鄧旭坤，戴晨曦，段歡，劉釗，阿爾斯拉·玉蘇甫，舒廣文*

（1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院& 民族藥學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，武漢 430074；2 中南民族大學(xué) 學(xué)報編輯部，武漢 430074）

對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP），又稱撲熱息痛，是國內(nèi)、外常用的非甾體抗炎止痛藥，廣泛用于感冒、疼痛、發(fā)熱病癥的治療［1］.目前市場上已知的暢銷感冒藥物，如快克、泰諾、白加黑等的主要成分均為APAP，而這些感冒藥大多為OCT 藥物由患者自行購買或使用.臨床報道顯示：由于患者用藥知識的匱乏，超劑量或者同時服用多種主含成分相近的感冒藥，會引起APAP 攝入過量而導(dǎo)致嚴(yán)重的藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）.目前臨床上治療APAP 肝損傷的有效藥物和措施不多［2］.因此，尋找理想的解決APAP 超劑量服用所致的肝損傷是一個亟待解決的問題.

竹節(jié)參（Panax japonicusC.A.Mey.）是五加科人參屬多年生植物，由于其同時具有人參補(bǔ)氣和三七補(bǔ)血的功效，素有“草藥之王”的稱號［3］.竹節(jié)參主要含有多糖和皂苷兩大活性成分，前期的研究發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參多糖具有增強(qiáng)小鼠抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力［4］，同時竹節(jié)參總皂苷（total saponins fromPanax japonicusC.A.Mey.，PJST）可改善乙醇誘導(dǎo)的小鼠肝損傷［5］，還對高脂飼料誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化也有抑制作用［6］.但PJST在干預(yù)APAP誘導(dǎo)的肝損傷方面的研究和報道較少，故本文從體內(nèi)和體外研究PJST 干預(yù)APAP引起急性肝損傷的作用及其潛在的分子機(jī)制.

1 材料

1.1 藥物

竹節(jié)參采集于湖北恩施土家族自治州，經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院萬定榮教授鑒定，為五加科人參屬植物竹節(jié)參，憑證標(biāo)本（NO. SC-2012054）現(xiàn)保存在中南民族大學(xué)藥學(xué)院.竹節(jié)參總皂苷（PJST）的提取制備按照參考文獻(xiàn)［7］進(jìn)行，1 kg的竹節(jié)參根莖獲得約130 g的PJST.

1.2 動物

SPF級昆明種小鼠（雌雄各半，6～8周齡，18～22 g）40 只，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，許可證號為SCXK（鄂）：2016-0089.在本文中，動物實(shí)驗(yàn)管理的相關(guān)方案均已通過中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會（批準(zhǔn)號：2018-SCUEC-AEC-014）的審批.

1.3 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

人HepG2 肝癌細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)），使用DMEM 培養(yǎng)基（含有10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素）于培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）中常規(guī)培養(yǎng).

1.4 藥品與試劑

人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷V、竹節(jié)參皂苷Ⅳ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa 的標(biāo)準(zhǔn)品購自成都普瑞法科技公司；對乙酰氨基酚（APAP）購自上海源葉生物科技公司；胎牛血清（FBS）購自武漢普諾賽生物公司；DMEM、甲基噻唑基四唑（MTT）購自美國Hyclone公司.

肝功能檢測試劑盒丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）購自南京建成生物技術(shù)研究所；炎癥因子ELISA 試劑盒白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）購自武漢愛博泰克生物科技公司；核纖層蛋白B（Lamin B）、核因子B 亞基p65 親和肽（NF-κB p65）、Ser276 位磷酸化核因子B 亞基p65 親和肽（P-NF-κB p65）、HPR 標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）購自武漢三鷹生物科技公司；BCL2-Associated X（Bax）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、β-Actin、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（BeyoECL Plus）；Hoechst 33258 熒光染料、DAPI 染色液（DAPI dihydrochloride，staining solution）和TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測（一步法）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司.

2 方法

2.1 竹節(jié)參總皂苷提取物的主要成分分析

參考文獻(xiàn)［8］中的方法，對竹節(jié)參總皂苷進(jìn)行成分和含量的分析.

色譜條件：Agilent C18柱（4.6 cm×25 cm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～5 min，5%～5%A；5～20 min，5%～30%A；20～30 min，30%～30% A；30～50 min，30%～85% A；50～60 min，85%～85% A；流速1.0 mL·min-1；檢測波長203 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL.

2.2 竹節(jié)參總皂苷對APAP 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用

取對數(shù)生長期細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同劑量的PJST（終濃度為30 μg·mL-1，100 μg·mL-1）孵育24 h.再加入APAP（終濃度為10 mmol·L-1）孵育24 h.在倒置顯微鏡下，觀察并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，采用MTT 法檢測細(xì)胞活力［9］，Hoechst 33258 熒光染色法對HepG2細(xì)胞的凋亡形態(tài)進(jìn)行研究.

2.3 動物實(shí)驗(yàn)及生化指標(biāo)檢測

取6～8周齡昆明種小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白組、模型組、PJST低、高劑量組（50、100 mg·kg-1）.各組小鼠灌胃給藥（空白組和模型組給予0.9%NaCl 溶液，給藥組給予對應(yīng)劑量的PJST），每天1 次，連續(xù)7 d.末次給藥2 h 后，除空白組外每組小鼠腹腔均注射APAP溶液（400 mg·kg-1），12 h后將小鼠摘眼球取血于離心管，室溫放置30 min后，離心（3000 r·min-1）15 min，吸取上清液按試劑盒說明書規(guī)定的操作方法，測定小鼠血清中ALT、AST 及LDH 的含量.然后采取頸椎脫臼法處死小鼠，取部分肝小葉組織于4%甲醛溶液中固定用于免疫組化，剩余組織立即放入-80 ℃冰箱保存用于后續(xù)指標(biāo)測定，用ELISA試劑盒測定肝組織中IL-1β、IL-6及TNF-β的含量.

2.4 組織病理學(xué)分析，細(xì)胞凋亡染色和免疫組化染色

將甲醛固定后的肝組織包埋在石蠟中制成蠟塊并切成5 μm 厚的切片.按照參考文獻(xiàn)［10］，對組織切片進(jìn)行HE 染色、Hoechst 33258 染色和免疫組化染色.TUNAL 的染色根據(jù)試劑盒說明書的指示進(jìn)行.

2.5 細(xì)胞核蛋白抽提

使用細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒提取細(xì)胞核蛋白.首先使用細(xì)胞漿蛋白抽提試劑，在低滲透壓條件下，細(xì)胞漲破釋放細(xì)胞漿蛋白，后離心得到細(xì)胞核沉淀.最后通過高鹽的細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提得到細(xì)胞核蛋白.

2.6 Western-blot分析

取上述冷凍的肝臟組織適量和抽提的細(xì)胞核蛋白，參考文獻(xiàn)［11］中的方法進(jìn)行免疫印跡的檢測和分析.

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示.使用GraphPad Prism 6.0，通過單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；采取Image-Pro plus 6.0 對Western-bolt 圖像的灰度值進(jìn)行對比分析，P＜0.05 說明組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3 結(jié)果

3.1 竹節(jié)參總皂苷提取物的成分分析

采取峰面積歸一化法計(jì)算出竹節(jié)參總皂苷提取物中各個皂苷成分的相對含量，如圖1所示，竹節(jié)參總皂苷中主要含有一下幾個主要成分：人參皂苷Re、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷V、竹節(jié)參皂苷Ⅳ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa，其相對含量分別為87.3、77.2、441.0、227.1、75.0 μg·mg-1.

圖1 竹節(jié)參總皂苷的成分分析（HPLC法）Fig.1 Component Analysis of PJST（HPLC）

3.2 PJST對APAP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡的影響

形態(tài)學(xué)分析和MTT 細(xì)胞活力試驗(yàn)顯示（圖2（a）、圖2（b））PJST 改善了APAP 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞死亡（P＜0.01）.此外如圖2（c）、圖2（d）所示，Hoechst 33258染色試驗(yàn)表明APAP 10 mmol·L-1時，HepG2細(xì)胞顯示出明顯的核固縮、邊集、核碎裂的細(xì)胞凋亡形態(tài)，而PJST 的預(yù)保護(hù)給藥抑制了APAP 引起的HepG2 細(xì)胞凋亡.這些結(jié)果表明，PJST 能夠緩解APAP對HepG2細(xì)胞的毒性作用.

圖2 PJST對APAP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of PJST on APAP-induced Apoptosis of HepG2 cells

3.3 PJST對APAP誘導(dǎo)小鼠肝毒性的影響

小鼠血清中的ALT、AST和LDH能直接反映小鼠的肝損傷程度.如圖3（a）、圖3（b）和圖3（c）所示，注射APAP后血清ALT、AST和LDH顯著升高，而PJST可以顯著地減輕這些異常（P＜0.01）.此外，APAP破壞了正常的肝組織，病理學(xué)分析顯示模型組小鼠肝臟出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤以及出血的情況，而這些炎癥被PJST所改善（圖3（d））.APAP攝入過量同時也會引起肝細(xì)胞的大量凋亡性死亡，如圖3（e）、圖3（f）所示，Hoechst 33258的小鼠肝臟染色結(jié)果與HepG2細(xì)胞染色結(jié)果相對應(yīng)，模型組小鼠中的肝細(xì)胞也顯示出明顯的核固縮、邊集、核碎裂的細(xì)胞凋亡形態(tài)，而PJST給藥組小鼠的肝細(xì)胞凋亡情況得到了改善；TUNAL染色作為檢測細(xì)胞凋亡的經(jīng)典方法，TUNAL 染色法的結(jié)果（圖3（g）、圖3（h））也進(jìn)一步證明了PJST可以預(yù)防和保護(hù)APAP誘導(dǎo)小鼠的肝毒性.

圖3 PJST對APAP誘導(dǎo)小鼠肝毒性的影響Fig.3 Effect of PJST on APAP-induced hepatotoxicity in mice

3.4 PJST對APAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝細(xì)胞中Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

Bax 和Bcl-2 的表達(dá)是細(xì)胞發(fā)生凋亡程度的指標(biāo)之一，本文采用Western blot 和免疫組化的方法檢測了Bax 和Bcl-2 在各組小鼠肝組織中表達(dá)的差異情況，結(jié)果見圖4（a）、圖4（b），圖中顯示模型組小鼠肝臟細(xì)胞中Bax 的表達(dá)明顯高于空白組小鼠，而PJST的預(yù)處理組小鼠肝組織中Bax的表達(dá)顯著低于模型組.Bcl-2 的結(jié)果與之相反，在模型組小鼠肝細(xì)胞中，Bcl-2 的表達(dá)顯著降低，而在PJST 給藥保護(hù)組中，Bcl-2 的表達(dá)被恢復(fù)；免疫組化染色的結(jié)果更加直觀的驗(yàn)證了以上現(xiàn)象（如圖4（c）、圖4（d））.以上結(jié)果充分說明APAP 會提高小鼠肝臟組織當(dāng)中Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2 的表達(dá)而引起肝細(xì)胞的凋亡，經(jīng)過PJST 的預(yù)保護(hù)，可以阻止這一現(xiàn)象的發(fā)生，起到肝保護(hù)作用.

圖4 PJST對APAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of PJST on the expression of Bax and Bcl-2 protein in APAP-induced liver injury mice

3.5 PJST 對APAP 誘導(dǎo)肝損傷小鼠炎癥反應(yīng)的影響

APAP 誘導(dǎo)的急性肝損傷會引起肝內(nèi)炎癥并影響肝組織中炎癥因子的產(chǎn)生與釋放.如圖5（a）、圖5（b）、圖5（c）所示，模型組小鼠肝組織中炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平較空白組相比出現(xiàn)顯著上調(diào)的情況（P＜0.01），而PJST 預(yù)保護(hù)組小鼠肝臟內(nèi)的TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平被顯著抑制了（P＜0.05 或P＜0.01）. Western-blot 檢測了肝組織中P-NF-κB p65 和核內(nèi)NF-κB p65 蛋白的表達(dá)水平結(jié)果見圖5（d）和圖5（e），可見在模型組小鼠肝組織中，P-NF-κB p65 以及細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65 的表達(dá)水平較空白組顯著增加（P＜0.01），而PJST 可以顯著下調(diào)P-NF-κB p65 和核內(nèi)NF-κB p65 的表達(dá)水平（P＜0.01）.以上結(jié)果說明APAP 可以通過促進(jìn)肝組織內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的產(chǎn)生與釋放，并上調(diào)肝組織細(xì)胞P-NF-κB p65 及核內(nèi)NFκB p65 的表達(dá)水平，而引發(fā)小鼠肝臟的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生肝損傷.PJST 通過對抗APAP 的上述作用，而有效緩解其誘導(dǎo)小鼠的肝臟炎癥反應(yīng)而發(fā)揮肝保護(hù)作用.

圖5 PJST對APAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠炎癥反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of PJST on inflammatory response in APAP-induced liver injury mice

4 討論

過量服用APAP 會產(chǎn)生大量的APAP 代謝產(chǎn)物N-乙酰-P-苯醌亞胺（NAPQI），該產(chǎn)物會在耗竭肝臟中的谷胱甘肽（GSH）后與細(xì)胞生物大分子反應(yīng)并形成共價鍵，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷，炎癥以及細(xì)胞凋亡的發(fā)生［12］.近年來，從植物來源的天然產(chǎn)物中尋找潛在的治療肝損傷的藥物的研究日益成為熱點(diǎn)方向.竹節(jié)參因其較高的藥用價值而逐漸成為藥用植物學(xué)家研究的關(guān)注對象，作為其主要活性成分竹節(jié)參皂苷具有較高的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗氧化的活性［13-14］.在此基礎(chǔ)之上，本文構(gòu)建了APAP 誘導(dǎo)的肝損傷模型，以評估竹節(jié)參總皂苷的保肝護(hù)肝作用及其可能機(jī)制.

血清中ALT、AST 和LDH 水平是評價動物肝功能的經(jīng)典指標(biāo)［15］.本文中APAP 引起了小鼠血清中ALT、AST和LDH水平的顯著增加，PJST的預(yù)處理能顯著抑制APAP 誘導(dǎo)的上述肝功能指標(biāo)的異常升高.組織病理學(xué)的結(jié)果也進(jìn)一步說明在組織形態(tài)學(xué)方面PJST發(fā)揮了良好的保護(hù)作用.

肝細(xì)胞凋亡在APAP 肝損傷模型中起著重要作用，病理情況下的肝細(xì)胞凋亡會加速肝臟衰竭.Hoechst 33258 熒光染色和TUNEL 法是常見的細(xì)胞凋亡檢測方法.Bcl-2 家族是一類調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，成員眾多，其中Bax 是一種促凋亡蛋白，通過誘導(dǎo)線粒體膜透化并釋放細(xì)胞色素c 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而Bcl-2 具有明顯抑制細(xì)胞凋亡的作用，可增強(qiáng)肝細(xì)胞對大多數(shù)DNA 損傷因子的抵抗性［16］.在APAP 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)和APAP 誘導(dǎo)的小鼠肝損傷實(shí)驗(yàn)中均出現(xiàn)凋亡情況.同時，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠肝組織中Bax的表達(dá)上調(diào)而抗Bcl-2的表達(dá)受到抑制，以上情況顯示APAP 誘導(dǎo)的肝損傷啟動了肝細(xì)胞的凋亡性死亡.而PJST 的預(yù)處理組細(xì)胞凋亡明顯減少，Bax的異常表達(dá)被抑制，Bcl-2的表達(dá)也恢復(fù)到了正常水平，由此證明PJST的預(yù)保護(hù)可以有效預(yù)防APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡.

APAP 誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)的線粒體損傷，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物（如核蛋白、核DNA 片段、ATP、尿酸等）的釋放［17］.這些損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的存在可能通過toll 樣受體激活NF-κB p65.NF-κB p65 信號通路的傳導(dǎo)會增強(qiáng)一系列促炎細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1 和IL-6）的表達(dá)，而這些炎癥因子反過來又會加劇APAP 誘導(dǎo)的肝損傷造成惡性循環(huán)［18］.本研究結(jié)果顯示，APAP模型組中這些炎性細(xì)胞因子的表達(dá)顯著高于空白組，上調(diào)P-NF-κB p65，并且促進(jìn)NF-κB p65的入核，而PJST 預(yù)保護(hù)組不僅抑制了上述炎癥因子的上調(diào)，也下調(diào)了NF-κB p65 的磷酸化水平和NF-κB p65 的核內(nèi)表達(dá).以上結(jié)果表明PJST 可能通過抑制肝臟內(nèi)的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生了對APAP 誘導(dǎo)肝損傷的干預(yù)效果.

本文結(jié)果表明：PJST 可以通過減少肝細(xì)胞的凋亡和炎癥來抵抗APAP 誘導(dǎo)的肝損傷.PJST 通過降低肝組織中Bax 的表達(dá)并上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)作為抗凋亡的保護(hù)機(jī)制；同時，PJST 還通過抑制NF-κB p65的磷酸化和入核，降低肝組織中炎癥因子的表達(dá)水平作為抗炎的保護(hù)機(jī)制.綜上，PJST 可能是通過抑制凋亡和抗炎作用發(fā)揮干預(yù)APAP DILI 的作用，這為竹節(jié)參皂苷在抗APAP DILI的藥物研發(fā)和應(yīng)用中提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù).