趙慧軍，賈國軍，吳雄斌，馬金琳

(蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 甘肅蘭州730000)

一、引言

草莓灰霉病是由半知菌亞門、叢梗孢目、叢梗孢科、葡萄孢屬的灰葡萄孢菌侵染引起的植物病害，由于其宿主廣泛、致病性強，可以導(dǎo)致水果莖葉、果實的枯萎、腐爛[1]，嚴重影響水果的產(chǎn)量及其品質(zhì)。

國內(nèi)外的研究表明，當(dāng)前對草莓灰葡萄孢菌的防治方法和手段措施種類繁多且較為復(fù)雜。其中化學(xué)防治依然占據(jù)主導(dǎo)地位，雖然具有見效快、殺菌效果好等優(yōu)勢，但其不可避免存在導(dǎo)致諸如誘發(fā)抗藥性菌株的突變，農(nóng)藥殘留對種植園土壤、水體和其他環(huán)境因素的污染，尤其是化學(xué)藥劑直接用于水果防腐保鮮，化學(xué)殘留勢必會影響和危害身體健康[1]。由此可見，水果病蟲害生物防治及研發(fā)有機試劑用于水果防腐保鮮就具有極大的優(yōu)勢和市場潛力。

甘肅省蘭州市紅古區(qū)是蘭州市綠色農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化示范區(qū)，土壤氣候條件適合多品種草莓種植。本項目通對紅古區(qū)花莊鎮(zhèn)草莓標準化生產(chǎn)基地的調(diào)查采樣，從蘭州市花莊鎮(zhèn)河咀村草莓種植基地灰霉病高發(fā)區(qū)病果根際土壤篩選到一株枯草芽孢桿菌，經(jīng)抑菌實驗發(fā)現(xiàn)其對灰霉菌有一定的抑制作用。通過人工誘變的方法在原來基礎(chǔ)上選育抑菌能力更強的生防細菌，并通過對發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)進行分離純化，對草莓灰霉菌拮抗菌抑菌成分進行定性分析研究。

二、材料與方法

(一)供試菌種

實驗中植物病原菌草莓灰葡萄孢菌(Botrytis sp.isolate NO_9)由項目團隊從紅古區(qū)花莊鎮(zhèn)河咀村溫室大棚(103°07′23.93″E，36°12′16.36″N)種植的草莓病果(未采摘)、感染灰霉菌的草莓葉片、冷庫中儲存的草莓腐敗果實中分離鑒定保藏(已經(jīng)通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，為草莓灰葡萄孢菌)。拮抗菌HZ12從上述采樣區(qū)草莓病果、草莓植株根際土壤分離純化保藏(已經(jīng)通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，為枯草芽孢桿菌)。

(二)試劑

PDA培養(yǎng)基；斜面培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基；液體搖瓶培養(yǎng)基：液體肉湯培養(yǎng)基。硫酸二乙酯(DES),亞硝酸。

(三)試驗方法

1.硫酸二乙酯誘變

致死率的測定：將經(jīng)過活化的出發(fā)菌株轉(zhuǎn)接至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行搖床培養(yǎng)，設(shè)置30℃、180 rpm/min恒溫震蕩培養(yǎng)12 h，5000 rpm/min離心10 min，棄上清，Ph6.0的磷酸緩沖液洗滌沉淀3次，制備成1ⅹ108 CFU/mL的菌懸液。從中取出10 mL的菌懸液，分別加入5μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50μlDES，形成6個濃度梯度：0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，以不加DES為空白對照。28℃、180rpm/min恒溫震蕩培養(yǎng)40 min，然后向菌懸液中加入1mL2%的硫代硫酸鈉，終止誘變反應(yīng)。稀釋菌懸液，涂布平板，每個處理涂布三個平板，37℃恒溫培養(yǎng)48h，統(tǒng)計菌落數(shù)，計算致死率。

2.突變株的篩選

對菌株HZ12進行DES誘變處理，作用時間10min，挑選單菌落，將誘變獲得的25個菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)。

初篩：將誘變處理的菌株在20 mL液體搖瓶中發(fā)酵培養(yǎng)2 d，離心收集上清液，將上清液(100 mL)與等量灰霉孢子懸液混合[2]，28℃萌發(fā)8h后計算萌發(fā)率，對菌種進行初篩。

復(fù)篩：將上述篩選的菌株進行斜面培養(yǎng)，待菌株成熟后接種搖床發(fā)酵培養(yǎng)，制備發(fā)酵液進行抑菌實驗，檢測其抑菌性。

突變株穩(wěn)定性試驗：為測試誘變得到的突變株穩(wěn)定性，將誘變后得到的兩株突變株在細菌培養(yǎng)基上進行連續(xù)傳代5次，將傳代的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，制備發(fā)酵液進行抑菌實驗，檢測其抑菌性。

3.草莓灰霉孢子懸液的制備

將上述分離純化篩選出的灰葡萄孢菌接種PDA平板，25℃恒溫培養(yǎng)5 d，確保培養(yǎng)箱濕度(相對濕度90%)，平板菌絲生長良好，附著大量孢子(顏色暗灰色)即可。0.3%吐溫80滅菌水溶液反復(fù)洗脫培養(yǎng)皿，收集灰霉孢子，用無菌水調(diào)整其濃度為1.0x106個/mL備用。

4.有效抑菌物質(zhì)的定性研究

將草莓灰霉菌拮抗菌株HZ12進行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，150 rpm/min、37℃恒溫搖床48 h后，制備處理發(fā)酵產(chǎn)物，對其發(fā)酵液進行4000 rpm/min離心30 min，分離上清液I備用，沉淀為拮抗菌菌體，用PBS離心洗滌2次、無菌水離心洗滌1次后備用[3]。

無菌水制備拮抗菌菌懸液，進行細胞破碎處理(采用間歇破碎：細胞破碎2s，間歇2s，持續(xù)10 min)，靜置待出現(xiàn)上清液，4000 rpm/min離心30 min，分離上清液II備用，收集沉淀，用無菌水稀釋制備懸濁液III[4]。

分別測定不同物質(zhì)的抑菌活性(杯碟法)：15 cmPDA培養(yǎng)皿間隔(等間距)放置3個牛津杯[5]，杯中分別加入100μl上清液I、上清液Ⅱ、懸濁液III，培養(yǎng)箱25℃恒溫培養(yǎng)48 h后測其抑菌圈。

EP管中分別加入清液I、上清液Ⅱ、懸濁液III、液體培養(yǎng)基3 mL，再加入上述制備的灰霉孢子懸液2 mL，恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)8 h，將EP管內(nèi)懸濁液混合均勻后，取樣置于計數(shù)板上，計算灰霉孢子萌發(fā)率。

三、結(jié)果與討論

(一)最佳誘變濃度的選擇

見表1所示，DES濃度的增加，菌群致死率逐漸增加。參考文獻資料顯示，選擇致死率為70%-80%的誘變處理濃度作為最佳的誘變濃度，因此選擇DES的最佳誘變濃度為0.1%。

表1 DES濃度與菌群致死率的關(guān)系

(二)突變株的篩選

通過抑菌圈可以發(fā)現(xiàn)，得到的兩株突變菌通過傳代培養(yǎng)后HZ12-13、HZ12-17對灰霉具有穩(wěn)定的抑制作用，且該菌株能穩(wěn)定遺傳，未出現(xiàn)菌株退化的現(xiàn)象(見圖1-圖4)。

圖1 菌株HZ12-13菌落 圖2 菌株HZ12-17菌落

抑菌圈如圖3、圖4所示：

圖3菌株HZ12-13拮抗試驗 圖4菌株HZ12-17拮抗試驗

(三)拮抗菌不同成分對草莓灰葡萄孢菌的抑菌作用

采用杯碟法檢測上清液I、上清液Ⅱ、懸濁液III對草莓灰葡萄孢菌的抑制作用，以無菌水為對照，菌株HZ12-13和HZ12-17具有較強的抑菌作用(見圖5、圖6)；發(fā)酵液抑菌試驗培養(yǎng)2d后，抑菌圈直徑均在16-24mm，抑菌效果較為穩(wěn)定(見表2)。

表2 拮抗菌對灰霉菌的生長抑制作用

圖5菌株HZ12-13拮抗實驗 圖6菌株HZ12-17拮抗實驗

(四)拮抗菌不同成分對草莓灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用

見表3所示，添加了上清液I的灰霉孢子萌發(fā)率最低。

表3 拮抗菌對灰霉孢子的萌發(fā)抑制作用

初步認為，枯草芽孢桿菌對灰霉菌的拮抗物質(zhì)主要有兩類：細胞發(fā)酵產(chǎn)物(胞外分泌物)、細胞體(細胞內(nèi)容物或細胞結(jié)構(gòu)成分)，采用超聲波破碎主要是將枯草芽孢桿菌菌體裂解，細胞破碎，使其細胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來[6]，溶解(懸浮于)上清液Ⅱ(或懸濁液III)。實驗中以細胞培養(yǎng)基為對照，以排除培養(yǎng)基對孢子萌發(fā)的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，細菌培養(yǎng)基不能抑制或干擾灰霉菌孢子萌發(fā)，其營養(yǎng)成分可滿足灰霉孢子的萌發(fā)和生長。因此，拮抗菌發(fā)酵產(chǎn)物其胞外分泌物可有效抑制灰霉孢子的萌發(fā)，這對后續(xù)研究草莓灰霉病的防治和防腐保鮮具有重要意義和應(yīng)用價值。