汪江波，蔣祥瑞，葉成玉，饒建軍，蔡鳳嬌，張瑞景，王鄭榮，何 超，徐 健*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點實驗室 工業(yè)微生物湖北省重點實驗室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068；2.壹源堂健康科技（武漢）有限公司，湖北 武漢 430068；3.湖北畢圣泉酒業(yè)有限公司，湖北 黃岡 438700）

石斛作為傳統(tǒng)的中藥材，種類繁多，分布廣泛，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降血糖以及養(yǎng)陰生津等功效。鐵皮石斛（Dendrobium officinale）被譽(yù)為石斛中的極品，2015年收錄于《中國藥典》，2018年被國家衛(wèi)健委列入藥食同源名單，有著“救命仙草”的美譽(yù)。研究結(jié)果表明，石斛多糖具有抗氧化[1]、降血糖[2]等有益作用；石斛多酚具有抗氧化[3]、抑制腸炎[4]功能；石斛總黃酮具有抗氧化、提高免疫力以及預(yù)防心腦血管疾病的作用[5]；石斛中的生物堿可清除氧化物質(zhì)以抑制氧化應(yīng)激[6]，同時石斛堿還具有抗腫瘤作用[7]。

傳統(tǒng)的中草材提取方法包括煎煮法、浸提法、回流提取法等。煎煮法可不同程度提取中藥材中大部分功效成分，但不適用于非水溶性、熱敏性以及易揮發(fā)成分的提取[8]；浸提法依靠溶質(zhì)分子的擴(kuò)散作用進(jìn)行提取，該提取過程耗時長且效率低；回流提取法提取效率高，但提取過程中需要較高溫度，部分功效成分會在高溫下被破壞[9]。超聲破碎提取技術(shù)具有以下優(yōu)勢：提取溫度低，特別適用于熱敏物質(zhì)的提取，有效防止功效成分在高溫下被破壞；適用性廣，對功效成分的性質(zhì)無特殊要求，大部分中草藥功效成分的提取均可采用超聲破碎提取技術(shù)；功效成分浸出率高，提取時間短[10]。因此，本研究采用超聲波細(xì)胞破碎技術(shù)對鐵皮石斛中的功效成分進(jìn)行提取。

氧化應(yīng)激與糖尿病、心血管疾病、高血壓和阿爾茨海默癥等疾病有關(guān)[11-14]。持續(xù)和漸進(jìn)的氧化損傷會對衰老和生理功能產(chǎn)生負(fù)面影響，并增加疾病的發(fā)病率[15]。目前，對石斛酒健康益處的認(rèn)識仍然是基于對石斛的傳統(tǒng)認(rèn)識，而不是試驗結(jié)果，石斛酒的抗氧化活性尚未得到很好的評價。

本試驗以鐵皮石斛中最重要的四種功效成分（石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮、石斛堿）含量的加權(quán)得分為評價指標(biāo)，對鐵皮石斛配制酒的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)自由基清除能力，對制備的鐵皮石斛配制酒（Dendrobium officinaleblended liquor，DBL）和鐵皮石斛配制酒提取物（Dendrobium officinaleblended liquor extract，DBLE）進(jìn)行體外抗氧化活性評價，旨在為石斛功能性食品的保健功效提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小曲清香型白酒（40%vol、45%vol、50%vol、55%vol、60%vol）：勁牌有限公司；鐵皮石斛莖：安徽霍仙堂石斛開發(fā)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）diammonium salt，ABTS）、鐵氰化鉀：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇、乙腈、三乙胺（均為色譜純）：美國Fisher有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.0%）：英國LGC公司；石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.0%）：上海源葉生物科技有限公司；無水葡萄糖、維生素C（vitamin C，VC）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸（純度99.0%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XM-1200T超聲波細(xì)胞破碎儀：小美超聲儀器有限公司；EV201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；LGJ18-A真空冷凍干燥機(jī)：上海舜制儀器制造有限公司；VWR UV-1600PC紫外/可見分光光度計：美國VWR公司；UltiMate 3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 石斛酒原液的制備

鐵皮石斛莖于50 ℃條件下干燥至含水量低于8%，粉碎過80目篩后置于密封袋中，4 ℃保存、備用。稱取一定量的鐵皮石斛粉于250 mL燒杯中，加入200 mL不同酒精度（40%vol、45%vol、50%vol、55%vol、60%vol）的小曲清香型白酒。使用超聲波細(xì)胞破碎儀處理，設(shè)置超聲功率（240 W、360 W、480 W、600 W、720 W、840 W），采用間歇式超聲，超聲5 s，間歇5 s。

將盛有鐵皮石斛粉和未超聲小曲清香型白酒的燒杯置于冰浴中，處理過程控制混合液溫度保持在40 ℃以下，使用食品級保鮮膜密封燒杯口，只留出一個可以放進(jìn)超聲探頭的孔隙，以減少酒中低沸點微量成分的揮發(fā)。設(shè)置提取時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h）。提取完畢后，待混合液恢復(fù)至室溫，在8 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液放于4 ℃冰箱冷沉3 d，冷沉后的上清液即為石斛酒原液。對石斛酒原液中四種功效成分（多糖、多酚、總黃酮和生物堿）進(jìn)行含量測定。以石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿的含量的加權(quán)得分為評價指標(biāo)[16]，加權(quán)得分計算公式如下：

式中：W為加權(quán)得分，分；c1、c2、c3和c4（本次實驗條件下，測得的石斛酒原液中功效成分的含量）分別為石斛酒原液中的石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿的含量，mg/mL、μg/mL、μg/mL和μg/mL；A1、A2、A3和A4（在整個試驗周期中，測得的石斛酒原液中功效成分的最大含量，視為在石斛酒原液中的最大溶解量）分別為前期預(yù)試驗中測得石斛酒原液中的最大石斛多糖含量（27.18 mg/mL）、最大石斛多酚含量（490 μg/mL）、最大石斛總黃酮含量（274 μg/mL）和最大石斛堿含量（13 μg/mL）。

1.3.2 功效成分含量檢測方法

（1）石斛多糖的測定

參照2015版藥典[17]中的苯酚-硫酸法，以葡萄糖含量（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線并對石斛酒原液中的石斛多糖含量進(jìn)行測定。得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：Y=0.007 9X-0.006 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9，在質(zhì)量濃度10～80 μg/mL范圍線性相關(guān)性良好。

（2）石斛多酚的測定

參照雷竹[18]的方法并稍作修改，采用福林酚比色法，以沒食子酸含量（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并對石斛酒原液中的石斛多酚含量進(jìn)行測定。得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：Y=0.008 9X+0.012 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，在質(zhì)量濃度10～90 μg/mL范圍線性相關(guān)性良好。

（3）石斛總黃酮的測定

參照繆園欣等[19]的分光光度法并稍作修改以蘆丁含量（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線并對石斛酒原液中的石斛總黃酮含量進(jìn)行測定。得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：Y=0.006 5X+0.004 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，在質(zhì)量濃度40～140 μg/mL范圍線性相關(guān)性良好。

（4）石斛堿的測定

石斛堿的測定采用高效液相色譜法，HPLC分析條件：Prosphere C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），流動相A：水（含0.000 5%三乙胺）和B：乙腈，50%A，50%B；流速：1.0 mL/min，檢測波長205 nm，樣品進(jìn)樣量為20 μL。以石斛堿含量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得到石斛堿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.101 1X-0.001 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，在質(zhì)量濃度0.5～20 μg/mL范圍線性相關(guān)性良好。

1.3.3 制備工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

分別以超聲時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h）、超聲功率（240 W、360 W、480 W、600 W、720 W、840 W）、石斛粉添加量（2g/100mL、5g/100mL、8g/100mL、10g/100mL、12 g/100 mL、15 g/100 mL）、酒精度（40%vol、45%vol、50%vol、55%vol、60%vol）為影響因素進(jìn)行單因素試驗，研究各個因素對石斛酒原液中四種功效成分含量的影響。

（2）響應(yīng)面試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，固定鐵皮石斛粉添加量為10 g/100 mL，以超聲時間（A）、超聲功率（B）和酒精度（C）為影響因素，四種功效成分的加權(quán)得分（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 10.0進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計。

1.3.4 DBL及DBLE的制備

為使制備的鐵皮石斛配制酒的澄清度和穩(wěn)定性更加接近于市售配制酒，對上述響應(yīng)面優(yōu)化條件下得到的石斛酒原液，使用0.45 μm濾膜進(jìn)行過濾處理，獲得鐵皮石斛配制酒（DBL）。DBL經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45 ℃濃縮，并采用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，最終獲得鐵皮石斛配制酒的功效成分提取物（DBLE）。

1.3.5 DBL感官品評及理化指標(biāo)

對獲得的DBL進(jìn)行感官品評并進(jìn)行打分。感官品評方法參照安徽省國韻酒業(yè)有限公司食品安全企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Q/GYJ0001S—2020《配制酒（石斛酒）》進(jìn)行打分[20]。品評人員為湖北工業(yè)大學(xué)釀酒中試基地的8名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的品評員，包括5男3女。在收集品評人員的打分結(jié)果后，去掉一個最高分和一個最低分以降低試驗誤差，并將剩下的評分取平均值作為樣品的最終得分。DBL中的酒精度、總酸和總糖參照國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行測定[21]，甲醇和雜醇油參照國標(biāo)GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》進(jìn)行測定[22]。

1.3.6 DBL及DBLE體外抗氧化活性測定

（1）DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力測定參照LUO A X等[23]的方法并稍作修改。將DBL倍半稀釋后的溶液或一定濃度范圍（50～2 000 μg/mL）的DBLE水溶液（0.6 mL）與0.1 mmol/L DPPH的甲醇溶液（1.8 mL）混合。溶液在室溫下保持30 min，然后測量波長517 nm處吸光度值，以維生素C為對照品。DPPH清除率計算公式如下：

式中：A0為DPPH無樣品吸光度值；As為在各種樣品存在下的DPPH吸光度值。

（2）ABTS自由基清除能力測定

ABTS自由基清除能力測定參照RE R等[24]的方法并稍作修改。ABTS用0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution，PBS）溶解至7mmol/L。ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液體積比為1∶1反應(yīng)生成ABTS自由基，使混合物在室溫下黑暗放置16 h。使用前，ABTS+溶液用0.01 mol/L，pH 7.4的PBS稀釋至734 nm處吸光度值為0.70±0.02。將DBL倍半稀釋后的溶液或一定濃度范圍（50～2 000 μg/mL）的DBLE水溶液（0.2 mL）與稀釋的ABTS+溶液（2.0 mL）混合。在室溫下保持20 min，然后測量734 nm的吸光度值，以維生素C為對照品。ABTS自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為ABTS無樣品吸光度值；As為在各種樣品存在下的ABTS吸光度值。

（3）鐵氰化鉀還原力測定

鐵氰化鉀還原力測定參照BARROS L等[25]的方法并稍作修改。將DBL倍半稀釋后的溶液或一定濃度范圍（50～2 000 μg/mL）的DBLE水溶液（0.2 mL），與0.2 mol/L、pH 6.6的PBS（1.0 mL）和30 mmol/L的鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）水溶液（1.0 mL）混合。將溶液在50 ℃水浴20 min，加入0.6 mol/L的三氯乙酸（CCl3COOH）（1.0 mL）。然后將每種溶液的1.0 mL轉(zhuǎn)移到新試管中，在新試管中加入1.0 mL去離子水和6 mmol/L的FeCl3（0.2 mL），充分混勻后在700 nm處測量吸光度值（A700nm），以維生素C為對照品。鐵還原抗氧化能力=As-A0，其中A0為無樣品時的吸光度值；As為樣品存在時的吸光度值。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用Origin 9.0制圖，Design-Expert 10.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果分析，其他數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲提取時間對石斛配制酒原液中四種功效成分含量及加權(quán)得分的影響

該單因素試驗設(shè)為6個水平，超聲提取時間分別為0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h和4.0 h。設(shè)定超聲提取功率為600 W、石斛粉添加量為2%、酒精度為50%vol。由圖1A可知，隨著超聲時間的延長，石斛多糖含量增加；當(dāng)超聲時間為2.0 h時，多糖已經(jīng)基本溶出，此時石斛多糖含量為6.42 mg/mL；超聲2.0 h后，溶解于酒液中的石斛多糖含量增速放緩，石斛總黃酮呈現(xiàn)類似的趨勢，而石斛堿的含量略有下降。石斛多酚含量的變化趨勢明顯不同，隨著超聲時間的延長，石斛多酚含量呈下降趨勢。這可能是因為超聲波對石斛多酚具有剪切作用，會破壞酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)[26]。由圖1B可知，四種功效成分的加權(quán)得分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最佳超聲提取時間為2.0 h。綜合石斛酒原液中四種功效成分含量及加權(quán)得分，選擇最佳超聲提取時間為2.0 h。

圖1 超聲提取時間對石斛配制酒原液中四種功效成分含量（A）和加權(quán)得分（B）的影響Fig.1 Effect of ultrasonic extraction time on 4 functional components contents (A) and weighted score (B) of Dendrobium officinale blended original liquor

2.1.2 超聲功率對石斛配制酒原液中四種功效成分含量及加權(quán)得分的影響

該單因素試驗設(shè)為6個水平，超聲功率分別為240 W、360 W、480 W、600 W、720 W和840 W。設(shè)定超聲提取時間為2.0 h、石斛粉添加量為2%、酒精度為50%vol。由圖2A可知，隨著超聲功率的增大，酒液中的石斛多糖含量不斷增加，這是因為超聲對石斛粉破壁效果明顯，有利于胞內(nèi)多糖的溶出[27]。石斛多酚總體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在360 W達(dá)到最高值，這可能是因為超聲波功率過高，過強(qiáng)的空化效應(yīng)會破壞多酚物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取量的持續(xù)降低[28]。石斛總黃酮含量變化相對穩(wěn)定，呈現(xiàn)先略微上升，后緩慢下降的趨勢；石斛堿含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在超聲功率為480 W時達(dá)到最大值。如圖2B所示，四種功效成分的加權(quán)得分先上升后下降，因此最佳超聲功率為480 W。綜合石斛酒原液中四種功效成分含量及加權(quán)得分，選擇最佳超聲功率為480 W。

圖2 超聲提取功率對石斛配制酒原液中四種功效成分含量（A)和加權(quán)得分（B）的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extraction power on four functional components contents (A) and weighted score (B) of Dendrobium officinale blended original liquor

2.1.3 石斛粉添加量對石斛配制酒原液中四種功效成分含量及加權(quán)得分的影響

該單因素試驗設(shè)為6個水平，石斛粉添加量分別為2g/100mL、5g/100mL、8g/100mL、10g/100mL、12g/100mL和15 g/100 mL。設(shè)定超聲提取時間為2.0 h、超聲提取功率480 W、酒精度為50%vol。由圖3A可知，隨著石斛粉添加量的增大，酒液粘稠度增大，酒液對超聲波能量吸收增多導(dǎo)致鐵皮石斛粉末對超聲波能量吸收減小，從而造成細(xì)胞壁破碎不完全，多糖未能完全溶出[29]。因此，酒液中鐵皮石斛多糖含量先迅速增加后增加緩慢。石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿因為同樣的原因，呈現(xiàn)了類似的增長趨勢。由圖3B可知，隨著石斛粉添加量的增加，加權(quán)得分先明顯提高，后呈現(xiàn)較緩增長的趨勢，考慮到鐵皮石斛成本昂貴，且酒液粘稠度逐漸變大會加速超聲過程中溫度的上升，對后期石斛酒的生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響，故選取石斛粉添加量為10 g/100 mL，這也與中醫(yī)推薦的常用藥酒配方比例相吻合[30]。綜合石斛酒原液中四種功效成分含量及加權(quán)得分，選擇最佳石斛粉添加量為10 g/100 mL。

圖3 鐵皮石斛粉添加量對石斛配制酒原液中四種功效成分含量（A）和加權(quán)得分（B）的影響Fig.3 Effect of Dendrobium officinale powder addition on four functional components contents (A) and weighted score(B) of D.officinale blended original liquor

2.1.4 酒精度對石斛配制酒原液中四種功效成分含量及加權(quán)得分的影響

該單因素試驗設(shè)為5個水平，酒精度分別為40%vol、45%vol、50%vol、55%vol和60%vol。設(shè)定超聲提取時間為2.0 h、超聲提取功率480 W、石斛粉添加量為10 g/100 mL。由圖4A可知，酒液中石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿含量均呈現(xiàn)明顯的先上升后下降趨勢。根據(jù)相似相溶原理，隨著酒精度的提高，酒液的極性逐漸減小，酒精度為50%vol時，四種功效物質(zhì)的極性與酒液的極性相似，所以溶解性較好，含量均達(dá)到最大值。當(dāng)酒精度過高時，會導(dǎo)致極性顯著降低，從而抑制功效物質(zhì)從石斛中溶出，且酒精度越高，成本越高。由圖4B可知，在酒精度40%vol～60%vol范圍內(nèi)，加權(quán)得分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最適的酒精度為50%vol。綜合石斛酒原液中四種功效成分含量及加權(quán)得分，選擇最佳酒精度為50%vol。

圖4 酒精度對石斛配制酒原液中四種功效成分含量（A）和加權(quán)得分（B）的影響Fig.4 Effect of alcohol content on four functional components contents (A) and weighted score (B) of Dendrobium officinale blended original liquor

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，固定鐵皮石斛粉添加量為10 g/100 mL，以酒精度（A）、超聲時間（B）和超聲功率（C）為影響因素，四種功效成分的加權(quán)得分（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 10.0進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，對其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。共包括17組試驗方案，Box-Behnken試驗方案及結(jié)果見表1。

由表1可知，不同組別試驗所得石斛酒原液中四種功效成分的加權(quán)得分與預(yù)測值基本一致，證明了本次試驗設(shè)計的合理性。利用Design-Expert 10.0軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，對所建立的超聲制備工藝參數(shù)回歸模型進(jìn)行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗，結(jié)果見表2。由表2可知，響應(yīng)面模型F值為81.16，P值＜0.000 1，說明模型極顯著；失擬項P=0.988 0＞0.05，不顯著，表明該回歸模型合理且模型擬合度高，可以很好的反映出試驗真實值，因此該回歸方程可用于對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。由P值可以看出，一次項A、C，二次項A2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.001）；交互項AB、二次項B2對結(jié)果影響高度顯著（P＜0.01）；一次項B對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。三個因素對鐵皮石斛多糖、多酚、總黃酮和石斛堿的加權(quán)得分影響程度由高到低依次為酒精度＞超聲功率＞超聲時間。

表1 制備工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果Table 1 Results of Box-Behnken experiments design for preparation technology optimization

表2 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis results of regression model

利用Design-Expert 10.0軟件進(jìn)行分析可知，加權(quán)得分的二元擬合回歸方程為：Y=87.51+1.39A+0.54B+0.98C-1.02AB-0.55AC-0.11BC-4.83A2-1.22B2-2.13C2

各因素相互作用對石斛酒原液中四種功效成分加權(quán)得分的響應(yīng)面與等高線見圖5。由圖5a可知，超聲時間和酒精度的兩因素交互作用對加權(quán)得分影響極顯著（P＜0.01）；由圖5b、圖5c可知，超聲功率和酒精度、超聲功率和超聲時間交互作用不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素相互作用對石斛酒原液中四種功效成分加權(quán)得分影響的響應(yīng)面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the weighted scores of four functional components in Dendrobium officinale blended original liquor

根據(jù)回歸擬合方程可確定DBL的最佳制備工藝條件為：酒精度50.57%vol、超聲時間2.08 h、超聲功率505.36 W，加權(quán)得分預(yù)測值為87.7分?？紤]到實際情況，修正制備工藝條件為：酒精度51%vol、超聲時間2 h、超聲功率504 W。按照此工藝條件進(jìn)行三次平行驗證試驗，所得石斛酒原液中，石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿的含量分別為22.15 mg/mL、432.4 μg/mL、218.8 μg/mL和12.8 μg/mL，經(jīng)過計算其加權(quán)得分實際值為87.8分。此外，在該工藝條件下制備的DBL中石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿的含量分別為20.71 mg/mL、391.8 μg/mL、205.9 μg/mL和11.5 μg/mL，經(jīng)過計算其加權(quán)得分為80.6分，石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿過膜損耗分別為6.5%、9.4%、5.9%和10.1%。DBL感官得分為81.4分，測得酒精度、總酸、總糖、甲醇和雜醇油含量分別為46.2%vol、1.1 g/L、21.6 g/L、0.009 7 g/100mL和0.088 g/100 mL。

2.3 DBL及DBLE體外抗氧化活性測定

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定

由圖6可知，DBLE與DBL均具有對DPPH自由基的清除能力，且清除效果和溶液濃度呈正相關(guān)，但均低于VC。DBLE在質(zhì)量濃度50～2 000 μg/mL時，對DPPH自由基清除能力隨之逐漸增強(qiáng)，且DBLE在質(zhì)量濃度2 000 μg/mL時，對DPPH的清除率達(dá)到66.47%。DBL質(zhì)量濃度為2 477 μg/mL時，對DPPH自由基清除率達(dá)到70.55%，高于2 000 μg/mL時DBLE的DPPH自由基清除率；之后，隨著DBL稀釋倍數(shù)減小，對DPPH的清除率逐漸提高，這主要是因為DBL中抗氧化功效成分的濃度更高引起的。DBLE對DPPH自由基的IC50值為1 239 μg/mL，DBL對DPPH自由基的IC50值為944 μg/mL，DBLE的IC50值偏大可能是由于其在水溶液中的溶解性較差所導(dǎo)致的，但兩者的IC50值均小于10 mg/mL，說明DBLE具有較好的抗氧化效果。DBL在未稀釋的情況下，對DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，達(dá)到84.15%。

圖6 DBLE（A）和DBL（B）對DPPH自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of DBLE (A) and DBL (B) to DPPH radicals

2.3.2 ABTS自由基清除能力測定

由圖7可知，DBLE、DBL均具有對ABTS自由基的清除能力，且清除效果和溶液濃度呈正相關(guān)。DBL對ABTS自由基的清除能力更加顯著，這可能是因為DBL中抗氧化功效成分的濃度更高引起的。DBLE質(zhì)量濃度在50～2 000 μg/mL之間時，ABTS自由基清除能力隨之逐漸增強(qiáng)，且DBLE質(zhì)量濃度在2 000 μg/mL時，對ABTS的清除率達(dá)到92.80%。DBLE對ABTS自由基的IC50值為642 μg/mL，而DBL對ABTS自由基的IC50為240 μg/mL，DBLE的IC50偏大可能是由于其在水溶液中的溶解性較差所導(dǎo)致的，但兩者的IC50值均小于10 mg/mL，說明DBLE具有較好的抗氧化效果。DBL在未稀釋的情況下，對ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，達(dá)到94.05%。

圖7 DBLE（A）、DBL（B）對ABTS自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of DBLE (A) and DBL (B) to ABTS radicals

2.3.3 鐵氰化鉀還原能力測定

由圖8可知，DBLE、DBL均具有對鐵氰化鉀的還原能力（A700nm值），且還原能力和濃度呈正相關(guān)，兩者對鐵氰化鉀的還原能力（A700nm值）均低于VC，但是DBL對鐵氰化鉀的還原力更加顯著。DBLE質(zhì)量濃度在50～2 000 μg/mL時，對鐵氰化鉀的還原力隨之逐漸提高，且與濃度呈良好的線性關(guān)系。當(dāng)DBL稀釋倍數(shù)為16倍，即酒體中提取物質(zhì)量濃度為1 238 μg/mL時，對鐵氰化鉀的還原能力（A700nm值）為0.178，高于高劑量2 000 μg/mL時DBLE的鐵氰化鉀還原能力；之后隨著DBL稀釋倍數(shù)減小，對鐵氰化鉀的還原力逐漸提高，這主要是因為DBL中抗氧化功效成分的濃度更高引起的。DBL在未稀釋的情況下，對鐵氰化鉀的還原力（A700nm值）最強(qiáng)，為1.367。

圖8 DBLE（A）、DBL（B）對鐵氰化鉀的還原能力Fig.8 Reducing ability of DBLE (A) and DBL (B) to potassium ferricyanide

3 結(jié)論

以鐵皮石斛為原料、小曲清香型白酒為酒基，四種功效成分（石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿）含量的加權(quán)得分為指標(biāo)，確定了超聲波破碎法制備DBL的最佳制備工藝參數(shù)為：超聲時間2.0 h，超聲功率504 W，石斛粉添加量為10 g/100 mL，酒精度為51%vol。體外抗氧化試驗結(jié)果表明DBL與DBLE均具有一定的抗氧化活性，且DBL體外抗氧化效果更加顯著，初步證明石斛酒是一種具有抗氧化功能的草本酒精飲品。該研究結(jié)果拓寬了人們對石斛酒健康益處的認(rèn)識，為石斛酒新產(chǎn)品開發(fā)及后期組合勾兌提供了理論指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支持，有利于推進(jìn)石斛及石斛酒產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。