王獻(xiàn)，覃曉夏，劉吉開

（中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074）

白芨為蘭科植物白芨（Bletilla sfriata）的泥土下的塊莖，又名白及，具收斂止血、消腫生肌等功效，有保護(hù)黏膜、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗?jié)兊人幚碜饔茫?-2］. 白芨不僅具有很高的藥用價(jià)值，在日用品上（如化妝品、紡織印染等）也廣泛應(yīng)用［3-4］. 內(nèi)生真菌對(duì)于植物生長(zhǎng)具有重要的影響，如促進(jìn)種子萌發(fā)、提高植物在惡劣環(huán)境的適應(yīng)力等［5-7］. 同時(shí)部分內(nèi)生菌也可以產(chǎn)生與宿主植物類似的次生代謝物，是新化合物、新藥源的潛在資源［8-9］. 本課題組在研究白芨內(nèi)生真菌多樣性的基礎(chǔ)上，選取一株優(yōu)勢(shì)白芨內(nèi)生真菌強(qiáng)壯土赤殼菌Ilyonectria robusta（I.robusta）對(duì)其固體發(fā)酵的化學(xué)成分進(jìn)行了初步研究.

強(qiáng)壯土赤殼菌I.robusta廣泛分布在木本、草本植物的根以及土壤中，屬于植物內(nèi)生真菌或弱寄生真菌［10］.經(jīng)過(guò)固體培養(yǎng)發(fā)酵、甲醇提取、乙酸乙酯萃取、反復(fù)柱色譜層析、高效液相制備后從該菌發(fā)酵提取物中分離得到6 個(gè)化合物（圖1）.化合物1 和2為兩個(gè)新的化合物，并通過(guò)一維、二維核磁共振、高分辨質(zhì)譜、紅外、紫外以及多種波譜手段來(lái)確定其結(jié) 構(gòu) 為butyl（（S）-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl）-Dleucinate（1）、butyl（（S）-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl）-Dphenylalaninate（2）. 通過(guò)波譜學(xué)數(shù)據(jù)及理化性質(zhì)確定其他已知化合分別為 4-hydroxy-17Rmethylincistero（3）、polyporenic acid C（4）、4-（9H-β-Carbolin-1-yl）-4-oxobut-2-enoic acid methyl ester（5）和perlolyrine（6）.對(duì)新化合物1和2進(jìn)行了抑制人體腫瘤細(xì)胞MCF-7的活性評(píng)估.此文報(bào)道了化合物1～6的分離、結(jié)構(gòu)鑒定以及細(xì)胞毒活性.

圖1 化合物1～6和L-pGlu-Leu的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of compounds 1-6 and L-pGlu-Leu

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品、試劑和儀器

白芨內(nèi)生真菌強(qiáng)壯土赤殼菌（Ilyonectria robusta）從采于湖北省恩施州的白芨根中分離得到.菌種鑒定：采用ITS 基因序列法擴(kuò)增ITS 序列，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，與NCBI 已知序列對(duì)比，鑒定為Ilyonectria robusta.

Isolera one 中壓制備系統(tǒng)（瑞典Biotage）；1200/1260 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent）；500/600 MHz核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker）；HCT/Esquire 質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker）；Spark10M酶標(biāo)儀（瑞士TECAN）.

薄層層析硅膠板GF254和柱層析硅膠（80～100目以及200～300 目）均購(gòu)自中國(guó)青島海洋化工廠；Sephadex LH-20 凝膠（瑞士Amersham biosciences）；液相色譜柱為ZORBAX SB-C18 柱（美國(guó)Agilent；分析型：4.6 mm × 150 mm；制備型：9.4 mm × 150 mm；徑粒均為5μm）；顯色劑為含香草醛的5%硫酸溶液；LB 固體/液體培養(yǎng)基干粉（北京Solarbio Science&Technology）.

1.2 白芨內(nèi)生真菌Ilyonectria robusta的培養(yǎng)

采用固體發(fā)酵方法，大米80 g，加水100 mL，置于300 mL 種子罐中，于121 ℃滅菌鍋滅菌120 min，共培養(yǎng)135 瓶，培養(yǎng)條件：恒溫24 ℃；靜置，暗培養(yǎng)25 d.

1.3 提取和分離

10.8 kg 大米發(fā)酵液用甲醇浸泡提取3 次，每次45 min，提取液合并過(guò)濾后減壓濃縮除去甲醇，乙酸乙酯萃取5次，每次60 min，合并萃取液，減壓濃縮得到乙酸乙酯層總浸膏35 g.以1260 g硅膠（80～100目）進(jìn)行正相柱層析，氯仿-甲醇體系（1∶0，20∶1，15∶1，10∶1，5∶1）梯度洗脫，經(jīng)TLC 薄層色譜檢測(cè)后合并相似組分，用TLC 進(jìn)行檢測(cè)，合并相同餾分，劃分為Fr.A～Fr.E.

Fr.D組分（5.3 g）經(jīng)中壓色譜（填充RP-18，甲醇/水：20%～100%）粗分得5 個(gè)餾分Fr.D1～Fr.D5. 組分Fr.D2（612 mg）經(jīng)正相硅膠柱層析（200～300 目），以石油醚-乙酸乙酯（12：1，5：1，2：1）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫 后 得3 個(gè) 組 分：Fr.D2a～2c. 其 中 組 分Fr.D2b（20.4 mg）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（甲醇）以及制備HPLC（色譜柱SB-C18，5μm，9.4 mm×150 mm，流動(dòng)相：52%乙腈/酸水）純化后得到化合物1（3.7 mg）和2（2.8 mg）.組分Fr.D5（403 mg）經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇）分離后得到細(xì)分組分Fr.D5b.該組分經(jīng)過(guò)制備型HPLC（流動(dòng)相，60%乙腈/酸水）純化后得到化合物3（3.0 mg）. 組分Fr.D3（418 mg）經(jīng)過(guò)正相硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯（10：1，4：1，0：1）洗脫后得到一結(jié)晶粗品，通過(guò)洗滌后得到化合物4（10.8 mg）. 組分Fr.D3（362 mg）經(jīng)過(guò)反相硅膠柱層析（甲醇/水1：1）得到細(xì)分組分Fr.D3a～3d，其中Fr.D3c（49 mg）再經(jīng)過(guò)制備型HPLC（流動(dòng)相，43%乙腈/水）純化得化合物5（3.3 mg）和6（2.9 mg）.

1.4 細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)

采用MTT 法在96 孔板中人乳腺癌細(xì)胞MCF-7進(jìn)行細(xì)胞毒活性. 化合物1 和2 分別用DMSO 溶解后配成30 mM 的儲(chǔ)備液，使用之前稀釋到適宜濃度.將人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 配制成細(xì)胞懸液接種于96 孔板上（100μL/孔），實(shí)驗(yàn)分為陽(yáng)性對(duì)照組和5 個(gè)給藥組，接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后分別加入0.064、0.32、1.6、8 和40μM 的含藥樣品溶液各10μL，在5%CO2，37 ℃孵育72 h 后，每孔 加 入10μL 配 制 好 的MTT 溶 液（5 mg/mL，即0.5%MTT）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，孵育后使用酶標(biāo)儀測(cè)量在波長(zhǎng)為490 nm 下的吸光度（A），并計(jì)算IC50值.順鉑（cisplatin）為陽(yáng)性對(duì)照.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 化合物1結(jié)構(gòu)解析及波譜數(shù)據(jù)

化合物1 為棕色固體. 根據(jù)其高分辨質(zhì)譜（HRESIMS）數(shù)據(jù)m/z 299.19659［M+H］+（計(jì)算值為299.18926）推測(cè)其分子式為C15H25N2O4，不飽和度為4.在1H NMR（表1）圖譜中，可以明顯觀察到3 個(gè)靠近的甲基信號(hào)峰（δH0.93，0.95，0.98）. 另3 個(gè)信號(hào)δH4.13（m，2H），4.24（dd，J=8.8，4.3 Hz，1H），4.44（dd，J=8.7，6.4 Hz，1H）表明該碳原子可能連接有雜原子.13C NMR數(shù)據(jù)（表1）顯示該化合物有15個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合DEPT 和HSQC 譜圖可以確定為3 個(gè)甲基、6 個(gè)亞甲基、3 個(gè)次甲基和3 個(gè)季碳信號(hào)（表1）.以上數(shù)據(jù)顯示化合物1 同已知化合物L(fēng)-pGlu-L-Leu（圖1）非常相似. 與已知化合物L(fēng)-pGlu-L-Leu 的核磁數(shù)據(jù)對(duì)照發(fā)現(xiàn)［11］，化合物1為該已知化合物C-9位羧基與正丁醇基酯化而來(lái).在HMBC 圖譜中，δH4.13（m，2H）與C-9，C-2′，C-3′有相關(guān)（圖2），δH1.62（m）也與C-9 有相關(guān)，并且δH1.40（m，2H）與C-2′，C-3′有相關(guān)，證明了該正丁醇基是鏈接在C-9 位的羧基.進(jìn)一步對(duì)化合物1的1D和2D NMR圖譜分析并確定化合物1結(jié)構(gòu)中的其他結(jié)片段和已知化合物L(fēng)-pGlu-L-Leu一致，最終化合物1的結(jié)構(gòu)確定，并命名為butyl（（S）-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl）-D-leucinate.

圖2 化合物1和2的主要2D NMR相關(guān)示意圖Fig.2 The key 2D NMR correlations of compounds 1 and 2

2.2 化合物2結(jié)構(gòu)解析及波譜數(shù)據(jù)

化合物2 為棕色油狀物. 通過(guò)HRESIMS 數(shù)據(jù)（m/z 為355.16269［M + Na］+，計(jì)算值為355.17361，C18H24N2O4Na+）確定其分子式為C18H24N2O4，不飽和度為7.通過(guò)對(duì)比分析化合物2 的1D（表1）和2D NMR數(shù)據(jù)表明2在結(jié)構(gòu)上與1非常相似.不同的地方在于化合物1的C-11原本鏈接的兩個(gè)甲基，而在化合物2中的C-11 鏈接了一個(gè)苯環(huán).首先在1D NMR 譜圖中可以觀察在化學(xué)位移δH7～8之間有5個(gè)明顯信號(hào)峰，表明單取代芳環(huán)的存在.進(jìn)一步分析HMBC圖譜，顯示δH3.00（dd，J=13.9，9.3 Hz，1H）和3.20（dd，J=13.9，5.8 Hz，1H）與C-8，C-12，C-11和C-9有明顯的HMBC 相關(guān)（圖2），δH7.21（m，1H）以及δH7.22（m，2H）與C-10 也存在HMBC 相關(guān)，證明該苯環(huán)連接在C-10位.進(jìn)一步對(duì)比碳譜、DEPT譜以及2D核磁相關(guān)數(shù)據(jù)，確定化合物2的其他結(jié)構(gòu)片段和化合物1基本一致，最終化合物2的結(jié)構(gòu)得以確定，并命名為butyl（（S）-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl）-D-phenylalaninate.

表1 化合物1和2的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)Tab.1 1H and 13C NMR data of compounds 1 and 2

2.3 已知化合物理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)

化合物3：分子式C21H32O3，無(wú)色油狀1H NMR（500 MHz，CDCl3）δH5.63（d，J= 1.9 Hz，1H），5.25（dd，J=15.3，7.7 Hz，1H），5.16（dd，J=15.3，6.9 Hz，1H），2.64（ddd，J= 11.9，6.8，1.9 Hz，1H），2.28（ddd，J= 14.1，4.1，2.4 Hz，1H），2.05（m，1H），1.98（m，1H），1.91（m，1H），1.87（m，1H），1.85（m，1H），1.73（m，1H），1.65（m，1H），1.63（m，1H），1.60（m，1H），1.51（m，1H），1.48（m，1H），1.04（d，J=6.6 Hz，3H），0.92（d，J= 6.8 Hz，3H），0.84（d，J=6.9 Hz，3H），0.82（d，J=6.8 Hz，3H），0.60（s，3H）.13C NMR（125 MHz，CDCl3）δC171.1（s），170.7（s），134.8（d），133.0（d），112.4（d），104.9（s），55.5（d），50.5（d），49.0（s），43.0（d），40.3（d），35.4（t），35.2（t），33.2（d），29.0（t），21.（t），21.2（q），20.1（q），19.8（q），17.7（q），11.9（q）.HRESIMS m/z：333［M+H］+.上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］比對(duì)一致，確定化合物3 為降甾醇類化合物4-hydroxy-17R-methylincistero.

化合物4：分子式C31H46O4，白色晶體.1H NMR（500 MHz，CDCl3）δH5.50（d，J= 6.7 Hz，1H），5.36（d，J=6.3 Hz，1H），4.79（s，1H），4.73（s，1H），4.14（dd，J= 8.5，6.0 Hz，1H），2.77（td，J= 14.6，5.7 Hz，1H），2.50（td，J= 11.1，3.3 Hz，1H），2.35（m，1H），2.29（m，1H），2.26（m，1H），2.24（m，1H），2.22（m，1H），2.20（m，1H），2.14（m，1H），2.10（m，1H），2.05（m，1H），2.00（m，1H），1.89（m，1H），1.83（m，1H），1.76（m，1H），1.72（m，1H），1.54（m，1H），1.50（m，1H），1.17（s，3H），1.12（3H，s，H-29），1.10（s，3H），1.09（s，3H），1.04（overlapped，3H），1.01（overlapped，3H），0.64（s，3H）.13C NMR（125 MHz，CDCl3）δC216.8（s），179.9（s），155.1（s），144.4（s），141.9（s），120.9（d），116.8（d），107.3（t），77.4（d），57.1（d），50.7（d），48.8（s），47.6（s），46.4（d），44.8（s），43.5（t），37.4（t），36.7（t），35.5（t），34.9（t），33.9（d），32.3（t），30.5（t），26.1（d），25.5（d），23.7（t），22.6（q），22.1（q），22.0（q），21.9（q），17.3（q）. HRESIMS m/z：483［M + H］+. 上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］數(shù)據(jù)比對(duì)一致，確定化合物4為polyporenic acid C.

化合物5：分子式C16H12N2O3，淡黃色固體.1H NMR（500 MHz，methanol-d4）δH8.30（d，J= 5.3 Hz，1H），8.20（d，J= 7.9 Hz，1H），8.03（d，J= 5.2 Hz，1H），7.72（d，J= 8.2 Hz，1H），7.60（ddd，J= 8.2，7.0，1.1 Hz，1H），7.30（t，J= 7.5 Hz，1H），7.23（d，J= 3.4 Hz，1H），6.60（d，J= 3.4 Hz，1H），4.61（s，1H）.13C NMR（125 MHz，methanol-d4）δC157.1（s），154.3（s），143.0（s），138.7（d），134.4（s），132.5（s），132.1（s），130.0（d），122.5（d），122.1（s），121.2（d），114.9（d），113.2（d），111.0（d），110.9（d），57.5（t）.HRESIMS m/z：265［M + H］+. 上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］數(shù)據(jù)比對(duì)一致，確定化合物5為perlolyrine.

化合物6：分子式C16H12N2O2，黃色固體.1H NMR（500 MHz，methanol-d4）δH8.43（s，1H），8.33（d，J=5.0 Hz，1H），8.24（dt，J= 7.9，1.0 Hz，1H），7.72（m，1H），7.61（ddd，J= 8.3，7.1，1.2 H，1H），7.55（d，J=12.1 Hz，1H），7.33（ddd，J=8.0，7.1，1.0 Hz，1H），6.48（d，J= 12.1 Hz，1H），3.64（s，-OCH3）.13C NMR（125 MHz，methanol-d4）δC195.4（s），168.4（s），143.6（s），139.3（d），138.7（d），137.0（d），136.6（s），133.4（s），130.5（d），128.9（d），122.7（d），121.8（d），121.7（s），120.4（d），113.6（d），52.4（t）.HRESIMS m/z：281［M + H］+上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］數(shù)據(jù)一致，確定 化 合 物6 為4-（9H-β-Carbolin-1-yl）-4-oxobut-2-enoic acid methyl ester.

2.4 生物活性測(cè)試結(jié)果

化合物1 和2 對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 的體外細(xì)胞毒活性（IC50）結(jié)果見表2.測(cè)試結(jié)果顯示，化合物1對(duì)MCF-7具有一定的抑制作用，IC50為36.2μM.

表2 化合物1和2的腫瘤細(xì)胞毒活性（IC50/μM）Tab.2 Cytotoxicity of compounds 1 and 2（IC50/μM）

3 結(jié)語(yǔ)

植物內(nèi)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物在抗菌、抗腫瘤、抗氧化活性方面展現(xiàn)出較好應(yīng)用潛力，是新藥發(fā)現(xiàn)的潛在資源. 本研究從白芨內(nèi)生真菌Ilyonectria robusta分離純化得到6 個(gè)化合物，其中化合物1 和2為兩個(gè)新化合物.其他化合物類型包括降甾體、三萜以及吲哚生物堿等，所有化合物均是首次從該菌種中分離得到.