李會(huì)玲，黃紅艷，張路敏，葸慧敏，楊善德，孫曉杰，雷玉明，曹 禮*

（1.河西學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.河西學(xué)院 甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000）

苦豆子（Sophora alopecuroides）廣泛分布于我國(guó)西北部荒漠鹽堿地帶，是西北地區(qū)重要的自然植被的組成部分和藥用植物資源[1]?？喽棺诱旰头N子皆可入藥[2]，具有清熱解毒、止痛消炎、殺蟲(chóng)舒胃、抗腫瘤、抗氧化除自由基活性、保肝、醫(yī)治糖尿病等藥理活性[3-5]，可用于咽喉腫痛、急性痢疾、皮膚瘙癢、胃痛等多種疾病的治療[6-7]。

苦豆子中含有多種生物活性物質(zhì)，僅生物堿的種類(lèi)多達(dá)20多種[8]，其中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量較高[9]?？喽棺又械狞S酮類(lèi)物質(zhì)，具有廣譜抗菌和抗病毒作用，可以用于生物防治、生物農(nóng)藥、降低血脂、降低血液粘稠度、延長(zhǎng)紅血球壽命，增強(qiáng)造血功能、抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)等[10-13]。因此，苦豆子生物質(zhì)資源的合理開(kāi)發(fā)和利用，受到越來(lái)越多的關(guān)注。

響應(yīng)面分析法是通過(guò)有效的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，擬合試驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系得到回歸方程，進(jìn)一步分析回歸方程，可獲得到各因素的最佳工藝參數(shù)，可用于優(yōu)化多因素的一種有效統(tǒng)計(jì)方法。當(dāng)前，黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取方法主要有浸漬法、微波提取法、溶劑提取法[14]、超臨界流體萃取法[15]，也可通過(guò)大孔樹(shù)脂吸附法、金屬絡(luò)合法和硅膠分離法等精制黃酮類(lèi)物質(zhì)[16]。本研究運(yùn)用乙醇浸取法提取苦豆子中黃酮類(lèi)化合物，采用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用Design-Expert V8.0.6軟件建立苦豆子中黃酮類(lèi)提取物得率的二次回歸模型和確定其最佳提取條件，并對(duì)苦豆子提取液進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)和抑菌活性研究，為研究苦豆子中黃酮類(lèi)提取物的綜合利用與開(kāi)發(fā)提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦豆子：市售；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazide，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司。

LB（Luria-Bertani）固體培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：生工生物工程（上海）股份有限公司。

大腸桿菌（Escherichiacoli）、節(jié)稈菌（Arthrobacter）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉（Rhizopus）、青霉（Pencillium）：均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.2 儀器與設(shè)備

FW400A粉碎機(jī)：河北省黃驊市中興儀器有限公司；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇區(qū)西域新瑞儀器廠；UV-1200PC可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美析儀器有限公司；SW-CJ-JB標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)：上海陽(yáng)光試驗(yàn)儀器有限公司；SHB-IIIA循環(huán)式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 苦豆子黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物的制備

稱(chēng)取苦豆子粉末2.0 g，置于50 mL的帶蓋的離心管中，分別在一定料液比、浸出時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸取溫度下提取苦豆子中的黃酮類(lèi)物質(zhì)，每隔1 min搖勻一次，將得到的提取液進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后的上清液旋蒸濃縮，得到黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物。

1.3.2 黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

各取2.0 g苦豆子粉末，分別以乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、浸提時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、浸提溫度（70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））為考察對(duì)象，研究不同因素對(duì)苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，進(jìn)一步優(yōu)化黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取條件，分別以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、浸提時(shí)間（B）、浸提溫度（C）、料液比（D）為考察因素，黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率（Y）為響應(yīng)值。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 黃酮類(lèi)化合物含量的測(cè)定及得率的計(jì)算

參考文獻(xiàn)[17]中的方法，以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定的吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.059 87x-0.046 70，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。樣品中黃酮類(lèi)提取物的得率計(jì)算公式如下[15]：

式中：E為樣品中黃酮類(lèi)提取物得率，mg/g；x為樣液中黃酮類(lèi)物質(zhì)含量，mg；m為苦豆子粉末的質(zhì)量，g；p為樣品的稀釋倍數(shù)。

1.3.4 黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性

還原力的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[18]；DPPH自由基清除能力的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[19]；抗氧化劑清除DPPH自由基能力采用半抑制濃度（half inhibition concentration，IC50）值表示。同時(shí)以BHT作為抗氧化性陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.5 黃酮類(lèi)物質(zhì)的抑菌活性

采用濾紙片法[20]。各供試菌株活化后液體培養(yǎng)，離心，留離心管底少量液體，混勻，分別吸取150 μL各供試菌株懸液涂布在相應(yīng)的培養(yǎng)基（大腸桿菌、節(jié)桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌涂布在LB固體培養(yǎng)基，黑曲霉、根霉、青霉涂布在PDA固體培養(yǎng)基）上，將無(wú)菌濾紙片貼在上述含菌的固體培養(yǎng)基表面，取方法1.3.1中所得苦豆子黃酮類(lèi)提取液濃縮液100 μL滴加于濾紙片上，培養(yǎng)，觀察結(jié)果并拍照記錄。當(dāng)抑菌圈直徑＞7 mm時(shí)，則表明具有抑菌活性，抑菌圈直徑≤7 mm，判為無(wú)抑菌作用。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 9.0及Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮類(lèi)化合物得率的影響

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～90%范圍內(nèi)的增加，苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率先增大后減小。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時(shí)，黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物的得率隨之增加；在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物的得率最大，為10.59 mg/g；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%～90%時(shí)，苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物的得率反而降低?？赡苁怯捎诳喽棺又悬S酮類(lèi)物質(zhì)易溶于乙醇、甲醇等極性強(qiáng)的溶劑，所以在乙醇體積分?jǐn)?shù)增加至70%時(shí)，苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率逐漸增加；而繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，苦豆子中的一些醇溶性雜質(zhì)、親脂性的成分浸出量增加，與黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物競(jìng)爭(zhēng)乙醇分子，從而導(dǎo)致黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物提取率降低。因此，最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the yield of flavonoids extract from Sophora flavescens

2.1.2 浸提時(shí)間對(duì)黃酮類(lèi)化合物得率的影響

由圖2可知，隨著浸提時(shí)間在1～5 h范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物的得率先增大后減小。當(dāng)浸提時(shí)間在1～2 h時(shí)，黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率隨之增加；當(dāng)浸提時(shí)間在2 h時(shí)，黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率達(dá)到最大，為10.56 mg/g；當(dāng)浸提時(shí)間＞2 h之后，隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率快速下降。原因可能是有機(jī)溶劑完全浸透到苦豆子細(xì)胞中需要一定的時(shí)間，短時(shí)間內(nèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物不能充分溶出；而超過(guò)2 h后，糖和蛋白質(zhì)溶出增加，部分黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物遭到破壞。因此，最適浸提時(shí)間為2 h。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of flavonoids extract from Sophora flavescens

2.1.3 浸提溫度對(duì)黃酮類(lèi)化合物得率的影響

由圖3可知，隨著浸提溫度在70～90 ℃的增加，苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物的得率先增大后減小。當(dāng)浸提物質(zhì)溫度在70～80 ℃時(shí)，黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率隨之增加；當(dāng)浸提溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率達(dá)到最大，為10.48 mg/g；而當(dāng)浸提溫度＞80 ℃時(shí)，隨浸提溫度的增高苦豆子黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物的得率又快速降低。原因可能是隨著溫度的升高，分子擴(kuò)散能力增強(qiáng)，有利于黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出；當(dāng)溫度高于80 ℃時(shí)，黃酮類(lèi)某些熱不穩(wěn)定的化合物被氧化，或者部分黃酮類(lèi)化合物轉(zhuǎn)化成槲皮素和異槲皮素[21-22]，從而導(dǎo)致黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物的得率降低。因此，最適浸提溫度為80 ℃。

圖3 浸提溫度對(duì)苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids extract from Sophora flavescens

2.1.4 料液比對(duì)黃酮類(lèi)化合物得率的影響

由圖4可知，隨著料液比在1∶5～1∶25（g∶mL）范圍內(nèi)變化，苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率先增加后減?。辉诹弦罕葹?∶5～1∶10（g∶mL）時(shí)，黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率隨之增加；在料液比為1∶15（g∶mL）時(shí)，苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率最大，為10.60 mg/g；在料液比為1∶15～1∶25（g∶mL）時(shí)，黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率隨之下降。因此，最適料液比為1∶10（g∶mL）。

圖4 料液比對(duì)苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率的影響Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the yield of flavonoids extract from Sophora flavescens

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、浸提時(shí)間（B）、浸提溫度（C）、料液比（D）為考察因素，黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率（Y）為響應(yīng)值，優(yōu)化黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取條件[23]。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

采用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得二次多項(xiàng)回歸方程：Y=10.80+0.47A+0.033B+0.41C+0.60D+0.027AB+0.55AC-0.059AD-0.38BC-0.029BD-0.050CD-0.70A2-0.50B2-0.69C2-1.17D2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

由表3可以看出，模型顯著性P值＜0.01，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)P值＞0.05，不顯著，說(shuō)明所用模型與試驗(yàn)擬合的程度較好。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=3.68%＜10%，表明試驗(yàn)可行度較高。模型決定系數(shù)R2=0.928 5，校正決定系數(shù)R2adj=0.857 0＞0.80，說(shuō)明該模型能較好反映苦豆子中黃酮類(lèi)提取物得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸取溫度、浸出時(shí)間和料液比的關(guān)系。一次項(xiàng)A、C、D、二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2、交互項(xiàng)AC對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)BC對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，從顯著性及F值大小可得，提取苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率的影響因素大小依次為：料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞浸提溫度＞浸提時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

根據(jù)回歸方程利用Design-Expert V8.0.6繪制乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、浸提時(shí)間（B）、浸提溫度（C）、料液比（D）對(duì)黃酮類(lèi)提取物得率影響大小的交互作用響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)苦豆子黃酮類(lèi)提取物得率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the yield of flavonoids extract from Sophora flavescens

由圖5可知，AC交互作用對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率影響極顯著（P＜0.01），BC交互作用對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率影響顯著（P＜0.05），并且從三維立體圖中可以確定各交互因素間能得最優(yōu)黃酮類(lèi)提取物得率提取的范圍值。

2.2.3 最佳提取工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6.0軟件對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75.36%、浸提時(shí)間1.83 h、浸提溫度82.73 ℃、料液比1∶11.15（g∶mL），在此工藝條件下黃酮類(lèi)提取物得率預(yù)測(cè)值為11.105 mg/g。為了便于工藝操作，將最佳提取工藝條件修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、浸提時(shí)間1.8 h、浸提溫度83.0 ℃，料液比1∶11（g∶mL）。在此條件下，得到黃酮類(lèi)提取物得率實(shí)測(cè)值為（10.99±0.31）mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，表明該模型可以較好地反映苦豆子中黃酮類(lèi)提取物提取條件。有文獻(xiàn)報(bào)道，苦豆子黃酮類(lèi)提取物得率一般在4.98 mg/g左右[24-25]，本試驗(yàn)得率是其2倍左右，其原因可能是由于新疆地區(qū)獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境和苦豆子品種有一定的關(guān)系。

2.3 體外抗氧化性試驗(yàn)

2.3.1 還原力測(cè)定結(jié)果

由于BHT抗氧化效果好并且便宜而曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但是對(duì)人體具有致癌、致畸作用，現(xiàn)已被一些國(guó)家禁用。如圖6所示，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，苦豆子黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物的還原力隨著質(zhì)量濃度增加而增加，且與BHT的還原力大致相當(dāng)；在質(zhì)量濃度為0.092 mg/mL時(shí)，苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物對(duì)應(yīng)的吸光度值為0.611，而同濃度的BHT此時(shí)對(duì)應(yīng)的吸光度值是0.609，表明相同質(zhì)量濃度下苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物的還原力略大于BHT的還原力。

圖6 BHT和苦豆子黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物還原力的比較Fig.6 Comparison of reducing power of BHT and flavonoids extract from Sophora alopecuroides

2.3.2 清除DPPH自由基的測(cè)定結(jié)果

一般而言，物質(zhì)的還原力和抗氧化性具有很強(qiáng)的相關(guān)性，還原力大則具有較強(qiáng)的抗氧化性。如圖7所示，隨著苦豆子黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物質(zhì)量濃度增加，清除DPPH自由基的能力也逐漸增大，苦豆子中各黃酮類(lèi)化合物濃度在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)與清除DPPH 自由基能力呈非線性正相關(guān)關(guān)系。以IC50值作為評(píng)價(jià)各試樣清除DPPH自由基能力的指標(biāo)。采用該法測(cè)定的BHT和苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物的IC50值分別為0.032 2和0.029 7。IC50值越低，抗氧化劑的自由基清除能力越強(qiáng)[19]。由此得出苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物的DPPH自由基清除能力強(qiáng)于BHT。

圖7 BHT和苦豆子黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物對(duì)DPPH自由基清除率的比較Fig.7 Comparison of DPPH radicals scavenging rate of BHT and flavonoids extract from Sophora alopecuroides

2.4 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

如圖8所示，苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物濃縮液，滴加到涂有枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、節(jié)桿菌和大腸桿菌的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時(shí)間后有明顯的抑菌圈出現(xiàn)；而滴加到涂有黑曲霉、青霉和根霉的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后無(wú)抑菌圈。馮俊濤等[21]曾對(duì)西北地區(qū)的苦豆子等187種植物進(jìn)行了殺菌活性初步篩選，結(jié)果表明苦豆子丙酮提取物對(duì)番茄灰霉病等多種植物病原菌有較高的抑菌活性。本試驗(yàn)中，苦豆子中黃酮類(lèi)提取物濃縮液對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、節(jié)桿菌、大腸桿菌有明顯的抑菌活性，但是對(duì)黑曲霉、青霉、根霉無(wú)抑菌活性，這說(shuō)明不同來(lái)源的苦豆子中黃酮類(lèi)提取物成分可能不同。

圖8 苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物對(duì)供試菌株的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of flavonoids extract from Sophora alopecuroides on tested strains

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用乙醇浸提法提取苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立了苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物提取量的二次多項(xiàng)式回歸方程，得到提取苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、浸提時(shí)間1.8 h、浸提溫度83.0 ℃、料液比1∶11（g∶mL）。在此優(yōu)化條件下，苦豆子中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取物得率為（10.99±0.31）mg/g。體外抗氧化性和抑菌活性研究試驗(yàn)證明，苦豆子中的黃酮類(lèi)提取物的還原力和清除DPPH自由基的能力與BHT相近，對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、節(jié)桿菌、大腸桿菌等的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，在防腐、食品保鮮和醫(yī)藥方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。