楊 芳，李 歆

（淮安市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督綜合檢驗中心，江蘇 淮安 223001）

醬油是中國老百姓家庭中必備的調(diào)味品之一，含食鹽、氨基酸、糖類、有機酸、色素及香料成分，其風味形成是有微生物參與且非常復雜的過程。微生物的協(xié)同作用使之發(fā)生一系列的生化反應(yīng)，把原料中的不溶性高分子物質(zhì)分解成低分子化合物，這些物質(zhì)的相互結(jié)合形成了種類繁多的呈味物質(zhì)。這些呈味物質(zhì)主要是氨基酸[1-4]。醬油中這些游離氨基酸本身呈現(xiàn)一定的甜味或苦味，如脯氨酸和丙氨酸呈現(xiàn)甜味，異亮氨酸和亮氨酸呈現(xiàn)苦味等。醬油的風味并不單純由谷氨酸提供，它是各種游離氨基酸共同作用的結(jié)果[5]。因此對醬油中游離氨基酸進行測定是十分必要的。

目前醬油中游離氨基酸的主要檢測方法有紅外光譜法[6]、分光光度計法[7]、毛細管電泳法[8]、電位法[9]、離子色譜法[10-11]、氨基酸分析儀法[12-15]、高效液相色譜法[5，16-20]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[21]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[22-23]。其中高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測游離氨基酸無需衍生，前處理簡單，具有高選擇性和高精度，但儀器成本昂貴；高效液相色譜法得到最廣泛運用，但前處理復雜，部分衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性較差；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法衍生條件苛刻，不同氨基酸衍生反應(yīng)速度不同或衍生試劑不同；離子色譜法細菌干擾性強，基質(zhì)影響大；紅外光譜法、分光光度法及電位法重現(xiàn)性較差，氨基酸分析儀法所需樣品衍生化時間短、衍生條件對檢測結(jié)果精確度影響較小，而且具有樣品的耐受性較高、所需的樣品量較少的特點。由于衍生化試劑并沒有直接注入到色譜柱內(nèi)部，還能使色譜柱的使用壽命能夠得到有效的延長[24]。

現(xiàn)階段針對采用全自動氨基酸分析儀測定醬油中游離氨基酸不確定度的相關(guān)分析研究較少。為了真實反映檢測醬油中游離氨基酸結(jié)果的準確性，減少分析過程中的誤差，本研究參照CNAS—GL 006—2019《化學分析中不確定度的評估指南》[25]和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[26]等對全自動氨基酸分析儀測定醬油中游離氨基酸含量進行不確定度分析，以期發(fā)現(xiàn)可能影響測定結(jié)果的因素，為日常實驗檢測質(zhì)量控制提供科學可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無水乙醇（分析純）：萊陽市康德化工有限公司；鹽酸（優(yōu)級純）：西隴化工試劑有限公司；17種氨基酸標準溶液（GBW（E）10062，100 nmol/mL）：德國曼默博爾公司；緩沖液A、B、C、D、E、F，反應(yīng)液R，清洗液W（鋰鹽體系）：德國曼默博爾公司；醬油（淮安本地某品牌釀造醬油）：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

A300全自動氨基酸分析儀：德國曼默博爾公司；112900臺式超速冷凍離心機：美國賽默飛世爾公司；Milli-Q超純水儀：美國Millipore公司；MS105DM電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

用電子天平稱取醬油2.00g于50mL離心管中，加入30mL無水乙醇，渦旋振蕩2 min后定容至50 mL，置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min。取1 mL上清液用0.02 mol/mL鹽酸定容至10 mL，搖勻后過膜待測[27]。

1.3.2 儀器參數(shù)條件

陽離子交換樹脂鋰鹽色譜柱；色譜柱工作溫度40 ℃；流動相：緩沖液A、B、C、D、E、F，反應(yīng)液R，清洗液W（鋰鹽體系）；衍生系統(tǒng)流速為0.1mL/min，緩沖系統(tǒng)流速為0.2mL/min；進樣體積：20 μL；檢測波長：440 nm（脯氨酸）、570 nm（其余氨基酸）。儀器為雙流路，梯度洗脫條件見表1，梯度柱溫程序見表2。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

表2 梯度柱溫程序Table 2 Program of gradient column temperature

Eluent Press數(shù)值為50～80 MPa，Reagent Press數(shù)值為5～12 MPa。以保留時間定性，單點外標法定量。試樣中氨基酸的峰面積應(yīng)在標準溶液相應(yīng)峰面積的30%～200%。

1.3.3 建立數(shù)學模型

醬油中游離氨基酸測量不確定度數(shù)學模型見公式（1）：

式中：X為醬油中某種游離氨基酸的含量，g/100 g；c為測定液里某種游離氨基酸的濃度，nmol；M為該游離氨基酸的摩爾質(zhì)量，g/mol；m為醬油的質(zhì)量，mg；D為醬油的稀釋倍數(shù)。

1.3.4 測定醬油中游離氨基酸的不確定度來源分析

通過對檢測過程和數(shù)學模型的分析，影響測定醬油中游離氨基酸不確定度的來源有：醬油稱量的不確定度、氨基酸標準溶液的不確定度、定容醬油的不確定度、醬油稀釋的不確定度、全自動氨基酸分析儀的不確定度、氨基酸摩爾質(zhì)量的不確定度、醬油重復性測量的不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量的分析

2.1.1 醬油稱量的不確定度

醬油的稱量天平為MS105DM電子天平（精密度為0.000 01 g），根據(jù)淮安市計量測試中心出具的檢定證書（編號：918066090），當稱樣量為0～5 g時，該天平的最大允許誤差為±0.5e（e=0.1 mg/1 mg），取平均分布，醬油稱量2 g時，其不確定度計算如表3所示。

表3 醬油稱量的不確定度Table 3 Uncertainty of soy sauce weighing

2.1.2 氨基酸標準溶液的不確定度

購買的氨基酸標準溶液的U=±0.02，標準不確定度u（std）==0.011 55，標準溶液的濃度是100 nmol/mL，相對標準不確定度。

2.1.3 定容醬油的不確定度

由JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[28]可知，50 mL A級容量瓶的容量允差為±0.05 mL，根據(jù)三角分布，，其引入的標準不確定度為：=0.020 42 mL；實驗室溫度范圍為（20±5）℃，無水甲醇的體積膨脹系數(shù)為7.5×10-4/℃，取溫度變化均勻分布，，則標準不確定度為：=0.002 165 mL。因此，定容醬油引入的合成標準不確定度為：=0.020 53 mL，醬油定容的相對標準不確定度為=0.000 410 6。

2.1.4 醬油稀釋的不確定度

在測定過程中，為了減小稱量引入的誤差，因此對醬油進行了二次稀釋。二次稀釋倍數(shù)為10倍。稀釋時使用了1 mL A級單標線吸量管和10 mL A級容量瓶，由JJG 196—2006[28]可知，1 mL A級單標線吸量管容量允差為±0.007 mL，取均勻分布，k=，則其引入的標準不確定度為=0.004 042 mL；實驗室溫度范圍為（20±5）℃，0.02 mol/mL鹽酸溶液的體積膨脹系數(shù)為0.455×10-3/℃，取溫度變化均勻分布，k=，則標準不確定為：=0.001 314 mL。1 mL A級單標線吸量管合成標準不確定度為u（V吸1）=，相對標準不確定度為。

10 mLA級容量瓶最大容量允差為±0.020 mL，取三角分布，則其定容體積引入的標準不確定度為=0.008 165 mL；實驗室溫度波動范圍為（20±5）℃，溫度變化引入的標準不確定同①中的0.001 314 mL。合成標準不確定度=0.008 270 mL，相對標準不確定度為=0.000 827 0。

因此，醬油稀釋引入的相對標準不確定度為：urel（Vdil）=。

2.1.5 全自動氨基酸分析儀的不確定度

江蘇省計量科學研究院出具的校準證書（編號：C2020-3028896）中全自動氨基酸分析儀的相對標準不確定度為。

2.1.6 氨基酸摩爾質(zhì)量的不確定度

氨基酸分子的摩爾質(zhì)量的不確定度可以通過合成各組成元素原子量的不確定度得到。對于每一個元素，標準不確定度可按矩形分布處理，即不確定度除以。從原子量表（2009 IUPAC）[29]中查得元素的原子量和不確定度，計算元素的不確定度，結(jié)果見表4。

表4 元素的原子量及其不確定度Table 4 Atomic mass of the element and its uncertainty

由表4可知，碳、氫、氧、氮、硫5種元素的標準不確定度分別為0.000 58、0.000 081、0.000 21、0.000 24、0.004 9，根據(jù)此結(jié)果可得到氨基酸分子的摩爾質(zhì)量的不確定度，結(jié)果見表5。

表5 氨基酸摩爾質(zhì)量的不確定度Table 5 Uncertainty of amino acid molar mass

2.1.7 醬油重復性測量的不確定度

重復條件下對醬油進行6次平行試驗，測量結(jié)果見表6。

表6 醬油中游離氨基酸的實驗結(jié)果Table 6 Experimental results of free amino acids in soy sauce

本實驗中的醬油未檢測出胱氨酸，故在后續(xù)不對胱氨酸進行不確定度分析。

將重復性測定的平均值，標準偏差SRep結(jié)果分別代入公式，，重復性測量的不確定度urel（Rep）如表7所示。

表7 重復性測量的不確定度Table 7 Uncertainty of repeatability measurements

2.2 合成不確定度與擴展不確定度

由urel（計算得出合成不確定度，如表8所示。

表8 全自動氨基酸分析儀測定醬油中游離氨基酸不確定度的合成不確定度Table 8 Synthetic uncertainties of free amino acid uncertainty in soy sauce determined by automatic amino acid analyzer

由表8可知，儀器本身的相對標準不確定度（0.06）和醬油重復性測量的相對不確定度（0.029 49～0.139 5）對于合成不確定度的貢獻較大，醬油稀釋過程帶入的相對不確定度0.004 330，貢獻一般，稱量、氨基酸標準溶液、定容、摩爾質(zhì)量引入的相對不確定度在10-4～10-5，貢獻相對較小。

醬油中游離氨基酸的標準不確定度為urel（C）×，在95%置信概率下，取包含因子k=2，擴展不確定度為u×k，如表9所示。

表9 醬油中游離氨基酸的標準不確定度和擴展不確定度Table 9 Standard and extended uncertainties of free amino acids in soy sauce

由表9可知，在包含因子k=2時，醬油中游離氨基酸的擴展不確定度范圍為0.02 g/100 g～0.6 g/100 g。

3 結(jié)論

本研究對采用全自動氨基酸分析儀測定醬油中游離氨基酸的檢測結(jié)果進行了評價，評估了實驗過程中產(chǎn)生的不確定度組成，發(fā)現(xiàn)不確定度的主要來源為儀器本身的不確定度和醬油重復性測量的不確定度，其次是醬油稀釋過程帶入的不確定度，稱量、氨基酸標準溶液、定容、摩爾質(zhì)量引入的不確定度均較小。結(jié)果表明，在實驗過程中，應(yīng)保證儀器良好的工作狀態(tài)，保證其較高的靈敏度，定期對儀器進行維護和保養(yǎng)，從而達到良好的重復性，這樣結(jié)果的測量不確定度就可以減少，結(jié)果的準確性更高。