趙 宏，楊 柳 ，趙良娟，龐 璐，張俊哲，朱韶英，趙玉玲，譚有蘭，趙化冰，劉 培，劉國(guó)紅，吳 嵐，董志珍,4,

（1.天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津 300461；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；3.中華人民共和國(guó)呼和浩特海關(guān)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010090；4.天津市口岸非傳統(tǒng)安全風(fēng)險(xiǎn)防控科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300461）

阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii，CS）是一種可寄生于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的食源性條件致病菌[1?2]，具有易存活、耐高溫（54~62 ℃）、耐酸（pH<3.9）、耐干燥及繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，在低溫、干燥等惡劣環(huán)境中極微量的污染就可能進(jìn)行大量繁殖，是引起新生兒食源性疾病的致病菌之一[1?4]。研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒配方乳粉是新生兒感染阪崎克羅諾桿菌的主要途徑，據(jù)研究報(bào)道顯示，食用被阪崎克羅諾桿菌污染的奶粉會(huì)導(dǎo)致新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎、敗血癥等疾病，治愈后仍可能引起神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，流行病學(xué)研究顯示，其病死率約為50%~80%[2,5?7]。

1961年英國(guó)首次報(bào)道出現(xiàn)由阪崎克羅諾桿菌污染引起的新生兒腦膜炎病例[8]，隨后越來越多的病例被報(bào)道。2002年，阪崎克羅諾桿菌被國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)列為“嚴(yán)重危害特定人群生命，引起長(zhǎng)期慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥”的一種致病菌[9]。2005年我國(guó)國(guó)家質(zhì)檢總局頒布了奶粉中檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1632.1，隨后又頒布了嬰幼兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌每批必檢的市場(chǎng)準(zhǔn)入要求[9?10]。

盡管目前已建立了多種準(zhǔn)確靈敏、特異性好的阪崎克羅諾桿菌檢測(cè)方法，但這些方法仍然存在不足，傳統(tǒng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[11]檢測(cè)周期長(zhǎng)，至少需要6 d才能鑒定出結(jié)果；分子生物學(xué)檢測(cè)方法[3,12]易受試劑及環(huán)境污染，存在漏檢及假陽性問題；單一免疫學(xué)檢測(cè)方法因檢出限較高而受限制[13]；全基因組測(cè)序方法[14]樣品前處理要求高且復(fù)雜，結(jié)果分析對(duì)于檢測(cè)人員的相關(guān)背景要求較高，因此，本研究將具有較好的特異性、準(zhǔn)確性及靈敏性的免疫（immunomagnetic beads, IMB）富集技術(shù)[15?16]與靈敏度高、分析速度快、樣品制備簡(jiǎn)單的新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)-基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）[17?18]相結(jié)合用于檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中的阪崎克羅諾桿菌，以克服以上檢測(cè)技術(shù)存在的檢測(cè)周期長(zhǎng)、特異性不高等問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Cronobacter sakazakiiATCC 12868、ATCC 29004、ATCC 29544）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 27660）、鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（Salmonella typhimurium，S.TATCC 14028）；單核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、大腸桿菌（Escherichia coli）、本實(shí)驗(yàn)室分離的未知阪崎克羅諾桿菌（盲樣分離株） 本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)藏；兔抗阪崎克羅諾桿菌多克隆抗體 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；溶菌肉湯培養(yǎng)基（lysogeny broth, LB） 實(shí)驗(yàn)室自行配制；阪崎克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基 上海欣中生物工程有限公司；N-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（N-（3-dimethylaminopropyl）-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC）、羥基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide, NHS）、2-嗎啉乙磺酸（2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid,MES） 分析純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；飽和基質(zhì)CHCA（α-氰基-4-羥基肉桂酸） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司； PM3-020聚合物羧基磁珠（180 nm）磁珠 上海奧潤(rùn)微納新材料科技有限公司；嬰幼兒配方奶粉（12~36月齡） 天津海關(guān)動(dòng)植物與食品安全檢測(cè)中心抽檢樣。

ZHJH-C1214B垂直流潔凈工作臺(tái)、LHR-150生化培養(yǎng)箱、HZQX-500C恒溫振蕩培養(yǎng)器 浙江賽德儀器設(shè)備有限公司；AXIMA confidence MALDITOF MS質(zhì)譜儀 日本島津公司；MS-12多功能磁分離架 上海奧潤(rùn)微納新材料科技有限公司；BE-1100四維旋轉(zhuǎn)混勻儀 北京海天友誠(chéng)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗體制備 委托北京博奧森生物技術(shù)有限公司對(duì)4株阪崎克羅諾桿菌分離株（ATCC 29004、ATCC 12868、ATCC 29544、盲樣分離株）進(jìn)行抗體制備。

1.2.2 免疫磁珠的制備 根據(jù)上海奧潤(rùn)微納新材料科技有限公司AllMag?PM3-020的使用說明書活化及制備阪崎克羅諾桿菌多克隆抗體免疫磁珠（CSIMB），該過程大約需要2~3 h。

1.2.3 菌懸液的制備 取適量低溫貯藏的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)活化。取1 mL菌液，4000 r/min離心 10 min，棄掉上清液，用無菌生理鹽水將菌液進(jìn)行梯度稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度[19]。

1.2.4 阪崎克羅諾桿菌多克隆抗體特異性驗(yàn)證 將阪崎克羅諾桿菌分別與大腸桿菌、沙門氏菌、單核增生李斯特氏菌及金黃色葡萄球菌以細(xì)菌濃度比為1:1進(jìn)行混合后在最佳反應(yīng)條件（最佳反應(yīng)條件已在前期研究進(jìn)行優(yōu)化[19]）下反應(yīng)后磁分離，去上清，將菌體-免疫磁珠復(fù)合物接種于LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定與分析。

1.2.5 阪崎克羅諾桿菌多克隆抗體-免疫磁珠（CSIMB）捕獲率驗(yàn)證 將制備好的CS-IMB分別與4株純培養(yǎng)的阪崎克羅諾桿菌及其混菌菌液（菌濃度約為1×103CFU/mL，4株純培養(yǎng)的阪崎克羅諾桿菌的比例為1:1:1:1）在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)后磁分離，待磁珠充分被吸附后取100 μL上清液接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，計(jì)算免疫磁珠的捕獲率，捕獲率計(jì)算公式如下。

注：C0：原菌液菌落數(shù)，CFU/mL；C1：免疫磁珠捕獲后的上清液菌落數(shù)，CFU/mL。

1.2.6 MALDI-TOF MS鑒定與數(shù)據(jù)采集分析

1.2.6.1 點(diǎn)樣 將磁珠捕獲后的菌體-免疫磁珠復(fù)合物經(jīng)甲酸/乙醇提取法[20]處理后取1 μL上清液加至點(diǎn)樣靶，每種處理方法得到的樣品平行點(diǎn)4個(gè)孔，待樣液滴晾干后，覆蓋1 μL飽和基質(zhì)CHCA，干燥后進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定[21]。

1.2.6.2 MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)采集與分析 采用MALDI-TOF MS對(duì)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。分析采用線性模式；激光能量：60~90 Hz；收集質(zhì)荷比范圍（m/z）：2000~20000；每個(gè)樣品激光轟擊100次；采集到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入島津SARAMIS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。每次試驗(yàn)前在采集數(shù)據(jù)的質(zhì)量范圍內(nèi)使用大腸桿菌ATCC 8739標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)[22]。

1.2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

1.2.7.1 奶粉檢測(cè)樣制備 從天津海關(guān)動(dòng)植物與食品安全檢測(cè)中心抽檢樣中隨機(jī)選取3種不同品牌嬰兒配方乳粉，根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 4789.40-2016[11]進(jìn)行檢測(cè)樣品處理。

1.2.7.2 奶粉檢測(cè)樣品中免疫磁珠捕獲率驗(yàn)證 向處理好的奶粉樣品中分別加入細(xì)菌濃度約為1×103CFU/mL的阪崎克羅諾桿菌菌液，在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)后磁分離，待磁珠充分被吸附后取100 μL上清液接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，計(jì)算免疫磁珠的捕獲率。

1.2.7.3 奶粉檢測(cè)樣品中免疫磁珠特異性及檢出限研究 將4株阪崎克羅諾桿菌混菌分別與雜菌（大腸桿菌、沙門氏菌及單核增生李斯特氏菌混菌液，其中三種菌液的混合比例為1:1:1）以1:1、1:10、1:100的比例混勻后加入3種不同奶粉處理液中，在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)后磁分離，棄上清，將菌體-免疫磁珠復(fù)合物接種于LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定并分析。需要指出的是，由于此前對(duì)抗體特異性進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)金葡對(duì)本研究的檢測(cè)結(jié)果干擾較大，因此，該項(xiàng)研究并未將金葡作為干擾菌進(jìn)行研究。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 多克隆抗體效價(jià)的比較采用雙樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 阪崎克羅諾桿菌抗體制備

高效價(jià)的抗體可以提高免疫檢測(cè)的特異性和靈敏性[13]，通過前期查閱分析發(fā)現(xiàn)，目前市場(chǎng)上相關(guān)的阪崎克羅諾桿菌抗體種類較少，抗體所覆蓋的菌株難以滿足本實(shí)驗(yàn)的要求，因此，本單位委托北京博奧森生物技術(shù)有限公司對(duì)4株阪崎克羅諾桿菌（ATCC 29004、ATCC 12868、ATCC 29544、盲樣分離株）進(jìn)行混菌抗體制備，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)四次免疫后，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）血清效價(jià)如表1所示，ATCC 29004、ATCC 12868、ATCC 29544以及盲樣分離株的效價(jià)分別為1:128000、1:128000、1:512000和1:128000，表明免疫動(dòng)物血清具有較高效價(jià)，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。對(duì)每只動(dòng)物各取5 mL血清，使用ProteinA免疫親和層析進(jìn)行抗體純化，已有研究表明，ProteinA純化方法親和與洗脫過程溫和，幾乎不會(huì)對(duì)抗體效價(jià)產(chǎn)生影響[13]。因此，本研究使用的高效價(jià)抗體可有效提高免疫磁珠的特異性和靈敏性。

表1 阪崎克羅諾桿菌混菌抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of antibody titer determination of Enterobacter sakazakii

2.2 阪崎克羅諾桿菌抗體特異性驗(yàn)證

免疫富集技術(shù)以抗原抗體的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，因而高質(zhì)量的抗體對(duì)于免疫富集的特異性與準(zhǔn)確性具有重要意義[23]。采用免疫富集結(jié)合MALDI-TOF MS的方法，在不同菌株的干擾條件下對(duì)抗體特異性進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示，盡管不同樣品的細(xì)菌指紋圖譜峰值強(qiáng)度有所差別，但是，例如m/z約為5381、6256、9482、10288等特征峰的分布基本相同，即在不同菌株的干擾條件下，免疫磁珠富集后的檢測(cè)樣本可以經(jīng)MALDI-TOF MS準(zhǔn)確鑒定為阪崎克羅諾桿菌，說明免疫磁珠具有較好的特異性，根據(jù)MALDI-TOF MS對(duì)檢測(cè)樣品純度要求高的特點(diǎn)，同時(shí)也間接表明抗體具有較好的特異性，有助于提高后續(xù)檢測(cè)的特異性與準(zhǔn)確性。但是，在鑒定過程中，出現(xiàn)少量的金黃色葡萄球菌鑒定結(jié)果，同時(shí)，空白對(duì)照，即未偶聯(lián)抗體的磁珠捕獲樣本也出現(xiàn)了金黃色葡萄球菌鑒定結(jié)果，考慮可能是由于磁珠自身非特異吸附所造成的影響[24]。

圖1 阪崎克羅諾桿菌混菌抗體特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 Results of antibody specificity verification of Enterobacter sakazakii

2.3 阪崎克羅諾桿菌-免疫磁珠（CS-IMB）捕獲率研究

制備的免疫磁珠能否具有高捕獲率效果對(duì)于檢測(cè)方法的靈敏性具有重要的影響，因此，本研究對(duì)純培養(yǎng)條件下CS-IMB對(duì)阪崎克羅諾桿菌的捕獲率進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖2所示，在純培養(yǎng)條件下，免疫磁珠對(duì)于4株不同阪崎克羅諾桿菌及其混菌的捕獲率均>85%，表明免疫磁珠具有較高的捕獲率。

圖2 純培養(yǎng)條件免疫磁珠的捕獲率Fig.2 Capture rate of immunomagnetic beads under pure culture condition

2.4 阪崎克羅諾桿菌-免疫磁珠（CS-IMB）在奶粉基質(zhì)中的捕獲率

能否在食品體系中高效捕獲目的抗原菌，對(duì)于提高檢測(cè)結(jié)果的靈敏性與準(zhǔn)確性具有重要意義，因此，對(duì)3種不同奶粉基質(zhì)中CS-IMB對(duì)阪崎克羅諾桿菌的捕獲率進(jìn)行研究并取均值。結(jié)果如圖3A所示，奶粉基質(zhì)中CS-IMB的捕獲率菌>80%，且檢測(cè)樣本可以經(jīng)MALDI-TOF MS質(zhì)譜準(zhǔn)確鑒定為阪崎克羅諾桿菌（圖3B），盡管不同樣品的細(xì)菌指紋圖譜峰值強(qiáng)度有所差別，但是特征峰的分布基本相同，即CS-IMB對(duì)目的抗原菌的捕獲率及MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果幾乎不受奶粉基質(zhì)的影響。

圖3 奶粉基質(zhì)中免疫磁珠的捕獲率及MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果Fig.3 Capture rate of immunomagnetic beads in milk powder matrix and identification result of MALDI-TOF MS

2.5 不同奶粉樣品中免疫磁珠的特異性及檢出限

實(shí)際檢測(cè)工作中，檢測(cè)樣品除污染目的菌外，也可能污染其他病原菌，且污染比例有所不同，然而，目前尚未檢索到相關(guān)研究人員對(duì)高比例雜菌污染條件下免疫磁珠富集的特異性進(jìn)行相關(guān)研究。因此，本研究針對(duì)3種不同奶粉樣品在不同比例雜菌（沙門氏菌、大腸桿菌、單核增生李斯特氏菌混菌）條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究免疫富集聯(lián)合MALDI-TOF MS檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的方法在實(shí)際樣品中的檢測(cè)特異性與檢出限。結(jié)果如圖4所示，即使在高比例（阪崎克羅諾桿菌:雜菌=1:100）雜菌污染條件下，盡管不同樣品的細(xì)菌指紋圖譜峰值強(qiáng)度有所差別，但是特征峰的分布基本相同，且指紋圖譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)相符率均>75%，即檢測(cè)樣品經(jīng)MALDI-TOF MS準(zhǔn)確鑒定為阪崎克羅諾桿菌。同時(shí)，檢測(cè)樣本中的阪崎克羅諾桿菌通過平板計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示細(xì)菌濃度僅為20 CFU/mL，說明此時(shí)檢測(cè)樣本活菌濃度約為20 CFU/mL，此外，由于平板計(jì)數(shù)的局限性，該數(shù)值也存在一定誤差。

圖4 不同奶粉樣品中不同雜菌比例條件的蛋白指紋圖譜Fig.4 Protein fingerprints of different proportion of mixed bacteria in different milk powder samples

3 結(jié)論

在免疫富集聯(lián)合MALDI-TOF MS檢測(cè)中，高捕獲率及高特異性的免疫磁珠對(duì)于檢測(cè)樣本后續(xù)的準(zhǔn)確鑒定具有重要影響，而免疫磁珠作為一種以抗原抗體特異性結(jié)合為原理的分離富集技術(shù)，其高效的捕獲效率及特異性主要取決于抗原抗體結(jié)合的親和性及特異性。因此，本研究制備了一種可同時(shí)對(duì)4株不同阪崎克羅諾桿菌具有高親和性的混菌抗體，通過對(duì)其在不同條件下的捕獲率進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示該抗體制備的免疫磁珠具有較高的捕獲率，且不受奶粉基質(zhì)的影響。

此外，在實(shí)際工作中，檢測(cè)樣本往往可能存在多種致病菌的共同污染，且污染比例不一，所以，能否在復(fù)雜污染體系中準(zhǔn)確捕獲并鑒定目的菌株，也是考驗(yàn)檢測(cè)方法是否具有特異性及靈敏性的關(guān)鍵。通過對(duì)奶粉樣品在不同雜菌污染比例條件下的鑒定結(jié)果分析顯示，盡管在高比例（1:100）雜菌污染條件下，免疫富集聯(lián)合MALDI-TOF MS鑒定方法仍能對(duì)檢測(cè)樣品中的阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，且此時(shí)檢測(cè)樣本中的阪崎克羅諾桿菌濃度約為20 CFU/mL，整個(gè)鑒定過程只需約24 h。與傳統(tǒng)方法相比，極大縮短了鑒定時(shí)間；與分子生物學(xué)方法相比[2]，克服了試劑及環(huán)境的污染；與全基因組測(cè)序方法相比，對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)要求不高，與單一免疫學(xué)方法相比，檢出限低至20 CFU/mL。

但是不足之處在于，該檢測(cè)方法對(duì)于抗體的特異性要求較高，且抗體制備耗時(shí)，費(fèi)用高，因此，在抗體方面還有待進(jìn)一步研究，同時(shí)，該方法對(duì)于檢測(cè)單位是否具備MALDI-TOF MS檢測(cè)條件也有要求。總的來說，本研究建立了一種快速簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高的奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)方法，為奶粉中阪崎克羅諾桿菌的有效快速檢測(cè)提供了新的方法參考。