)量，g；0.5為測定樣品質(zhì)量，g。

（4）平均聚合度

抗性淀粉樣品0.02 g、0.5 mL無水乙醇、2 mol/mL氫氧化鉀溶液1 mL完全溶解樣品。加水至50 mL，pH調(diào)至6.0～7.0得到溶液1號，取5 mL溶液1號、40 mL去離子水、1 mL I2-KI溶液（2 mg/mL I2、20 mg/mL KI），定容50 mL。在波長450～800 nm處掃描樣品，找到吸光度峰的波長進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

實驗每組重復(fù)3次，采用WPS Office 2019、SPSS 20.0、Design-Expert 8.0.6.1等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆抗性淀粉制備工藝優(yōu)化單因素試驗

酶添加量對RS產(chǎn)率的影響如圖1a所示，隨著酶添加量在5～20 U/mL范圍內(nèi)的增加，RS產(chǎn)率隨之增大；酶添加量在20 U/mL時，RS產(chǎn)率最高，為25.994%；酶添加量＞20 U/mL之后，RS產(chǎn)率隨之下降。淀粉顆粒糊化后吸水膨脹使結(jié)晶區(qū)氫鍵斷裂，小分子淀粉溶出，酶直接作用于支鏈淀粉α-1,6-糖苷鍵，水解形成更多的游離直鏈淀粉分子，促進(jìn)老化過程中分子的重排，有利于RS的形成[15]。但添加量過多時，可能使得淀粉分子過分水解，分子鏈聚合度過低而不易形成抗性淀粉導(dǎo)致RS產(chǎn)率降低。因此，選用最適酶添加量為20 U/mL。

老化時間對RS產(chǎn)率的影響如圖1b所示，抗性淀粉的結(jié)晶理論即直鏈淀粉分子重結(jié)晶形成致密晶體結(jié)構(gòu)的過程[16]。淀粉分子晶核形成速度最快時間在12 h內(nèi)，之后晶核的增長變得減緩[17]。當(dāng)老化時間在16～22 h時，晶核逐漸增多抗性淀粉產(chǎn)率會不斷增加；當(dāng)老化時間在22 h時，RS產(chǎn)率最高，為25.024%，大多數(shù)淀粉分子會完全重結(jié)晶，剩下部分游離的豌豆支鏈淀粉；當(dāng)老化時間＞22 h之后，RS產(chǎn)率有所下降，可能是因為試驗過程中沒有防腐劑的加入，導(dǎo)致抗性淀粉出現(xiàn)輕微受損[18]，造成含量降低。因此，最適老化時間為22 h。

圖1 酶添加量（a）、老化時間（b）、酶解溫度（c）及酶解pH（d）對抗性淀粉產(chǎn)率的影響Fig.1 Effects of enzyme addition (a),aging time (b),enzymatic temperature (c) and enzymatic pH (d) on yield of resistant starch

溫度主要通過改變酶活性基團(tuán)的構(gòu)象、酶與底物解離狀態(tài)來影響整個酶促反應(yīng)進(jìn)程[19]。酶解溫度對RS產(chǎn)率的影響如圖1c所示，低酶解溫度會減慢酶促反應(yīng)速率，導(dǎo)致直鏈淀粉和豌豆抗性淀粉產(chǎn)量降低。當(dāng)酶解溫度在40～55 ℃范圍內(nèi)增加，RS產(chǎn)率隨之增加；當(dāng)酶解溫度在55 ℃時，RS產(chǎn)率最高，為21.431%；當(dāng)酶解溫度高于55 ℃，酶活性會迅速下降甚至失活，導(dǎo)致RS產(chǎn)率迅速下降。因此，最適酶解溫度為55 ℃。

pH對淀粉分子間的氫鍵以及酶活力有顯著的影響。在偏酸或偏堿的環(huán)境下，直鏈淀粉分子被分解成運動劇烈過短鏈分子，分子難以互相接近形成重結(jié)晶的晶體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抗性淀粉生成困難[20]。合適的H+濃度可促進(jìn)淀粉分子的結(jié)晶。在低H+濃度下，促進(jìn)作用相對較低。在高酸度或強堿度的情況下，淀粉中的分子間氫鍵阻礙，這不利于反應(yīng)的完成。酶解pH對RS產(chǎn)率的影響如圖1d所示，當(dāng)酶解pH在4.0～5.5范圍內(nèi)增加，RS產(chǎn)率隨之增加；當(dāng)酶解pH在5.5時，RS產(chǎn)率最高，為27.069%；當(dāng)酶解pH＞5.5之后，RS產(chǎn)率有所下降。因此，最適酶解pH值為5.5。

2.2 豌豆抗性淀粉制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，將影響因素酶解pH（A）、酶添加量（B）、酶解溫度（C）及老化時間（D）作為自變量，以抗性淀粉產(chǎn)率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)置低（-1）、中（0）、高（1）三個水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗。Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表

利用Design-Expert 8.0.6.1將表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合后，得到壓熱-酶解制備豌豆抗性淀粉條件的二次項回歸方程如下：

由表3可知，模型P值＜0.000 1，表明模型極顯著（P＜0.01）；失擬項P值=0.184＞0.05，不顯著，說明回歸方程與實際結(jié)果擬合度較好；決定系數(shù)R2=0.912、調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.825，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=1.82%，說明響應(yīng)面預(yù)測值與試驗值之間誤差較小。一次項B、C，二次項B2、C2對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），交互項AD，二次項A2、D2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。由F值可知，各因素對豌豆抗性淀粉制備的影響順序為：酶添加量（B）＞酶解溫度（C）＞酶解pH（A）＞老化時間（D）。經(jīng)軟件Design-Expert 8.0.6.1分析得出的最佳制備工藝條件為酶解pH 5.36、酶添加量17.28 U/mL、酶解溫度52.90 ℃、老化時間22.72 h，RS產(chǎn)率預(yù)測值為27.52%。結(jié)合實際生產(chǎn)情況，修正制備工藝條件為：酶解pH 5.4、酶添加量17.3 U/mL、酶解溫度53 ℃、老化時間23 h。在此優(yōu)化條件下，RS產(chǎn)率實際值為27.51%，與預(yù)測值差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 豌豆抗性淀粉理化性質(zhì)

淀粉透明度不僅反映了淀粉與水結(jié)合能力的強弱，還直接影響淀粉類食品外觀。研究表明，淀粉樣品透明度受淀粉顆粒膨脹度、分散程度、均勻與否、分子結(jié)構(gòu)和鏈長等影響[21]。淀粉顆粒膨脹度越大、分散均勻、分子鏈越長、支鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，淀粉的透明度就越高。由圖2a可知，壓熱酶解后的豌豆抗性淀粉的透光率（1.994%）與原淀粉透光率（1.483%）相比有明顯增加，可能是酶解后的抗性淀粉重結(jié)晶形成結(jié)晶體使得分子鏈長增加；純化后抗性淀粉的樣品成分單一分散更加均勻所以純化后的透明度（2.305%）呈增大趨勢。由圖2b可知，不同樣品儲藏不同時間的透光率看出隨著存儲淀粉時間的增加透明度降低，可能是隨著儲存時間的延長，淀粉聚集分散程度降低從而樣品穩(wěn)定性降低。

圖2 豌豆抗性淀粉理化性質(zhì)測定結(jié)果Fig.2 Determination results of physiochemical properties of pea resistant starch

凍融穩(wěn)定性是指樣品經(jīng)過凍結(jié)和融化交替處理后的穩(wěn)定性，通過析水率反應(yīng)的，與之成反比。由圖2c可知，壓熱酶解純化后的抗性淀粉的析水率（0.679）高于原豌豆淀粉（0.549），可能是淀粉處理之后分子間親水力增強而氫鍵的強度減弱，從而降低了淀粉的凍融穩(wěn)定性，與宋文天等[22]結(jié)果一致。

溶解度與膨潤度是評價淀粉與水之間分子作用力的關(guān)鍵指標(biāo)。由圖2d可知，在50～90 ℃時，壓熱酶解純化后的抗性淀粉的溶解度平均值（0.524）顯著高于豌豆淀粉（0.064），因為豌豆抗性淀粉制備時原豌豆淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞[23]，脫去部分支鏈淀粉游離于水中增加溶解度。由圖2e可知，與豌豆淀粉相比，純化抗性淀粉膨脹度降低是因為純化后樣品中游離的可溶性糖和小分子物質(zhì)被除去，結(jié)晶度增加的緣故，此處與宋昕祁[24]的研究結(jié)果相似。這樣豌豆抗性淀粉可以在熱處理食品中有較好的應(yīng)用。

抗性淀粉的形成與直鏈淀粉含量、分子質(zhì)量有關(guān)，聚合度太大、直鏈淀粉過長、分子間斥力大，難聚集形成抗性淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，所以適當(dāng)?shù)牡推骄酆隙扔欣谔岣咄愣箍剐缘矸鄣漠a(chǎn)率。由圖2f可知，豌豆淀粉（612.0 nm）經(jīng)過酶解處理后無論是純化前、還是純化后樣品（583.5 nm）的吸光度峰波長均向低波長移動，聚合度降低，表明壓熱酶解后更易形成抗性淀粉，與朱哲等[25]研究結(jié)果相似。

3 結(jié)論

壓熱-普魯蘭酶酶解制備豌豆抗性淀粉最佳制備工藝條件為酶解pH5.4、酶添加量17.3 U/mL、酶解溫度53 ℃、老化時間23 h。在此優(yōu)化條件下，制備的豌豆抗性淀粉產(chǎn)率為27.51%。壓熱-酶解后純化制備的豌豆抗性淀粉較豌豆淀粉貯藏穩(wěn)定性和溶解度增大，凍融穩(wěn)定性、膨潤度以及平均聚合度降低，說明豌豆抗性淀粉品在適當(dāng)?shù)臅r間內(nèi)儲藏穩(wěn)定性良好、分子間結(jié)合緊密、直鏈淀粉分子質(zhì)量降低。本研究為抗性淀粉的應(yīng)用提供廣闊的發(fā)展前景。