陳秋玲，祝芷琦，李詠華，王小妹，梁北梅，溫愷嘉，許一靖，曾還雄，林元亨，唐順之

(廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司 中藥提取分離過程現(xiàn)代化國(guó)家工程研究中心，廣東省藥用脂質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510240)

蛋黃卵磷脂是從雞蛋黃中提取、精制得到的一種復(fù)合磷脂,包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)以及磷脂酰絲氨酸(PS)等[1-3]，具有抗氧化、抗菌、抗炎活性，及延緩衰老、改善脂肪代謝、保護(hù)視網(wǎng)膜、預(yù)防心腦血管疾病、提高免疫力以及益智健腦等功能。在醫(yī)藥行業(yè)，蛋黃卵磷脂是一種輔料，可作為脂肪乳注射液中的乳化劑，也可以用于制作脂質(zhì)體將藥物直接運(yùn)送到患病部位，使藥物具有靶向性[4-7]。

ICH Q3D元素雜質(zhì)指南根據(jù)金屬元素的毒性與來(lái)源將其分為3 類(1類，2A、2B類，3類)，并根據(jù)不同的給藥途徑(口服、注射、吸入)分別給出了不同的限度(允許日暴露量，PDE)。2020版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0412《電感耦合等離子體質(zhì)譜法》、GB 5009.268—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測(cè)定》以及美國(guó)藥典(USP)通則<232> <233>對(duì)元素雜質(zhì)的限度、測(cè)定流程及方法學(xué)驗(yàn)證做了建議與要求。蛋黃卵磷脂作為注射劑的乳化劑應(yīng)用較為廣泛，從臨床應(yīng)用的角度來(lái)看，與普通制劑相比，其金屬元素檢測(cè)方法的探索顯得尤為重要。2020版《中華人民共和國(guó)藥典》四部，蛋黃卵磷脂中重金屬檢查項(xiàng)為根據(jù)通則0821第二法。該方法的主要原理為10種元素(Ag、As、Bi、Cd、Cu、Hg、Mo、Pb、Sb 和 Sn)與硫代乙酰胺反應(yīng)，產(chǎn)生的有色反應(yīng)產(chǎn)物與10 ng/mL的Pb標(biāo)準(zhǔn)溶液同法反應(yīng)物進(jìn)行顏色比對(duì)，以確定藥物中重金屬是否超出限度要求。該方法存在檢測(cè)的元素有限且無(wú)法反映單個(gè)元素的濃度，目視比色存在主觀誤差等局限性[8]。

金屬元素的測(cè)定方法主要有電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-AES)法以及原子吸收光譜(AAS)法。其中AAS法存在耗時(shí)長(zhǎng)、檢出限較高、基體效應(yīng)大、線性范圍窄且難以實(shí)現(xiàn)多元素同時(shí)分析的問題。ICP-AES法雖可以同時(shí)測(cè)定多種元素, 但譜線干擾多、靈敏度較低。ICP-MS具有分析速度快、檢出限低、基體效應(yīng)小、精密度高、靈敏度高、線性范圍寬及多元素同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn)[9-12]，是今后的發(fā)展方向。當(dāng)前常用的樣品消解方法有微波消解法、濕式消解法、高溫密閉消解法、干式灰化法和高溫熔融法，其中微波消解法利用微波快速加熱, 在高壓環(huán)境下進(jìn)行消解, 具有消解速度快、污染小、樣品消解完全、回收率高、用酸少、安全、污染程度低等優(yōu)點(diǎn)[11，13]。

目前，關(guān)于蛋黃卵磷脂中金屬元素測(cè)定的相關(guān)文獻(xiàn)較少。因蛋黃卵磷脂比較難消解，依據(jù)GB 5009.268—2016中微波消解法，在消解過程中會(huì)出現(xiàn)壓力過大導(dǎo)致無(wú)法正常消解的問題。因此，本文在微波消解前增加100℃預(yù)消解1 h的步驟，能夠避免消解過程的異常情況，建立了ICP-MS法測(cè)定蛋黃卵磷脂中15種金屬元素的方法，為蛋黃卵磷脂的金屬元素檢測(cè)提供技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

蛋黃卵磷脂樣品，由廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司天然有機(jī)室提供，批號(hào)為I30181201。

硝酸(MOS級(jí))，安譜公司；調(diào)諧溶液(Ce、Co、Li、Mg、Tl、 Y，1 μg/L)，安捷倫公司；多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(Li、Be、B、Na、Mg、Al、K、Ca、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Zr、Nb、Mo、Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、Hf、Tl、Pb，100 μg/mL)、多元素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液(Sc、Ge、In、Rh、Re、Bi，10 μg/mL)、鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、銻標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、釩標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、金標(biāo)準(zhǔn)溶液(2 μg/mL)、鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、錫標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)，鋼研納克檢測(cè)技術(shù)有限公司；砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、銅標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)、汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)，國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院；Milli-Q超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7800電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，安捷倫公司；WX-8000微波消解儀，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；AP225WD分析天平，島津公司；Milli-Q純水/超純水一體機(jī)，默克密理博公司；BHW-09Y12趕酸儀，上海博通化學(xué)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備

鋰標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10 μg/mL)：量取鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL用2%硝酸定容至50 mL。鋁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(5 μg/mL)：量取鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL用2%硝酸定容至50 mL。釩標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2 μg/mL)：量取釩標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL用2%硝酸定容至50 mL。鉻標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 μg/mL)：量取鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL用2%硝酸定容至50 mL。鈷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 μg/mL)：量取鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL用2%硝酸定容至50 mL。鎳標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(4 μg/mL)：量取鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL用2%硝酸定容至50 mL。銅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(50 μg/mL)：量取銅標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL用2%硝酸定容至50 mL。銅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.25 μg/mL)：量取銅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(50 μg/mL)0.25 mL用2%硝酸定容至50 mL。鋅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2 μg/mL)：量取鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL用2%硝酸定容至50 mL。砷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(4 μg/mL)：精密量取砷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL于50 mL容量瓶中，用2%硝酸定容。鎘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10 μg/mL)：量取鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL用2%硝酸定容至50 mL。鎘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.5 μg/mL)：量取鎘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10 μg/mL)2.5 mL用2%硝酸定容至50 mL。錫標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 μg/mL)：量取錫標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL用2%硝酸定容至50 mL。銻標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10 μg/mL)：量取銻標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL用2%硝酸定容至50 mL。汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 μg/mL)：量取汞標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL和金標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，用2%硝酸定容100 mL。鉛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2 μg/mL)：量取鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL用2%硝酸定容至100 mL。

多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 μg/mL)：量取多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，用2%硝酸定容至100 mL。多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2 μg/mL)：量取多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，用2%硝酸定容至50 mL。

用2%硝酸稀釋多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稀釋得到的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各元素質(zhì)量濃度見表1。

表1 系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各元素質(zhì)量濃度

混合內(nèi)標(biāo)溶液(1 μg/mL)：量取多元素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL，用2%硝酸定容至50 mL。

1.2.2 樣品預(yù)處理

精密稱取0.5 g蛋黃卵磷脂置于聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加入8 mL硝酸混勻，加蓋放置過夜(15 h)，于100℃預(yù)消解1 h，旋緊罐蓋將消解罐置于微波消解儀內(nèi)，按微波消解程序進(jìn)行消解(見表2)。冷卻后取出消解罐，緩慢打開罐蓋排氣，用少量水沖洗內(nèi)蓋。將消解罐置于趕酸儀，于100℃加熱趕酸1 h，然后將消解液轉(zhuǎn)入50 mL量瓶中,用少量水洗滌消解罐5次，洗液合并于量瓶中，用純水稀釋至刻度，待ICP-MS測(cè)定。

表2 微波消解時(shí)間-溫度程序

1.2.3 ICP-MS條件

射頻功率1.55 kW，載氣(高純氬氣)流速1.03 L/min，等離子氣體流速15.0 L/min，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速0.1 r/s，霧化室溫度 2℃，輔助氣流量0.9 L/min，氦氣流量4.3 mL/min；數(shù)據(jù)采樣模式為質(zhì)譜圖，采樣錐/截取錐為鎳錐，檢測(cè)器模式為P/A，采樣深度 10 mm，重復(fù)次數(shù)3 次，掃描次數(shù) 100 次。選取同位素為7Li、27Al、51V、52Cr、56Fe、59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As、111Cd、118Sn、121Sb、201Hg 和208Pb，其中7Li、27Al、51V、52Cr、56Fe以45Sc 作為內(nèi)標(biāo)，59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As以72Ge 作為內(nèi)標(biāo)，111Cd、118Sn、121Sb 以115In 作為內(nèi)標(biāo)，201Hg 和208Pb 以185Re 作為內(nèi)標(biāo)。

1.2.4 方法學(xué)考察要求

方法學(xué)驗(yàn)證要求參考USP通則<233>，線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于等于0.99， 3個(gè)加標(biāo)水平回收率應(yīng)為70%～150%(n=3)，重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不得超過20%(n=6)，中間精密度RSD不得超過 25%(n=12)，穩(wěn)定性RSD 不得超過20%。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜干擾優(yōu)化

質(zhì)譜型干擾主要有兩個(gè)方面的來(lái)源，元素的干擾和分子離子的干擾。其中，元素的干擾包含同量異位素重疊干擾和雙電荷離子，分子離子的干擾主要來(lái)自等離子氣體和樣品基體。

同量異位素重疊干擾是指多個(gè)元素的同位素在同一個(gè)質(zhì)量數(shù)重疊，主要靠同位素選擇來(lái)避免。本次測(cè)定的15種金屬元素中，除了Al、Co、As只有一個(gè)質(zhì)量數(shù)外，其他元素都有多種同位素，針對(duì)不同質(zhì)量數(shù)的同位素在自然界中的含量可能引起的多原子干擾情況，選擇相關(guān)系數(shù)好且響應(yīng)值高的質(zhì)量數(shù)為分析用的同位素。本次實(shí)驗(yàn)選取的同位素為7Li、27Al、51V、52Cr、56Fe、59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As、111Cd、118Sn、121Sb、201Hg和208Pb 。

多原子離子的干擾可分為等離子氣體形成的多原子分子干擾、難熔氧化物干擾和雙電荷干擾[13]。本實(shí)驗(yàn)采用四級(jí)桿碰撞/反應(yīng)池(氦氣模式，流速4.3 mL/min)克服多原子離子對(duì)分析元素引起的重疊干擾。氧化物和雙電荷對(duì)檢測(cè)元素的干擾是比較常見的問題，由于所有穩(wěn)定/亞穩(wěn)定分子解離為原子和離子的過程為吸熱反應(yīng)，而CeO 是所有氧化物中最難解離的，在 ICP-MS 分析中在進(jìn)樣之前進(jìn)行儀器調(diào)諧，CeO+/Ce+為氧化物指標(biāo)，確認(rèn) CeO+/Ce+小于等于3%、雙電荷小于等于2%，氧化物和雙電荷干擾對(duì)元素的測(cè)定干擾可忽略不計(jì)。

2.1.2 非質(zhì)譜干擾優(yōu)化

非質(zhì)譜干擾較為復(fù)雜，又稱為基體效應(yīng)，主要來(lái)源于樣品基體或酸溶劑中的元素和等離子體用的氬氣中的雜質(zhì)。一般情況下，干擾的程度與樣品基體的性質(zhì)及復(fù)雜程度有關(guān)，通過加入內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量校正[13]。按照內(nèi)標(biāo)同位素質(zhì)量數(shù)與待測(cè)元素質(zhì)量數(shù)相近、電離勢(shì)能匹配性、待測(cè)樣品中不應(yīng)含有內(nèi)標(biāo)元素和化學(xué)溶液性質(zhì)相似選擇內(nèi)標(biāo)元素[14-15]。實(shí)驗(yàn)用2%硝酸配制1 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液，其中7Li、27Al、51V、52Cr、56Fe以45Sc 作為內(nèi)標(biāo)，59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As 以72Ge 作為內(nèi)標(biāo)，111Cd、118Sn、121Sb 以115In 作為內(nèi)標(biāo)，201Hg和208Pb以185Re作為內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)元素回收率在80%～120%之間，能有效地校正分析信號(hào)的漂移。

2.1.3 降低汞元素記憶效應(yīng)

汞蒸汽壓較低，在常溫下即可蒸發(fā)，故在敞口測(cè)定汞溶液時(shí)，其揮發(fā)性會(huì)造成測(cè)定結(jié)果有一定的誤差，由于汞具有極強(qiáng)的吸附性，在檢測(cè)過程中容易吸附在樣品瓶、泵管及矩管上而產(chǎn)生記憶效應(yīng)。汞可以溶解多種金屬，與之形成汞齊，其溶解度越大，形成的汞齊越穩(wěn)定，越不易吸附在容器或管線表面，但溶解度過大，形成的汞齊在等離子體中難以分解離子化。金在汞中具有一定的溶解度，能夠形成金汞齊[16]。本實(shí)驗(yàn)汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過程中加入適量的金元素，且標(biāo)準(zhǔn)溶液最高點(diǎn)為5 ng/mL，能夠很好地降低記憶效應(yīng)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系

取1.2.1系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定過程中儀器的內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣管在儀器分析工作過程中始終插入混合內(nèi)標(biāo)溶液中，依次將樣品管插入各個(gè)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中進(jìn)行測(cè)定。以各元素與內(nèi)標(biāo)測(cè)量值的比值 (y)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。15種元素的線性關(guān)系見表3。由表3可知，各元素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R)均大于0.999。

續(xù)表3

2.2.2 方法的檢出限和定量限

取樣品空白溶液按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣連續(xù)測(cè)定11次，計(jì)算11次測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，以3.3倍SD除以斜率作為檢出限，10 倍SD除以斜率作為定量限，方法的檢出限和定量限見表4。由表4可知，方法檢出限在0.03～0.65 ng/mL之間，方法定量限在0.10～1.97 ng/mL之間，檢出限、定量限低。

表4 15種元素的檢出限和定量限 ng/mL

2.2.3 儀器精密度

取多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(2 ng/mL)以及汞元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2 ng/mL)，按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算RSD。結(jié)果表明，各元素精密度測(cè)試的RSD在0.45%～4.67%之間(見表5)，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性

取蛋黃卵磷脂樣品6份按1.2.2制備供試品溶液，按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算6次測(cè)定結(jié)果的RSD。結(jié)果表明：鋰、銅、鋅元素含量在定量限之上，RSD分別為2.57%、5.06%、5.85%，均小于20%，結(jié)果符合要求；鋁、釩、鉻、鈷、鎳、砷、鎘、錫、銻、汞、鉛元素含量低于定量限；6份鐵元素樣品中2份含量在定量限之上，4份含量在定量限之下，重復(fù)性不佳(RSD為82%)。樣品中部分元素含量低于定量限，故由加標(biāo)重復(fù)性RSD表示方法重復(fù)性結(jié)果。

取蛋黃卵磷脂樣品6份，鋁、釩、鉻、鐵、鈷、鎳、砷、鎘、錫、銻、汞、鉛元素按照限度值的100%加入標(biāo)準(zhǔn)元素，按1.2.1制備供試品溶液，按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算RSD。結(jié)果表明，重復(fù)性RSD在1.78%～8.72%之間(見表5)，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

2.2.5 中間精密度

不同時(shí)間不同實(shí)驗(yàn)人員按2.2.4樣品加標(biāo)重復(fù)性方法重新配制6份供試溶液，測(cè)定并計(jì)算12份測(cè)定結(jié)果(包括重復(fù)性)的 RSD，作為中間精密度結(jié)果。結(jié)果表明，中間精密度RSD在2.24%～9.45%之間(見表5)，說(shuō)明本方法中間精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性

取2.2.5中間精密度的樣品溶液，在2～ 8℃條件下保存，分別于0、24、48、72 h按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算RSD。結(jié)果表明，RSD在0.56%～3.93%之間(見表5)，說(shuō)明樣品溶液在2～8℃的條件下保存72 h穩(wěn)定性較好。

表5 儀器精密度、重復(fù)性、中間精密度、穩(wěn)定性結(jié)果%

2.2.7 回收率

取蛋黃卵磷脂樣品9份，鋰、銅、鋅元素按照樣品含量的100%、200%、300%加入標(biāo)準(zhǔn)溶液作為低、中、高水平供試品溶液。鋁、釩、鉻、鐵、鈷、鎳、砷、鎘、錫、銻、汞、鉛元素按照限度值的80%、100%、120%加入標(biāo)準(zhǔn)溶液作為低、中、高水平供試品溶液。按1.2.2制備供試品溶液，按1.2.3 ICP-MS條件進(jìn)樣測(cè)定元素含量，每個(gè)質(zhì)量濃度制備3份平行樣進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算RSD，結(jié)果見表6。由表6可知，15種元素加標(biāo)回收率在92.67%～132.90%之間, RSD在1.42%～7.00%之間，表明本方法回收率良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

表6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

本文用微波消解對(duì)蛋黃卵磷脂樣品進(jìn)行前處理，用ICP-MS測(cè)定其中的15種金屬元素含量。結(jié)果表明，該方法各元素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R)均大于0.999。各元素方法檢出限在0.03～0.65 ng/mL之間，定量限在0.10～1.97 ng/mL之間。該方法的儀器精密度良好，RSD(n=6)在0.45%～4.67%之間，重復(fù)性RSD(n=6)在1.78%～8.72%之間，中間精密度RSD(n=12)在2.24%～9.45%之間。15種金屬元素低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)回收率在92.67% ～132.90%之間, RSD在1.42%～7.00%之間。樣品溶液在2～8℃條件下保存72 h穩(wěn)定性良好，RSD在0.56%～3.93%之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合方法學(xué)考察要求，該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高, 可用于蛋黃卵磷脂中15種金屬元素的同時(shí)測(cè)定。