范礦士，張 華，吳 瓊，周 波，姜昕雨，史晶晶，張永紅*，崔德鳳*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物類國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京 102206；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071000；3. 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100070)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)最流行的傳染病之一，以呼吸窘迫、妊娠母豬流產(chǎn)和仔豬高死亡率為特征[1]，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染豬后在肺巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)散至全身出現(xiàn)病毒血癥，對(duì)機(jī)體免疫器官造成損傷，引發(fā)炎性反應(yīng)[2-3]，導(dǎo)致免疫抑制，引起持續(xù)感染和繼發(fā)感染，嚴(yán)重威脅豬群的健康[4-5]。目前，該病主要是通過(guò)疫苗預(yù)防，然而，面對(duì)PRRSV感染引起的免疫抑制、病毒進(jìn)化、野生型和修飾活病毒(modified-live vaccine，MLV)之間的多重重組問(wèn)題，已獲得許可的疫苗不能有效抵御挑戰(zhàn)[6]。迫切需要一種新的抗病毒策略控制PRRSV的傳播。

中藥擁有豐富的活性成分和藥理作用，對(duì)動(dòng)物毒害小，近年廣泛用于抗PRRSV的研究，許多天然化合物和中草藥成分已被證實(shí)具有抗PRRSV活性[7]。尤其是黃芩、連翹和金銀花，已被證明能在體外有效抑制PRRSV的增殖。黃芩的主要成分黃酮類化合物黃芩苷和黃芩素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌和抗病毒等多種藥理作用，其提取物黃芩苷對(duì)PRRSV具有很好的阻斷吸附效果，且保護(hù)率在50%以上[8-9]。連翹可以中和內(nèi)毒素，具有良好的抗炎和解熱作用[10]。從貫葉連翹中提取的具有生物活性的金絲桃素在體外抗PRRSV中能夠提高細(xì)胞存活率和抑制PRRSV復(fù)制[11]。金銀花對(duì)多種常見呼吸道病毒都具有一定的抑制作用，金銀花提取物大孔樹脂600 ml/L的乙醇/水洗脫部位具有良好的體外抗PRRSV活性[12-13]。CHENG等[14]發(fā)現(xiàn)，綠原酸和黃芩素能抑制PRRSV的復(fù)制或直接殺滅PRRSV，在最大安全濃度下對(duì)PRRSV的抑制率分別達(dá)到90.8%和61.1%，而對(duì)病毒的吸附?jīng)]有阻斷作用。

單味中藥在改善被PRRSV破壞的免疫系統(tǒng)并發(fā)揮良好的抗病毒效果不如中藥復(fù)方[15]。故該研究擬將金銀花、黃芩、連翹按1∶1∶2配比組成雙黃連水煎液，使用建立的熒光定量PCR方法，探索雙黃連水煎液對(duì)PRRSV復(fù)制的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PET-28a-N載體質(zhì)粒和非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞(Marc-145細(xì)胞)由北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、豬圓環(huán)病毒1型(porcine circovirus type 1，PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)、豬博卡病毒(porcine boca virus，PBoV)由北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；黃芩、金銀花、連翹購(gòu)自北京同仁堂大藥房；CCK8細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Solarbio公司；SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒、SteadyPure病毒DNA/RNA提取試劑盒、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒均購(gòu)自湖南艾克瑞生物工程有限公司。倒置顯微鏡為OLYMPUS公司制造；StepOnePlus熒光定量PCR儀為Applied Biosystems公司制造；酶標(biāo)儀為北京普朗新技術(shù)有限公司制造；MLS-3750型高壓滅菌鍋為SANYO公司制造。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)公布的PRRSV-N基因序列(EU926974.1)通過(guò)primer5.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物，并由北京擎科生物科技有限公司合成，擴(kuò)增產(chǎn)物372 bp。

1.3 熒光定量PCR方法的建立及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)定濃度后計(jì)算其拷貝數(shù)值。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行8個(gè)連續(xù)的10倍梯度稀釋。根據(jù)SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒說(shuō)明書以及引物特性和模板濃度進(jìn)行試驗(yàn)，探索最佳擴(kuò)增反應(yīng)條件和反應(yīng)體系。反復(fù)試驗(yàn)后，選擇20 μL反應(yīng)體系：10 μL的2×SYBR Green Pro Tap HS Premix×6；上游引物和下游引物各0.4 μL；模板2.0 μL；ROX Reference Dye (20 μmol/L)0.4 μL；RNase Free dH2O為6.8 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，選取至少5個(gè)連續(xù)的不同濃度梯度的結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)得到的Ct值和擴(kuò)增曲線得出最佳的檢測(cè)區(qū)域和方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 熒光定量PCR重復(fù)性檢驗(yàn)

將稀釋好的質(zhì)粒選擇1×104、1×106、1×108的樣本進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。同時(shí)分批進(jìn)行3次熒光定量PCR擴(kuò)增，比較同一批次同一濃度(批內(nèi)試驗(yàn))和不同批次同一濃度(批間試驗(yàn))Ct值和Tm值的變化情況，驗(yàn)證重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.5 熒光定量PCR特異性檢驗(yàn)

以提取的豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒1型、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬博卡病毒核酸為模板，RNA病毒需反轉(zhuǎn)錄，使用優(yōu)化過(guò)的最佳反應(yīng)條件，按照PRRSV的熒光定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)所建方法的特異性。

1.6 病毒培養(yǎng)及TCID50測(cè)定

取出已長(zhǎng)成單層、生長(zhǎng)良好的Marc-145細(xì)胞清洗2～3遍。加入病毒液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，加入2 mL的2%血清維持培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，反復(fù)凍融3次，1 000 r/min離心5 min，上清即為病毒液，保存于-80 ℃。

將Marc-145細(xì)胞消化成單個(gè)懸液，取少量滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，均勻添加到96孔板中，每孔100 μL，置于5%CO237 ℃培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄去培養(yǎng)液，病毒用細(xì)胞維持液稀釋到8個(gè)稀釋度即10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2和10-1，每孔加100 μL，每個(gè)稀釋度進(jìn)行8個(gè)重復(fù)，72 h后觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)。根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。

1.7 雙黃連水煎液的制作

金銀花、黃芩、連翹按1∶1∶2稱取100 g，加水浸泡過(guò)夜。慢火水煎煮2次，每次沸騰30 min，合并2次水煎液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，定容至1 g/mL，離心取上清，用0.45 μm和0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，分裝后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8 雙黃連水煎液對(duì)Marc-145細(xì)胞的安全性測(cè)定

為了確定雙黃連水煎液對(duì)Marc-145細(xì)胞的最大安全質(zhì)量濃度和最佳作用時(shí)間，試驗(yàn)采用CCK8法。首先對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，然后均勻添加到96孔板中，每孔100 μL。200.00 mg/mL的雙黃連水煎液用細(xì)胞維持液依次進(jìn)行2倍倍比稀釋后，將稀釋好的雙黃連水煎液100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56和0.78 mg/mL分別加入96孔板中，每孔100 μL，同時(shí)設(shè)置對(duì)照(對(duì)照是指具有細(xì)胞、CCK8溶液而沒(méi)有經(jīng)過(guò)雙黃連水煎液處理)。分別培養(yǎng)24、48和72 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加90 μL細(xì)胞維持液和10 μL的CCK8(避光)，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h，在酶標(biāo)儀上對(duì)OD450 nm進(jìn)行檢測(cè)并記錄。

1.9 雙黃連水煎液對(duì)PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的影響

1.9.1 雙黃連水煎液對(duì)PRRSV抑制復(fù)制作用 使用100TCID50的PRRSV對(duì)長(zhǎng)成單層的Marc-145細(xì)胞進(jìn)行攻毒，作用1 h后棄去病毒液，加入雙黃連水煎液1.56、3.12和6.25 mg/mL，PRRSV侵染細(xì)胞后沒(méi)有添加雙黃連水煎液為病毒對(duì)照。孵育1 h后棄去藥液，加入含2%胎牛血清的細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后用熒光定量PCR分別檢測(cè)病毒載量。

1.9.2 雙黃連水煎液對(duì)PRRSV的阻斷吸附作用 Marc-145細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，加入1.56、3.12 和6.25 mg/mL雙黃連水煎液，PRRSV侵染細(xì)胞前沒(méi)有添加雙黃連水煎液作用為病毒對(duì)照。培養(yǎng)箱中孵育1 h，棄去藥液，加入100TCID50的PRRSV孵育1 h，棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后應(yīng)用熒光定量PCR分別檢測(cè)病毒載量。

1.9.3 雙黃連水煎液對(duì)PRRS病毒粒子直接殺滅作用 Marc-145細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，將1.56、3.12和6.25 mg/mL的雙黃連水煎液與100TCID50的PRRSV作用1 h后感染Marc-145細(xì)胞，PRRSV侵染細(xì)胞前沒(méi)有與雙黃連水煎液相互作用為病毒對(duì)照。1 h后更換含2%胎牛血清的細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后熒光定量PCR檢測(cè)病毒載量。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析，使用t檢驗(yàn)法以確定目的基因在不同組別的顯著性差異，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P<0.001表示差異非常顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 PRRSV-N基因熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

PRRSV-N基因的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1和圖2。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-3.26，軸距32.4，方程y=-3.26x+32.4，相關(guān)系數(shù)R2>0.999，擴(kuò)增效率102.668%。溶解曲線在特定范圍內(nèi)顯示單一峰(圖3)，無(wú)非特異性峰，無(wú)引物二聚體形成，擴(kuò)增產(chǎn)物均一，符合試驗(yàn)的要求。

圖1 PRRSV熒光定量擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Dynamic curve of fluorescence quantitative PCR for PRRSV

圖2 PRRSV熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of fluorescence quantitative PCR for PRRSV

圖3 熒光定量PCR溶解曲線Fig.3 The melting curve of fluorescence quantitative PCR for PRRSV

2.2 PRRSV-N基因熒光定量PCR重復(fù)性檢驗(yàn)

將選取的3組濃度梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行重復(fù)性檢驗(yàn)，通過(guò)Ct值計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)差小于0.5，變異系數(shù)小于3%(表1)。

2.3 PRRSV-N基因熒光定量PCR特異性檢驗(yàn)

所擴(kuò)增的6種病毒模板中只有PRRSV出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線和溶解曲線，證實(shí)建立的檢測(cè)方法具有很強(qiáng)的特異性。

表1 熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)Tab.1 Repeatability test of fluorescence quantitative PCR

2.4 PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的TCID50測(cè)定

Marc-145細(xì)胞感染PRRSV 72 h后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，可見病毒感染后期，細(xì)胞形態(tài)腫脹變圓，細(xì)胞間質(zhì)模糊，直至細(xì)胞死亡脫落。采用Reed-muench法計(jì)算病毒對(duì)Marc-145細(xì)胞的毒力，用TCID50表示，試驗(yàn)結(jié)果見表2，PRRSV在Marc-145細(xì)胞的TCID50為10-3.9/0.1 mL。

表2 PRRSV TCID50結(jié)果(n=8)Tab.2 PRRSV TCID50 results(n=8)

2.5 雙黃連水煎液對(duì)Marc-145細(xì)胞安全性測(cè)定結(jié)果

當(dāng)雙黃連水煎液在6.25 mg/mL時(shí)，與對(duì)照無(wú)顯著性差異(P>0.05)，對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響。72 h時(shí)細(xì)胞活力最高，此試驗(yàn)選取雙黃連水煎液最大安全質(zhì)量濃度6.25 mg/mL，最佳作用時(shí)間72 h(圖4)。

注：*P<0.05表示差異顯著，** P<0.01表示差異極顯著。Note: *P<0.05 means significant difference, ** P<0.01 means extremely significant difference.圖4 雙黃連水煎液對(duì)Marc-145細(xì)胞安全性測(cè)定結(jié)果Fig.4 Safety of Shuanghuanglian decoction on Marc-145 cells

2.6 雙黃連水煎液體外抗PRRSV的效果測(cè)定

2.6.1 雙黃連水煎液對(duì)PRRSV抑制復(fù)制效果 隨著雙黃連水煎液質(zhì)量濃度的增加，PRRSV-N基因mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，當(dāng)雙黃連水煎液作用時(shí)間達(dá)到72 h，PRRSV-N基因mRNA表達(dá)量與病毒對(duì)照相比差異非常顯著(P<0.001)，雙黃連水煎液能夠有效抑制PRRSV的復(fù)制，且具有時(shí)間依賴性和劑量依賴性(圖5和圖6)。

注：*P<0.05表示差異顯著，** P<0.01表示差異極顯著，***表示差異非常顯著P<0.001。Note: *P<0.05 means significant difference, ** P<0.01 means extremely significant difference, *** P<0.001 means very significant difference.圖5 雙黃連水煎液對(duì)PRRSV的抑制復(fù)制作用Fig.5 Inhibitory effect of Shuanghuanglian decoction on PRRSV replication

注：*P<0.05表示差異顯著。Note: *P<0.05 means significant difference.圖6 不同質(zhì)量濃度雙黃連水煎液對(duì)PRRSV的抑制復(fù)制作用Fig.6 Inhibition of PRRSV replication by Shuanghuanglian decoction of different mass concentrations

2.6.2 雙黃連水煎液對(duì)PRRSV的阻斷吸附效果 與病毒對(duì)照相比，PRRSV-N基因mRNA表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)，見圖7；隨著雙黃連水煎液質(zhì)量濃度的增加，PRRSV-N基因mRNA表達(dá)量逐漸降低(圖8)，當(dāng)雙黃連水煎液質(zhì)量濃度達(dá)到6.25 mg/mL時(shí)，與病毒對(duì)照相比差異極顯著(P<0.01)，表明雙黃連水煎液能夠阻斷PRRSV對(duì)Marc-145細(xì)胞的吸附。

注：** P<0.01表示差異極顯著。Note: ** P<0.01 means extremely significant difference .圖7 雙黃連水煎液對(duì)PRRSV的阻斷吸附作用Fig.7 Inhibition of PRRSV adsorption by Shuanghuanglian decoction

注：*P<0.05表示差異顯著，** P<0.01表示差異極顯著。 Note: *P<0.05 means significant difference, ** P<0.01 means extremely significant difference.圖8 不同質(zhì)量濃度雙黃連水煎液對(duì)PRRSV的阻斷吸附作用Fig.8 Inhibition of PRRSV adsorption by Shuanghuanglian decoction with different mass concentrations

2.6.3 雙黃連水煎液對(duì)PRRSV病毒粒子的直接殺滅效果 雙黃連水煎液對(duì)PRRSV病毒粒子的直接殺滅效果見圖9和圖10。與病毒對(duì)照相比，PRRSV-N基因mRNA表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，表明雙黃連水煎液對(duì)PRRSV病毒粒子沒(méi)有影響。

圖9 雙黃連水煎液對(duì)PRRSV的直接殺滅作用Fig.9 Direct killing effect of Shuanghuanglian decoction on PRRSV

圖10 不同質(zhì)量濃度雙黃連水煎液對(duì)PRRSV的直接殺滅作用Fig.10 Direct killing effect of Shuanghuanglian decoction with different mass concentration on PRRSV

3 討 論

近幾十年來(lái)，中國(guó)PPRS的廣泛爆發(fā)與病毒的高頻率重組和免疫抑制的不斷進(jìn)化有關(guān)，現(xiàn)有疫苗對(duì)PRRS的保護(hù)性免疫僅對(duì)同源感染有效，對(duì)異源PRRSV的感染不能起到良好的保護(hù)作用，因此尋找新的抗病毒治療策略迫在眉睫。

試驗(yàn)前期建立熒光定量PCR方法，其擴(kuò)增效率102.668%，決定系數(shù)大于0.999，變異系數(shù)小于3%，均符合熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立需要滿足的3個(gè)參數(shù)條件[16]。并對(duì)當(dāng)前比較常見的豬博卡病毒和豬圓環(huán)病毒等進(jìn)行特異性檢測(cè)，證實(shí)所建立方法的準(zhǔn)確性和特異性。對(duì)比普通PCR方法，該試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法不僅可以定量、還可以提高檢測(cè)的特異性，適用于臨床檢測(cè)，是國(guó)際公認(rèn)檢測(cè)病毒的黃金標(biāo)準(zhǔn)[17]。

PRRSV通過(guò)膜蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程感染宿主，包括病毒附著和結(jié)合，膜融合和內(nèi)化[18-19]。 一旦病毒基因組(單鏈正向RNA)被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，它就會(huì)進(jìn)行翻譯，從而進(jìn)行復(fù)制并產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。該試驗(yàn)首先通過(guò)CCK8法篩選出雙黃連水煎液對(duì)Marc-145細(xì)胞最大安全質(zhì)量濃度6.25 mg/mL，然后通過(guò)對(duì)PRRSV進(jìn)行直接殺滅、抑制病毒復(fù)制、阻斷病毒吸附試驗(yàn)，分析雙黃連水煎液是否影響PRRSV的生命周期。阻斷病毒吸附試驗(yàn)表明雙黃連水煎液預(yù)處理會(huì)降低Marc-145細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性，影響病毒的附著。雙黃連水煎液在6.25 mg/mL作用72 h時(shí)顯著抑制PRRSV復(fù)制(P<0.05)。雙黃連水煎液對(duì)PRRSV復(fù)制階段的抑制作用更為明顯。

黃芩、金銀花、連翹這三味中藥單獨(dú)使用都具有抗病毒的功效，尤其是對(duì)于呼吸道病有良好的治療效果。該試驗(yàn)提取雙黃連水煎液，對(duì)其體外抗PRRSV效果進(jìn)行初步研究，并顯示出體外抗PRRSV能力。然而藥物的抗病毒活性尚未在體內(nèi)得到進(jìn)一步評(píng)估，而且中藥復(fù)方水煎液成分復(fù)雜，有效成分不明確，在闡明其作用機(jī)制和新藥研發(fā)方面還有很多的缺陷尚待解決[20]。