肖運(yùn)強(qiáng)，劉俊霞，張 飛

（1.喀什職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 喀什 844000；2.克州人力資源與社會(huì)保障局）

蔥屬植物為多年生草本，常有蔥蒜味，具圓柱狀至球狀鱗莖[1]。多數(shù)為優(yōu)良牧草，有很高的飼用價(jià)值，對(duì)牲畜抓膘、育肥和防病、治病有重要作用[2]。我國(guó)蔥屬植物現(xiàn)今己知約有115種，主要分布在東北、華北、西北和西南地區(qū)[3]。新疆蔥屬植物資源豐富，是世界該屬植物的起源和分布中心之一[4]，其種類(lèi)約占全國(guó)蔥屬植物的1/2，迄今為止已知達(dá)54種、2變種，其中29種僅在我國(guó)新疆分布[3]。

棱葉韭（Allium caeruleumPallas.）為百合科蔥屬的植物，俗稱(chēng)蘭花蔥，其傘形花序球狀，具多而密集的花，花為天藍(lán)色[3]，生長(zhǎng)于海拔1 140～ 2 950 m的地區(qū)，一般生于真草原、草甸草原、亞高山草甸、山地灌叢等地，國(guó)內(nèi)僅分布于新疆，察布察爾、特克斯、昭蘇、尼勒克、新源、木壘、阜康均有分布[5]；國(guó)外在原蘇聯(lián)伏爾加河下游到西伯利亞也有分布。在應(yīng)用上，棱葉韭常被用作薤白的代用品，具有一定的藥用價(jià)值[6]。

知母薤（Allium cernuumSchrenk.）為百合科蔥屬植物，花序半球形至球形，花天藍(lán)色，具深色的脈，花絲長(zhǎng)為花被片3/4的長(zhǎng)度，花期為5～6月，生于荒漠、干旱海拔700～ 2 000 m草場(chǎng)。產(chǎn)于額爾齊斯河、伊犁河沿岸。哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、塔吉克斯坦、烏茲別克斯坦也有分布。

花粉的活力與壽命、柱頭的可授性為傳粉生態(tài)學(xué)所必須研究的內(nèi)容[7]。趙金花等[2]采用TTC法、孢粉染色法及聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法，從花粉活力、花粉可育性及柱頭可授性方面研究了蒙古韭（Allium?mongolicum）、堿韭（A .polyrhizum）和細(xì)葉韭（A.tenuissimum）3種野生蔥屬植物的傳粉生物學(xué)特征。林辰壹等[8]用MTT法和聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法可在田間快速檢測(cè)高葶韭柱頭育性。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)棱葉韭和知母薤繁殖規(guī)律特點(diǎn)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以蔥屬植物棱葉韭和知母薤為供試材料，采用不同的方法在不同時(shí)期檢測(cè)棱葉韭和知母薤柱頭可授性，并找出2種蔥屬植物柱頭可授性的變化規(guī)律，為提高其繁殖數(shù)量及雜交育種和資源利用提供理論依據(jù)和參考資料。

1 材料與方法

1.1 樣地概況及試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于烏魯木齊市西郊，三坪農(nóng)場(chǎng)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地蔥屬植物資源圃，地理位置為43°48′N(xiāo)，87°34′E，海拔850 m，處于準(zhǔn)格爾盆地南緣天山前山帶沖積扇平原，土壤為細(xì)礫質(zhì)荒漠土。

通過(guò)田間定株觀(guān)察，當(dāng)棱葉韭和知母薤處于盛花期時(shí)，根據(jù)單花的開(kāi)花動(dòng)態(tài)，將棱葉韭分為10個(gè)時(shí)期，知母薤分為7個(gè)時(shí)期，分別取各時(shí)期的柱頭進(jìn)行檢測(cè)可授性，具體取材標(biāo)準(zhǔn)，如表1和表2所示。

表1 棱葉韭取樣標(biāo)準(zhǔn)

表2 知母薤取樣標(biāo)準(zhǔn)

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平、燒杯、容量瓶、量筒、刀片、鑷子、玻璃棒、棕色儲(chǔ)液瓶、標(biāo)簽、記號(hào)筆、載玻片、蓋玻片、pH試紙、便攜式冰箱、白紙、熒光顯微鏡、帶螺口蓋的玻璃瓶、離心瓶、培養(yǎng)皿、黑布等。

1.3 藥品配制

1.3.1 5 mg/L MTT法藥品配制

稱(chēng)取0.25 g MTT，溶于50 mL濃度為0.15 mol/L磷酸氫二鉀緩沖液（3.423 3 g磷酸氫二鉀溶于50 mL蒸餾水，pH=7.4）中[8]。

1.3.2 聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法藥品配制

將1%聯(lián)苯胺（聯(lián)苯胺0.108 2 g溶于10.8 mL 70%酒精中）、3%過(guò)氧化氫、蒸餾水按體積比為4∶11∶22的比例混合[2]、[13]。

1.3.3 苯胺藍(lán)-熒光顯微鏡法藥品配制

FAA固定液配制：量取37%～ 40%甲醛5 mL；45%冰醋酸5 mL；70%酒精90 mL，混合均勻。

8 mol/L NaOH溶液：稱(chēng)取32 g NaOH溶于100 mL蒸餾水中。

0.1%苯胺藍(lán)溶液：稱(chēng)取0.1 g苯胺藍(lán)溶于100 mL0.15 mol/L K2HPO4緩沖液（K2HPO43.423 3 g溶于100 mL蒸餾水）中[9]。

注意事項(xiàng)：脫色水溶性苯胺藍(lán)溶液應(yīng)提前24 h配置好，放在黑暗處保存。配好的藥液應(yīng)避光，放在4 ℃的冰箱內(nèi)保存。

1.4 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)棱葉韭、知母薤柱頭可授性檢測(cè)主要采用MTT法、聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法和苯胺藍(lán)-熒光染色法，其中，MTT法和聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法在三坪農(nóng)場(chǎng)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地蔥屬資源圃進(jìn)行，苯胺藍(lán)-熒光顯微鏡法在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝樓五樓顯微觀(guān)察室進(jìn)行。

1.4.1 MTT法

具體方法：取不同花藥呈現(xiàn)階段棱葉韭和知母薤的柱頭各20枚，將柱頭置于盛有5 mg/L MTT溶液的培養(yǎng)皿中，每個(gè)供試柱頭用藥液充分浸透，放在避光的處反應(yīng)10 min，若柱頭具有可授性，則柱頭被染成深藍(lán)色或深紫色，顏色由淺變深，柱頭可授性由弱變強(qiáng)。若沒(méi)有可授性，則柱頭沒(méi)有顏色反應(yīng)。

1.4.2 聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法

具體方法：剪取不同花藥呈現(xiàn)階段棱葉韭和知母薤的柱頭各20枚，浸入裝有聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫反應(yīng)液的培養(yǎng)皿中。1～2 min后觀(guān)察柱頭染色的部位，柱頭至少2/3部位呈現(xiàn)深藍(lán)色并伴有大量氣泡出現(xiàn)認(rèn)為柱頭具有可授性，否則柱頭沒(méi)有可授性。然后計(jì)算具有可授性的柱頭數(shù)量占共測(cè)柱頭總數(shù)的百分率。

1.4.3 苯胺藍(lán)-熒光染色法

具體方法：采集棱葉韭和知母薤各個(gè)時(shí)期的柱頭各20枚，立即放入FAA固定液中，并置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。柱頭在熒光顯微鏡下觀(guān)察之前，應(yīng)進(jìn)行軟化、沖洗、染色及封片處理。軟化：將材料放入8 mol/L NaOH中，軟化3 h；沖洗：將軟化的材料撈出，蒸餾水沖洗至少1 h，中間多次換水；染色：將沖洗后的材料放在0.1%水溶性苯胺藍(lán)染液中4 ℃環(huán)境下染色4 h；封片：染色后的柱頭放在載玻片上，用吸水紙將染液吸干，將柱頭與子房分離，滴一滴甘油（丙三醇），蓋上蓋玻片，用鉛筆上的橡皮頭輕壓，使花柱展開(kāi)；觀(guān)察：將片子放在Nikon ECLIPSE 80 i 熒光顯微鏡330～ 380 波段下，用10 倍鏡進(jìn)行觀(guān)察。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件，圖片整理采用Adobe Photoshop CC軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 棱葉韭柱頭可授性

由表3和圖1可知，采用MTT法，第Ⅲ時(shí)期及之前每個(gè)時(shí)期棱葉韭柱頭可授性為0；第Ⅳ時(shí)期為50%，柱頭開(kāi)始具有可授性；第Ⅵ時(shí)期和第Ⅶ時(shí)期達(dá)到100%，柱頭可授性達(dá)到最佳狀態(tài)；第Ⅷ時(shí)期為85.7%，柱頭可授性開(kāi)始下降；第Ⅸ時(shí)期及以后時(shí)期為0，柱頭不具可授性。

表3 3種方法檢測(cè)知母薤柱頭可授性

圖1 3種方法檢測(cè)棱葉韭柱頭可授性

棱葉韭柱頭與聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫反應(yīng)后，具有可授性的柱頭變成藍(lán)色變化并有氣泡產(chǎn)生。第Ⅲ時(shí)期及以前時(shí)期柱頭可授性為0；第Ⅳ時(shí)期為50%，柱頭開(kāi)始具有可授性；第Ⅵ時(shí)期和第Ⅶ時(shí)期達(dá)到100%，柱頭可授性達(dá)到最佳狀態(tài)；第Ⅷ時(shí)期為22.2%，柱頭可授性開(kāi)始下降。

熒光顯微鏡觀(guān)察柱頭可授性，發(fā)現(xiàn)棱葉韭在第Ⅱ時(shí)期及以前時(shí)期柱頭可授性為0；第Ⅲ時(shí)期為25%柱頭可是具有可授性，花粉管萌發(fā)的數(shù)量少，第Ⅴ時(shí)期花粉管萌發(fā)數(shù)量多，可授性達(dá)到100%。之后的每個(gè)時(shí)期可授性都保持平穩(wěn)的狀態(tài)。

2.2 知母薤柱頭可授性

由表4和圖2可知，知母薤柱頭與MTT反應(yīng)后，具有可授性的柱頭變成藍(lán)色變化并有氣泡產(chǎn)生。第Ⅰ時(shí)期柱頭可授性為0；第Ⅱ時(shí)期為25%，柱頭開(kāi)始具有可授性；第Ⅲ時(shí)期達(dá)到72.7%，柱頭可授性達(dá)到最高；第Ⅵ時(shí)期為0，柱頭失去可授性。

表4 3種方法檢測(cè)棱葉韭柱頭可授性

圖2 3種方法檢測(cè)知母薤柱頭可授性

知母薤柱頭與聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫反應(yīng)后柱頭呈現(xiàn)藍(lán)紫色，顏色由淺變深，柱頭可授性由弱變強(qiáng)。第Ⅰ時(shí)期柱頭可授性為0；第Ⅱ時(shí)期為25%，柱頭開(kāi)始具有可授性；第Ⅴ時(shí)期為80%，柱頭可授性達(dá)到最高；第Ⅶ時(shí)期為0，柱頭失去可授性。

熒光顯微鏡觀(guān)察柱頭可授性，第Ⅰ時(shí)期及以前每個(gè)時(shí)期柱頭可授性為0；第Ⅱ時(shí)期為50%，柱頭開(kāi)始具有可授性；第Ⅳ時(shí)期達(dá)到100%，柱頭可授性達(dá)到最佳狀態(tài)，之后的每個(gè)時(shí)期都保持平穩(wěn)狀態(tài)。

3 討論

柱頭可授期是花朵成熟過(guò)程中的一個(gè)重要時(shí)期，它能在很大程度上影響自花傳粉率、開(kāi)花不同階段的傳粉成功率[10]。不同植物柱頭可授期持續(xù)的時(shí)間從幾小時(shí)到十幾天不等[11]，花的年齡、一天內(nèi)的不同時(shí)間以及柱頭分泌物的有無(wú)等對(duì)其均有影響[12]。用MTT法和聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法檢測(cè)柱頭可授性，在很多文章中有相關(guān)報(bào)道[2]、[13-14]。本試驗(yàn)中，棱葉韭和知母薤在六枚花藥已散粉、花被片開(kāi)始閉合到花被片完全閉合出現(xiàn)柱頭可授性的高峰，這與蔥屬植物高葶韭的柱頭可授性表現(xiàn)基本一致。棱葉韭和知母薤的柱頭可授期與柱頭的形態(tài)特征變化密切相關(guān)，在六枚花藥散粉、花被片開(kāi)始閉合、柱頭開(kāi)始伸長(zhǎng)過(guò)程中，柱頭才具有可授性，時(shí)間較短，要充分把握柱頭的可授期特點(diǎn)在今后育種過(guò)程中為最佳授粉期的選擇提供了重要依據(jù)，保證人工馴化過(guò)程中繁殖成功[8]。

3種方法檢測(cè)棱葉韭柱頭可授性，用MTT法檢測(cè)柱頭可授性時(shí)，在第Ⅲ時(shí)期柱頭不具可授性，在第Ⅵ時(shí)期出現(xiàn)柱頭可授性高峰，一直持續(xù)到第Ⅶ時(shí)期，用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法檢測(cè)柱頭可授性時(shí)，柱頭可授性在第Ⅵ時(shí)期到第Ⅶ時(shí)期出現(xiàn)柱頭可授性高峰，用苯胺藍(lán)-熒光染色法檢測(cè)柱頭可授性時(shí)，第Ⅲ時(shí)期出現(xiàn)柱頭可授性，第Ⅴ時(shí)期柱頭可授性達(dá)到最大值，此后一直保持穩(wěn)定。苯胺藍(lán)-熒光染色法檢測(cè)柱頭可授性與MTT法和聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法檢測(cè)柱頭可授性的規(guī)律不同，苯胺藍(lán)-熒光染色法檢測(cè)的是花粉在柱頭上萌發(fā)，花粉管從柱頭經(jīng)花柱到子房行走的路徑，間接反應(yīng)柱頭的可授性，但不能說(shuō)明此時(shí)柱頭具有可授性。因此，柱頭真正具有可授性的時(shí)間比苯胺藍(lán)-熒光染色法檢測(cè)顯示的時(shí)間早。

3種方法檢測(cè)知母薤柱頭可授性，在第Ⅱ時(shí)期之前都未出現(xiàn)柱頭可授性。用MTT法檢測(cè)知母薤柱頭可授性在第Ⅲ時(shí)期柱頭可授性達(dá)到最高值，隨后下降，用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法檢測(cè)柱頭可授性，在第Ⅴ時(shí)期柱頭可授性達(dá)到最高值，這與MTT法檢測(cè)的結(jié)果不同，可能是由于采集柱頭時(shí)出現(xiàn)的誤差導(dǎo)致。用苯胺藍(lán)-熒光染色法，在第Ⅱ時(shí)期柱頭出現(xiàn)可授性，第Ⅳ時(shí)期可授性達(dá)到最高值，隨后保持不變。這與前2 種方法檢測(cè)的結(jié)果有差異，原因是苯胺藍(lán)-熒光染色法檢測(cè)的是花粉在柱頭上萌發(fā)，花粉管從柱頭經(jīng)花柱到子房行走的路徑，間接反應(yīng)柱頭的可授性，但不能說(shuō)明此時(shí)柱頭具有可授性，這與苯胺藍(lán)-熒光染色法檢測(cè)棱葉韭柱頭可授性的結(jié)果一致。因此，柱頭真正具有可授性的時(shí)間比苯胺藍(lán)-熒光染色法檢測(cè)顯示的時(shí)間早。

4 結(jié)論

3種方法檢測(cè)棱葉韭柱頭可授性，在6枚花藥已散粉，柱頭微長(zhǎng)于花被片，花被片半閉合（Ⅴ）到花被片完全閉合（Ⅶ）3個(gè)時(shí)期，可授性達(dá)到最高，在此期間授粉效果最佳。

3種方法檢測(cè)知母薤柱頭可授性，在6枚花藥已散粉，柱頭等于花絲，子房未膨大（Ⅲ）到6枚花藥已散粉，柱頭微長(zhǎng)于花絲，花被片即將完全閉合，略干枯發(fā)黃（Ⅴ），可授性達(dá)到最高，在此期間授粉效果最佳。

3種方法中，MTT法和聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法方便、快捷，檢測(cè)結(jié)果明顯，可直接用于田間檢測(cè)蔥屬植物柱頭可授性；苯胺藍(lán)-熒光染色法雖然檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但易受試驗(yàn)成本和儀器的限制，因此檢測(cè)柱頭可授性時(shí)，此種方法不建議使用。