費洪立，阮長青，李志江，鹿保鑫，張東杰

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319； 2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室，黑龍江 大慶 163319； 3.北大荒現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)省級培育協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 大慶163319)

大豆是重要的油料作物，為人體的生長需要提供了豐富的營養(yǎng)來源[1]。黑龍江省是我國重要的商品糧生產(chǎn)基地，也是最大的大豆產(chǎn)區(qū)[2]，黑龍江大豆籽粒大、皮薄、體型圓潤、果實飽滿、營養(yǎng)豐富[3]。然而，隨著大豆產(chǎn)量的提高和市場激烈的競爭，越來越多的不法商販使用質(zhì)量差、價格低、非品牌大豆冒充黑龍江營養(yǎng)價值高的品牌大豆，制約了黑龍江省大豆產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展，使黑龍江大豆面臨威脅，嚴重影響了當(dāng)?shù)剞r(nóng)民種植大豆的積極性和大豆的生產(chǎn)效益，將優(yōu)質(zhì)大豆產(chǎn)業(yè)做大做強已經(jīng)成為黑龍江省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重中之重[4]。

大豆中含有豐富的次生代謝物大豆異黃酮[5]，它是維持器官功能的重要調(diào)節(jié)因子，對細胞增殖、細胞生長和細胞成熟有重要作用[6]，在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化的作用[7]。環(huán)境因素對大豆異黃酮的含量影響很大[8]，東北大豆中大豆異黃酮含量高于南方大豆的[9]。大豆異黃酮在特定環(huán)境的大豆中具有唯一性和特征性，大豆種類、產(chǎn)地、環(huán)境不同，大豆異黃酮的含量和單體比例也會不同，可以作為鑒別產(chǎn)地和品種的溯源指標[10]。

近年來，關(guān)于農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)地溯源技術(shù)研究報道很多，通常是篩選出一種特征成分作為鑒定指標，但這種方法忽略了個體差異性，且單一指標并不能很好地反映產(chǎn)品地理信息[11]。因此，篩選有效、穩(wěn)定的溯源特征指標，對開展大豆溯源技術(shù)研究，從而保護大豆品牌、保證國家大豆安全具有重要意義。本文對黑龍江省不同產(chǎn)地、品種的大豆中大豆異黃酮進行提取，并對其中的5種單體含量進行測定，利用大豆異黃酮單體含量的不同對大豆溯源特征指標進行篩選，以期促進大豆種植提質(zhì)增效和食品加工高效利用，并為黑龍江大豆食品安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆，采集于黑龍江省黑河市愛輝區(qū)、黑河市北安市、農(nóng)墾北安分公司、農(nóng)墾寶泉嶺分公司、農(nóng)墾牡丹江分公司，品種以符號及數(shù)字表示。大豆苷標準品、黃豆黃苷標準品、染料木苷標準品、大豆苷元標準品、染料木素標準品，成都曼斯特生物科技有限公司；冰乙酸、甲醇、乙腈，色譜純；石油醚、乙醇，分析純。

1260高效液相色譜儀、G412B二極管陣列檢測器，安捷倫科技有限公司；SionChrom ODS-BP色譜柱，大連依利特分析儀器有限公司；0.22、0.45 μm針式微孔濾膜，天津津騰實驗設(shè)備有限公司；KH-5200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲有限公司；DGG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；電子分析天平，上海精科天美儀器有限公司；GY-FS-02多功能粉碎機，江西贛運食品機械有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Smart超純水系統(tǒng)，上?？道追治鰞x器有限公司；SOX500脂肪測定儀，濟南海能儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

選擇顆粒飽滿、色澤均一的大豆樣品，每份100 g，用去離子水洗凈，干燥后粉碎，過0.425 mm(40目)篩，密封，于4℃保存，備用。

1.2.2 大豆異黃酮的提取

取大豆粉樣品兩份，每份5 g，按料液比1∶10加入石油醚，于60℃下脫脂3 h[12]，然后于50℃恒溫鼓風(fēng)干燥。將脫脂樣品放入超聲波清洗器中，按料液比1∶15加入70%乙醇提取劑[13-14]，在70℃、超聲功率160 W條件下提取40 min[15]。然后將提取液在4 000 r/min下離心20 min。離心后殘渣經(jīng)二次提取，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約50 mL，取4 mL濃縮液在1 000 r/min下離心20 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，待分析。

1.2.3 大豆異黃酮單體含量的測定

采用高效液相色譜儀測定大豆異黃酮含量，采用面積歸一化法定量5種大豆異黃酮單體含量。

高效液相色譜條件[10]：SionChrom ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長260 nm；流動相A為0.1%乙酸溶液，流動相B為0.1%乙酸-乙腈溶液，梯度洗脫程序見表1；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；進樣量10 μL。

表1 HPLC測大豆異黃酮單體含量梯度洗脫程序

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一產(chǎn)地不同品種大豆中大豆異黃酮單體的差異性分析

2.1.1 黑河市愛輝區(qū)

黑河市愛輝區(qū)大豆中大豆異黃酮單體含量的測定結(jié)果見表2。

表2 黑河市愛輝區(qū)大豆中大豆異黃酮單體含量 μg/g

由表2可知，大豆異黃酮單體大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元含量在不同品種中差異顯著(p<0.05)。染料木素含量在HN95、HH53和JY55品種中差異不顯著 (p>0.05)。因此，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元含量可以作為黑河市愛輝區(qū)不同品種大豆的溯源特征指標。

2.1.2 黑河市北安市

黑河市北安市大豆中大豆異黃酮單體含量測定結(jié)果見表3。

表3 黑河市北安市大豆中大豆異黃酮單體含量 μg/g

由表3可知，大豆異黃酮單體大豆苷、染料木苷、染料木素含量在不同品種中差異顯著(p<0.05)。黃豆黃苷含量在DS7和HH43品種中差異不顯著(p>0.05)；大豆苷元含量在HD1和LD3品種中差異不顯著 (p>0.05)。因此，大豆苷、染料木苷、染料木素含量可以作為黑河市北安市不同品種大豆的溯源特征指標。

2.1.3 農(nóng)墾北安分公司

農(nóng)墾北安分公司大豆中大豆異黃酮單體含量測定結(jié)果見表4。

表4 農(nóng)墾北安分公司大豆中大豆異黃酮單體含量 μg/g

由表4可知，大豆異黃酮單體大豆苷、染料木苷含量在不同品種中差異顯著(p<0.05)。黃豆黃苷含量在DD9和HLD2品種中差異不顯著 (p>0.05)；大豆苷元含量在JS4、BY901和HH43品種中差異不顯著 (p>0.05)，在HLD2和9302品種中差異不顯著 (p>0.05)；染料木素含量在LK3318和HH43品種中差異不顯著(p>0.05)，在BY901、9302和HLD2品種中差異不顯著(p>0.05)。因此，大豆苷、染料木苷含量可以作為農(nóng)墾北安分公司不同品種大豆溯源特征指標。

2.1.4 農(nóng)墾寶泉嶺分公司

農(nóng)墾寶泉嶺分公司大豆中大豆異黃酮單體含量測定結(jié)果見表5。

表5 農(nóng)墾寶泉嶺分公司大豆中大豆異黃酮單體含量 μg/g

由表5可知，大豆異黃酮單體大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷含量在不同品種中差異顯著(p<0.05)。大豆苷元含量在KF20和HH43品種中差異不顯著 (p>0.05)；染料木素含量在GQHH52和YJHH52品種中差異不顯著 (p>0.05)，在KF20和HH43品種中差異不顯著 (p>0.05)。因此，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷含量可以作為農(nóng)墾寶泉嶺分公司不同品種大豆的溯源特征指標。

2.1.5 農(nóng)墾牡丹江分公司

農(nóng)墾牡丹江分公司大豆中大豆異黃酮單體含量測定結(jié)果見表6。

表6 農(nóng)墾牡丹江分公司大豆中大豆異黃酮單體含量 μg/g

由表6可知，大豆苷、染料木苷含量在不同品種中差異顯著(p<0.05)。黃豆黃苷含量在KF14和WM品種中差異不顯著 (p>0.05)，在KF14和KF17品種中差異不顯著 (p>0.05)，在KF20和KF17品種中差異不顯著(p>0.05),在DN253、DS31A1和KN36品種中差異不顯著(p>0.05)，在DS10和KF37品種中差異不顯著(p>0.05)；大豆苷元含量在DN253、KN36和KN37品種中差異不顯著(p>0.05)，在KF20和KF17品種中差異不顯著(p>0.05)，在KF37、DS31A1和DS10品種中差異不顯著(p>0.05)；染料木素含量在KN30、DS31A1和DS10品種中差異不顯著(p>0.05)，在KF17和DN253品種中差異不顯著(p>0.05)，在KF37和KN36品種中差異不顯著(p>0.05)。因此，大豆苷、染料木苷含量可以作為農(nóng)墾牡丹江分公司不同品種大豆的溯源特征指標。

2.2 不同產(chǎn)地不同品種大豆異黃酮單體差異性分析

不同產(chǎn)地不同品種大豆異黃酮單體含量統(tǒng)計分析結(jié)果見表7。

表7 不同產(chǎn)地不同品種大豆異黃酮單體含量 μg/g

由表7可知：大豆苷含量在黑河市愛輝區(qū)、黑河市北安市、農(nóng)墾北安分公司和農(nóng)墾寶泉嶺分公司中差異不顯著 (p>0.05)，在農(nóng)墾北安分公司、農(nóng)墾牡丹江分公司和農(nóng)墾寶泉嶺分公司中差異不顯著(p>0.05)；黃豆黃苷含量在黑河市北安市、農(nóng)墾北安分公司、農(nóng)墾牡丹江分公司和農(nóng)墾寶泉嶺分公司中差異不顯著(p>0.05)；染料木苷含量在黑河市愛輝區(qū)、黑河市北安市、農(nóng)墾北安分公司和農(nóng)墾寶泉嶺分公司中差異不顯著(p>0.05)，在農(nóng)墾寶泉嶺分公司、農(nóng)墾北安分公司和農(nóng)墾牡丹江分公司中差異不顯著(p>0.05)；大豆苷元含量在黑河市愛輝區(qū)、黑河市北安市、農(nóng)墾北安分公司和農(nóng)墾寶泉嶺分公司中差異不顯著(p>0.05)，在農(nóng)墾北安分公司、農(nóng)墾牡丹江分公司和農(nóng)墾寶泉嶺分公司中差異不顯著(p>0.05)；染料木素含量在黑河市愛輝區(qū)、黑河市北安市、農(nóng)墾北安分公司和農(nóng)墾寶泉嶺分公司中差異不顯著(p>0.05)，在黑河市北安市、農(nóng)墾北安分公司、農(nóng)墾牡丹江分公司和農(nóng)墾寶泉嶺分公司中差異不顯著 (p>0.05)。結(jié)果說明，不同產(chǎn)地不同品種之間大豆異黃酮單體含量總體沒有顯著差異。影響大豆異黃酮含量的主要因素有種植年份、種植地點、基因型和各項相互作用，大豆異黃酮含量存在顯著的基因型差異，并且對環(huán)境條件的反應(yīng)程度也不相同，所以不同基因型、不同種植地點的大豆間差異顯著性是不穩(wěn)定的，在以大豆異黃酮含量為目標性狀的大豆育種中，應(yīng)該參考多年多點的數(shù)據(jù)對其進行綜合評價與選擇[16]。

3 結(jié) 論

本文對黑龍江不同品種、不同產(chǎn)地大豆中大豆異黃酮單體含量進行測定和差異性分析。結(jié)果表明：同一產(chǎn)地不同品種之間大豆異黃酮單體含量總體差異顯著，不同產(chǎn)地不同品種之間大豆異黃酮單體含量總體沒有顯著差異。因此，可以利用不同品種大豆中大豆異黃酮單體含量作為對大豆異黃酮溯源特征指標實現(xiàn)品種溯源，由于這些品種分別適用于黑龍江省不同的積溫帶，今后有望作為大豆品種及產(chǎn)地溯源的特征指標，從而可以保護黑龍江大豆品牌，提高政府對大豆市場的監(jiān)管力度，有效保證國家糧食安全。

本研究僅對大豆異黃酮類溯源特征指標進行差異性分析，還應(yīng)探索大豆中其他次生代謝產(chǎn)物的特征指標，構(gòu)成一個指標體系進行產(chǎn)地溯源，提高溯源過程的產(chǎn)地判別率。