芮 雪，申貞彥#，賀曉霜，張永紅，宋勤葉，周雙海*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071000)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一種全基因組大小約15 000個(gè)核苷酸的RNA病毒，很容易出現(xiàn)基因變異和重組，具有多種基因類型[1]。雖然PRRSV被分成歐洲型與美洲型這兩個(gè)基本基因型，但迄今為止在中國(guó)流行的絕大多數(shù)是美洲型毒株[2]。當(dāng)前在中國(guó)傳播的美洲型PRRSV毒株從致病性方面主要被分成經(jīng)典株、高致病株、類NADC30株。2006年以前只有PRRSV經(jīng)典株流行的報(bào)道，所引起的疾病就是豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，主要侵害繁殖系統(tǒng)與呼吸系統(tǒng)，引起母豬繁殖障礙和仔豬大量死亡[3]；2006年開始暴發(fā)流行PRRSV高致病株，所引起的疾病被稱為高致病性豬藍(lán)耳病，實(shí)際上就是高致病性PRRS，能夠侵害包括繁殖系統(tǒng)與呼吸系統(tǒng)在內(nèi)的多個(gè)器官系統(tǒng)，致死性顯著增加[3-4]；2012年出現(xiàn)PRRSV類NADC30毒株，主要侵害繁殖系統(tǒng)與呼吸系統(tǒng)，所引起疾病的嚴(yán)重性超過(guò)經(jīng)典株[5]。

現(xiàn)有資料顯示，當(dāng)前在中國(guó)傳播的美洲型PRRSV毒株中，高致病株的數(shù)量明顯多于經(jīng)典株，類NADC30株則在一些地區(qū)占優(yōu)勢(shì)，在臨床上還出現(xiàn)大量的重組變異毒株[6-7]。許多PRRSV重組變異毒株主要以高致病株為親本毒株，對(duì)豬的致死率明顯低于2010年以前分離到的JXA1株與HUN4株等典型的PRRSV高致病株，其主要危害是形成持續(xù)性感染、導(dǎo)致免疫抑制，嚴(yán)重影響生產(chǎn)性能[7-8]。PRRSV多種基因類型的存在及其重組變異株的不斷出現(xiàn)，給其疫苗防控帶來(lái)很大困難，故很有必要及時(shí)監(jiān)測(cè)PRRSV的流行與基因變異情況。該研究旨在分離一株近期流行的PRRSV毒株并解析其基因變異情況。

1 材料和方法

1.1 病料及細(xì)胞

高致病性PRRSV陽(yáng)性病料來(lái)源于山東青島一豬場(chǎng)，保存于北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物疫病研究室-40 ℃冰箱；非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞(Marc-145細(xì)胞)，可用于PRRSV的分離培養(yǎng)，保存于北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物疫病研究室-150 ℃冰箱。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、2×Phanta Max Master Mix為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；PRRSV-N蛋白抗體為北京奧博森有限公司產(chǎn)品；FITC-羊抗兔IgG為北京索萊寶有限公司產(chǎn)品。

1.3 病毒的分離培養(yǎng)

取高致病性PRRSV陽(yáng)性病料組織樣品1 g并剪碎，倒入10 mL研磨器中，加入5 mL 無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基和5 μL 的104U/mL青鏈霉素，充分研磨，凍融3次，12 000 r/min離心，收集上清并用0.22 μm濾器過(guò)濾。取1 mL上清接種Marc-145細(xì)胞，37 ℃吸附1 h，然后更換為含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，觀察有無(wú)細(xì)胞病變產(chǎn)生，并按照病毒常規(guī)傳代培養(yǎng)方法盲傳培養(yǎng)3代。同時(shí)，單獨(dú)培養(yǎng)沒(méi)有接種上清的Marc-145細(xì)胞作為模擬接種。

1.4 間接免疫熒光試驗(yàn)

用盲傳3代后出現(xiàn)細(xì)胞病變的培養(yǎng)物在Marc-145細(xì)胞上培養(yǎng)72 h；同時(shí)，單獨(dú)培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞作為模擬培養(yǎng)。之后，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，TritionX-100室溫穿透1 h，用6% BSA封閉1 h，加入1∶300稀釋的PRRSV-N蛋白抗體，4 ℃過(guò)夜，再用1∶300稀釋的FITC-羊抗兔IgG在37 ℃孵育30 min，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 病毒毒價(jià)測(cè)定

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Marc-145細(xì)胞數(shù)量調(diào)整至約為1×105個(gè)/mL，加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(100 μL/孔)，放置在含有5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，接種10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8稀釋度的病毒液(100 μL/孔)，每個(gè)稀釋度接種8孔，在含有5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算TCID50。

1.6 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank中PRRSV毒株JXA1株(登錄號(hào)為EF1124445)和07BJ株(登錄號(hào)為FJ393459)的全基因組序列設(shè)計(jì)PRRSV全基因組分段擴(kuò)增引物，引物序列及其擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。所有引物都由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列與產(chǎn)物大小Tab.1 Primer sequence and product size

1.7 病毒全基因組擴(kuò)增克隆與序列測(cè)定

收集細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次后取250 μL，按照RNA提取試劑說(shuō)明書提取病毒RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用PRRSV全基因組分段擴(kuò)增引物進(jìn)行分段RT-PCR擴(kuò)增。PCR體系為12.5 μL的2×Phanta Max Master Mix，10 pmol上游引物，10 pmol下游引物，5 μL病毒cDNA，總體積25 μL。PCR程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，循環(huán)40次；最后72 ℃ 10 min。回收擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物連接到T載體上轉(zhuǎn)化，放入LB培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用軟件將序列進(jìn)行拼接，對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行 BLAST比對(duì)。

1.8 病毒全基因組序列分析

使用Editseq、Megalign軟件進(jìn)行序列拼接和遺傳變異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離與鑒定

將高致病性PRRSV陽(yáng)性病料組織樣品處理后接種到Marc-145 細(xì)胞上，傳代培養(yǎng)3次后，可穩(wěn)定產(chǎn)生細(xì)胞病變。在接種后72 h可見細(xì)胞變圓、輪廓模糊不清、細(xì)胞聚集甚至脫落，而模擬接種的對(duì)照細(xì)胞未見有明顯的病變(圖1)，說(shuō)明這個(gè)分離培養(yǎng)物中存在能夠引起Marc-145細(xì)胞產(chǎn)生病變的病原。

使用PRRSV-N蛋白的單克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，感染病毒的細(xì)胞在胞漿內(nèi)出現(xiàn)特異性熒光，而模擬培養(yǎng)的細(xì)胞未見有特異性熒光(圖2)，說(shuō)明所分離到的病毒為PRRSV。之后通過(guò)觀察細(xì)胞病變測(cè)定出其毒價(jià)為104.9TCID50/mL。

2.2 病毒全基因組擴(kuò)增與序列鑒定

使用表1中的引物對(duì)目的基因進(jìn)行分段擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。目的條帶與預(yù)期片段大小一致。經(jīng)克隆與序列測(cè)定后，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到一株P(guān)RRSV毒株的全基因組序列，大小15 323個(gè)核苷酸，在非結(jié)構(gòu)蛋白2基因有30個(gè)氨基酸缺失的典型標(biāo)記。Blast比對(duì)顯示，所分離的PRRSV毒株的全基因組序列與美洲型PRRSV毒株SD-CXA/2008株的相似性極高，達(dá)到99.17%，此次分離出的毒株屬于美洲型PRRSV毒株，并將其命名為SDqd-2020。

注：A是樣品培養(yǎng)；B是模擬培養(yǎng)。Note: A is sample-culture; B is mock culture.圖2 分離培養(yǎng)物的間接免疫熒光鑒定Fig.2 IFA identification of the isolated culture

注：M是Marker；1-6是不同片段。Note: M is Marker; 1-6 is different fragment.圖3 分段RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 The segmented RT-PCR amplification products

2.3 病毒全基因組序列分析結(jié)果

選取國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)的PRRSV基因類型參考毒株的全基因組序列，與分離株SDqd-2020進(jìn)行核苷酸同源性比較分析(圖4)。SDqd-2020株與參與比對(duì)的其他PRRSV毒株全基因組之間的核苷酸同源性介于59.9%～99.2%之間，其中與歐洲型毒株Lylestad株的核苷酸同源性僅有60.2%，與類NADC30毒株HNjz株[9]的核苷酸同源性為83.4%，與美洲型經(jīng)典毒株VR2332株和CH1a株的核苷酸同源性分別為89.2%和94.9%，與美洲型高致病性毒株JXA1株和HUN4株的核苷酸同源性分別為98.9%和99.1%，與美洲型高致病性毒株SD-CXA/2008株[10]的核苷酸同源性最高、達(dá)到99.2%，因此其更可能屬于美洲型高致病性毒株。

從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)來(lái)看，SDqd-2020株與美洲型高致病性PRRSV毒株SD-CXA/2008株[10]完全處于同一分支上，與JXA1株、HUN4株等美洲型高致病性PRRSV毒株處在最近的不同分支上，與VR2332株和CH-1a株等美洲型經(jīng)典株處在相對(duì)較遠(yuǎn)的不同分支上，與HNjz株等類NADC30毒株處在相對(duì)更遠(yuǎn)的不同分支上，與Lelystad株等歐洲型毒株則處在最遠(yuǎn)的不同分支上。SDqd-2020毒株屬于典型的高致病性PRRSV毒株。

圖4 PRRSV毒株全基因組核苷酸同源性比較Fig.4 Comparison of nucleotide homology for PRRSV complete genome

圖5 PRRSV毒株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of PRRSV strains

3 討 論

PRRSV是當(dāng)前一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的RNA病毒，由于病毒的RNA依賴性RNA聚合酶缺乏校對(duì)功能，在復(fù)制過(guò)程中病毒基因組序列容易發(fā)生插入、缺失、突變及重組，從而產(chǎn)生大量變異毒株和重組毒株，不僅造成PRRSV具有多種基因類型或譜系，也造成不同的PRRSV毒株在致病性方面的差異[11-12]。由于當(dāng)前的PRRSV疫苗的免疫保護(hù)效果并不理想，臨床上PRRSV毒株的遺傳多樣性加重了PRRS防控的難度。必須經(jīng)常對(duì)臨床中的PRRSV毒株基因組遺傳變異信息進(jìn)行監(jiān)控。

該研究以臨床疑似PRRS病例的陽(yáng)性病料組織樣品為材料，分離培養(yǎng)出一株P(guān)RRSV毒株，將其命名為SDqd-2020株，并擴(kuò)增獲得其全基因組序列，發(fā)現(xiàn)在其非結(jié)構(gòu)蛋白2基因上存在高致病性毒株具有的30個(gè)氨基酸缺失的典型標(biāo)記。SDqd-2020株與不同的PRRSV基因類型典型參考毒株比較，從全基因組核苷酸同源性來(lái)看，從低到高依次是歐洲型毒株Lylestad株、美洲型類NADC30毒株HNjz株、美洲型經(jīng)典毒株VR2332株和CH1a株、美洲型高致病性毒株JXA1株與HUN4株及SD-CXA/2008株(分別為60.2%、83.4%、89.2%和94.9%、98.9%與99.1%及99.2%)；從遺傳進(jìn)化樹上的分支來(lái)看，從遠(yuǎn)到近依次是歐洲型毒株Lylestad株、美洲型類NADC30毒株HNjz株、美洲型經(jīng)典毒株VR2332株、美洲型經(jīng)典毒株CH1a株、美洲型高致病性毒株JXA1株、美洲型高致病性毒株HUN4株、美洲型高致病性毒株SD-CXA/2008株。全基因組核苷酸同源性結(jié)果與遺傳進(jìn)化樹分支結(jié)果完全一致，表明SDqd-2020株屬于典型的高致病性PRRSV毒株。

雖然近期流行的PRRSV毒株大多數(shù)屬于以PRRSV高致病性毒株和/或類NADC30毒株為親本的重組變異毒株[11-14]，但仍然分離到了一株典型的高致病性毒株，提示經(jīng)常性監(jiān)測(cè)PRRSV的流行與基因變異情況具有重要的臨床價(jià)值，其致病性值得進(jìn)一步研究分析。