劉羽豐，徐晨曦，吳 澤，楊愛珍，任俊達(dá)*，尚巧霞*

(1.北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.北京市海淀區(qū)圓明園管理處，北京 100084)

煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)屬帚狀病毒科(Vigaviridae)煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，病毒粒子為桿狀，大小為18 nm×300 nm。TMV病毒粒子異常穩(wěn)定，其侵染性能保持?jǐn)?shù)十年，可以通過機(jī)械接種傳播[1]。該病毒寄主范圍較廣泛，在茄科植物中較常見，最容易為害煙草和番茄，此外，還能侵染400 余種植物，引起重要病害[2]。TMV的核酸為+ssRNA，全長6 395 nt左右，編碼4種蛋白：126 kDa和183 kDa復(fù)制酶蛋白、30 kDa細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)蛋白(MP)和17.5 kDa外殼蛋白(CP)[3-4]。其中，TMV的126 kDa蛋白可以抑制寄主植物的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)[5]；TMV外殼蛋白與癥狀的誘導(dǎo)和病毒粒子的長距離移動(dòng)有關(guān)[6]。研究表明，TMV有很多株系，沒有統(tǒng)一的劃分標(biāo)準(zhǔn)，各劃分間也存在地理隔離[7]。例如世界上的TMV可分為4個(gè)類群，而中國的TMV株系則有很多[1,8]。防治TMV所致植物病害主要依靠抗病品種和無毒健苗。

近年來，血清學(xué)和RT-PCR方法被廣泛應(yīng)用于TMV的檢測[9-10]。中國對(duì)園林植物在滯塵能力、重金屬含量和緩解城市“熱島效應(yīng)”等方面研究較多[11-13]，對(duì)TMV在園林植物中的發(fā)生情況等研究較少。該研究用間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、RT-PCR方法和序列測定分析技術(shù)檢測北京市昌平地區(qū)園林植物，明確北京園林植物TMV的發(fā)生情況，為園林植物病毒病的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2020年12月9日從北京市昌平地區(qū)北京農(nóng)學(xué)院(116°32′E，40°10′N)的園林植物中采集有類似病毒癥狀的不同種類葉片共8種植物樣品，分別為大葉黃楊(Buxussp.)、早熟禾(Poasp.)、棣棠花(Kerriasp.)、鳶尾(Irissp.)、月季(Rosasp.)、桃樹(Amygdalussp.)、海棠(Malussp.)和女貞(Ligustrumsp.)。大葉黃楊和海棠的葉片癥狀是壞死斑，早熟禾、棣棠花和鳶尾的葉片癥狀是花葉，月季、桃樹和女貞的葉片癥狀是斑駁。

1.2 主要試劑

煙草花葉病毒抗血清由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)；酶標(biāo)羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；EASYspin植物RNA快速提取試劑盒、PCR Mix、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；dNTPs、5×M-MLV逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RRI抑制劑購自Takara 公司。

1.3 間接ELISA檢測

設(shè)有4種樣品：植物樣品為采集的北京市昌平地區(qū)8種園林植物有類似病毒癥狀的葉片、空白樣品為包被緩沖液樣品(NaHCO32.93 g，Na2CO31.59 g，加蒸餾水至1 000 mL)、陰性對(duì)照為已知的無病毒健康煙草樣品、陽性對(duì)照為已知的帶煙草花葉病毒的煙草樣品，每種樣品重復(fù) 3 次。

稱取待測植物樣品放入裝有鋼珠的2 mL離心管，經(jīng)液氮充分研磨后，加20倍體積的包被緩沖液，4 ℃ 下11 000 r/min 5 min。在酶聯(lián)板上加入上清液，37 ℃培養(yǎng)2～3 h。清除酶聯(lián)板上的溶液，用裝有洗滌緩沖液的洗滌瓶沖洗3次，每次靜置3 min，清除酶聯(lián)板的水分。加入稀釋 4 000 倍的TMV抗血清，37 ℃培養(yǎng) 2～3 h；洗滌3次。加入稀釋5 000倍的酶標(biāo)羊抗兔IgG緩沖液，37 ℃培養(yǎng)2～3 h；洗滌3次。配置底物溶液，加入酶聯(lián)板中，室溫培養(yǎng)1 h顯色。根據(jù)顏色深淺，記錄結(jié)果。

1.4 RT-PCR檢測

1.4.1 植物總RNA提取 使用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒，稱取100 mg植物樣品于2 mL離心管中，加鋼珠放入液氮中，充分冷卻后用混合研磨儀進(jìn)行震蕩研磨，重復(fù)2次至細(xì)粉狀。加500 μL裂解液和50 μL植物RNA助提劑于離心管中，快速振蕩；56 ℃水浴3 min，13 000 r/min 10 min。取400 μL上清與200 μL無水乙醇混合，13 000 r/min 2 min，棄廢液。加700 μL去蛋白液，室溫靜置1 min，13 000 r/min 30 s，棄廢液。加500 μL漂洗液，13 000 r/min 30 s，棄廢液；重復(fù) 1 遍；取吸附柱置于空收集管中，13 000 r/min 2 min。取吸附柱放入1.5 mL離心管中，加35 μL無酶水，室溫靜置2 min，12 000 r/min 1 min，獲得總RNA。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 以1.5 μL提取的總RNA為模板，加入隨機(jī)上游引物和下游引物各 0.5 μL、dNTP 2 μL，用DEPC水將體系補(bǔ)至 15.5 μL。65 ℃水浴 5 min，冰浴 5 min。加5×M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液 4 μL、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和 RRI 抑制劑各0.5 μL。42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min。合成的cDNA 于-20 ℃保存。

1.4.3 PCR擴(kuò)增、克隆與測序 參照孫曉輝等[14]設(shè)計(jì)的檢測引物TMV F和TMV R。TMV F序列為 5′-GCCGACCCAATAGAGTTA-3′，TMV R序列為5′-GAGGTCCAAACTAAACCAGAAG-3′。

以2 μL cDNA為模板，加入上游引物和下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為 94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，退火50 ℃ 40 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，目的片段長度為410 bp。

1.5 序列測定與分析

使用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒回收RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到pBM-23克隆載體，送交北京博邁德基因公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果與NCBI已報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA 7.0軟件的最大似然法(Maximum Likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 間接ELISA檢測結(jié)果

北京市昌平地區(qū)8種園林植物樣品的間接ELISA檢測結(jié)果顯示，桃樹(Amygdalussp.)和海棠(Malussp.)樣品含有TMV，大葉黃楊(Buxussp.)、早熟禾(Poasp.)、棣棠花(Kerriasp.)、鳶尾(Irissp.)、月季(Rosasp.)和女貞(Ligustrumsp.)樣品不含TMV。

2.2 RT-PCR結(jié)果

使用引物TMV F/R對(duì)采集的8種園林植物樣品進(jìn)行PCR檢測，在桃樹(Amygdalussp.)和海棠(Malussp.)樣品中擴(kuò)增到410 bp的片段，為部分外殼蛋白基因，與預(yù)期大小相符(圖1)。

注：M是DNA Marker AL2000+；1—8 是大葉黃楊、早熟禾、棣棠花、鳶尾、月季、桃樹、海棠和女貞；9是陽性對(duì)照；10是陰性對(duì)照。Note: M is DNA Marker AL2000+; 1-8 is Buxus sp., Poa sp., Kerria sp., Iris sp., Rosa sp., Amygdalus sp., Malus sp. and Ligustrum sp.; 9 is positive control; 10 is negative control.圖1 北京市昌平地區(qū)園林植物TMV的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.1 RT-PCR results of TMV in garden plants in Changping district, Beijing

2.3 TMV分離物的序列分析

將含有目的片段的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，獲得中國煙草花葉病毒桃樹分離物TMV-Bjts和中國煙草花葉病毒海棠分離物TMV-Bjht。獲得的2個(gè)TMV分離物的核苷酸序列同源性為98.54%。使用NCBI進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)分析，中國煙草花葉病毒桃樹分離物TMV-Bjts與中國煙草花葉病毒丁香分離物TMV-S[15](GenBank登錄號(hào)：AY566702.1)的同源性為99.51%，中國煙草花葉病毒海棠分離物 TMV-Bjht與中國煙草花葉病毒丁香分離物TMV-S (GenBank登錄號(hào)：AY566702.1)的同源性為99.02%。

分析引用的TMV分離物序列號(hào)和來源見表1，基于外殼蛋白基因核苷酸序列的TMV分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。選取TMV模式種序列、中國地區(qū)來自不同寄主的16條TMV分離物序列和該研究獲得的2個(gè)TMV分離物序列，并以蕃茄花葉病毒(tomato mosaic virus，ToMV)(GenBank 登錄號(hào)：AF332868.1)作為組外病毒對(duì)照，用Maximum Likelihood法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。中國煙草花葉病毒桃樹分離物TMV-Bjts和中國煙草花葉病毒海棠分離物TMV-Bjht都與中國煙草花葉病毒丁香分離物TMV-S親緣關(guān)系較近，歸屬于組2。

表1 分析引用的TMV分離物序列號(hào)和來源

圖2 基于外殼蛋白基因核苷酸序列的TMV分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of TMV isolates based on the nucleotide sequence of coat protein gene

3 討 論

煙草花葉病毒危害嚴(yán)重，侵染植物后葉片呈花葉和壞死斑，并且能與其他病毒復(fù)合侵染進(jìn)一步加重植株的癥狀[16-17]。同時(shí)，TMV也能侵染園林植物，影響其觀賞價(jià)值和綠化效果。該研究采集的8種園林植物中，鳶尾(Irissp.)、月季(Rosasp.)、桃樹(Amygdalussp.)和海棠(Malussp.)病毒病的相關(guān)研究不多[18-21]，而北京市還沒有鳶尾(Irissp.)和海棠(Malussp.)病毒病的相關(guān)報(bào)道。此外，大葉黃楊(Buxussp.)、棣棠花(Kerriasp.)和女貞(Ligustrumsp.)在中國更鮮有相關(guān)病毒病的記錄。

目前，RT-PCR方法除能檢測病毒外，也能根據(jù)核苷酸序列檢測分析給相關(guān)的病毒分離物劃分株系[22]。該研究使用間接ELISA和RT-PCR方法對(duì)北京市昌平地區(qū)園林植物進(jìn)行TMV的檢測，在桃樹和海棠中獲得陽性樣品。TMV寄主范圍雖廣，中國未見TMV侵染薔薇科蘋果屬海棠的報(bào)道，少見TMV侵染薔薇科桃屬的報(bào)道[23]。

將TMV不同分離物的CP核苷酸序列與中國報(bào)道的TMV分離物序列進(jìn)行分析比對(duì)，中國煙草花葉病毒桃樹分離物TMV-Bjts和中國煙草花葉病毒海棠分離物 TMV-Bjht都?xì)w屬TMV組2。該研究檢測的樣品種類有限，今后應(yīng)該擴(kuò)大檢測地區(qū)，增加檢測樣品的數(shù)量，進(jìn)一步明確中國園林植物TMV的發(fā)生情況。