盧方云，吳瑀婕，黃 瑾，張新笑 ，王道營(yíng)，鄒 燁, ，徐為民

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212001；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，江蘇南京 210014；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210014）

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA），俗稱(chēng)玻尿酸，是一種高分子量線性大分子酸性黏多糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙?；被?D-葡萄糖的雙糖單位重復(fù)交替連接組成[1]。1934年，人們最先從牛眼玻璃體中分離得到HA，并發(fā)現(xiàn)動(dòng)物和人體結(jié)締組織細(xì)胞間質(zhì)中也廣泛存在HA，其中，眼玻璃體、皮膚、臍帶、軟骨和關(guān)節(jié)滑液中HA含量較高。不同來(lái)源的HA其結(jié)構(gòu)基本相同，但來(lái)源不同的HA其分子量大小有所不同[2]。HA作為機(jī)體內(nèi)的多功能基質(zhì)，具有調(diào)控細(xì)胞增殖，分化，遷移、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)，保護(hù)軟骨、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、抗氧化、抗衰老等重要的生理功能。

HA具有極強(qiáng)的保水作用，保濕效果高于目前自然界發(fā)現(xiàn)的其它保濕物質(zhì)，被譽(yù)為理想的天然保濕因子，已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)和化妝品生產(chǎn)等領(lǐng)域。隨著今年HA被批準(zhǔn)為新資源食品原料，HA的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。同時(shí)消費(fèi)者的健康意識(shí)不斷提高，對(duì)HA原料的需求不斷擴(kuò)大，工業(yè)化制備高品質(zhì)HA必不可少。本文通過(guò)對(duì)天然HA的生理功能，制備及分離純化，應(yīng)用領(lǐng)域展開(kāi)綜述，旨在為HA的開(kāi)發(fā)與利用提供參考。

1 透明質(zhì)酸在機(jī)體內(nèi)的分布及生理功能

1.1 透明質(zhì)酸在機(jī)體內(nèi)的分布

天然HA廣泛存在于高等動(dòng)物體內(nèi)各種組織中，只是含量不同。其主要分布在細(xì)胞基質(zhì)和潤(rùn)滑液中，包括人臍帶、關(guān)節(jié)滑液、皮膚、胸淋巴液、玻璃體、雞冠等。雄雞冠是目前發(fā)現(xiàn)的HA含量最高的動(dòng)物組織，各機(jī)體透明質(zhì)酸含量見(jiàn)表1[3]。HA在人體各組織中廣泛分布，不同生物體組織中的HA其分布位置基本相同，主要在分子量大小方面有差異，正常生物組織中HA分子量大約為1000~8000 kDa，分子量大小不同，三維結(jié)構(gòu)刺激不同受體或通路，發(fā)揮不同作用[4]。

表1 不同機(jī)體透明質(zhì)酸含量Table 1 Hyaluronic acid content in different bodies

1.2 透明質(zhì)酸的生理功能

1.2.1 潤(rùn)滑關(guān)節(jié)，保護(hù)軟骨 HA廣泛分布在細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞基質(zhì)中，是關(guān)節(jié)滑液的主要組成成分，分布于軟骨和韌帶表面，HA具有良好的粘彈性，在行走時(shí)，滑液呈粘性減少關(guān)節(jié)摩擦，在做跑步等高撞擊頻率動(dòng)作時(shí)滑液呈彈性，緩沖應(yīng)力對(duì)關(guān)節(jié)的損傷，當(dāng)關(guān)節(jié)負(fù)重時(shí)滑液由流體變?yōu)閺椥泽w保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨[5]。有大量證據(jù)表明老年患者骨關(guān)節(jié)炎是由氧化應(yīng)激引起的，骨關(guān)節(jié)炎是關(guān)節(jié)軟骨的磨損，當(dāng)受到活性氧攻擊時(shí)HA長(zhǎng)鏈分解為HA片段，削弱了軟骨的整體結(jié)構(gòu)[6]。

1.2.2 促進(jìn)創(chuàng)傷愈合 傷口愈合過(guò)程可以分為止血期、炎癥期、增殖期、成熟期四個(gè)時(shí)期。損傷發(fā)生時(shí)HA在傷口處含量增加，由于其分子量大，用作早期的臨時(shí)結(jié)構(gòu)[7]。炎癥期受損的細(xì)胞開(kāi)始滲出含有鹽、水、蛋白質(zhì)的滲出物[8]，此階段的特征是受傷部位發(fā)紅發(fā)熱，疼痛、功能障礙[9]。HA與白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表面受體CD44結(jié)合，導(dǎo)致較少的白細(xì)胞遷移到炎癥部位減少傷口腫脹程度[10]。CD44受體在炎癥反應(yīng)中具有重要作用，其中高分子量HA刺激抗炎反應(yīng)，低分子量HA誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。增殖期創(chuàng)面以新的膠原組織重建，細(xì)胞外基質(zhì)分泌，在肌成纖維作用下傷口開(kāi)始收縮[11]。成熟期無(wú)組織膠原蛋白形成交聯(lián)，減少疤痕，增強(qiáng)傷口部分皮膚彈性。

1.2.3 調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、分化 HA是影響細(xì)胞增殖、遷移、分化過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子，HA的存在有助于局部組織水化，削弱細(xì)胞對(duì)胞外基質(zhì)的固定，促進(jìn)細(xì)胞分離從而遷移甚至分裂，細(xì)胞表面的HA受體也可以與一些與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)的激酶相連接[12]。在有絲分裂早期階段，HA含量增高，分裂進(jìn)入G1期（前一次有絲分裂完成到合成期開(kāi)始之間的時(shí)期）含量急劇下降，高水平HA引起生長(zhǎng)因子釋放，并通過(guò)形成細(xì)胞膜外膜影響細(xì)胞間相互作用加快細(xì)胞增殖[13]，但目前尚未觀察到HA有直接地促進(jìn)有絲分裂活性的作用。HA的這種信號(hào)調(diào)控作用與其分子量有關(guān)，分子量不同觸發(fā)的信號(hào)通路不同，低分子量HA誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，此外低分子量HA可增強(qiáng)促炎基因的表達(dá)，高分子量HA作用則相反[14]。

1.2.4 血管生成作用 有報(bào)道稱(chēng)低分子量HA可刺激信號(hào)分子表達(dá)，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，高分子量HA可抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移，有抗血管生成作用[15]，但是支持HA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響大多數(shù)是使用腫瘤異種移植物產(chǎn)生的，某些數(shù)據(jù)顯示注射低分子量HA會(huì)抑制腫瘤的生長(zhǎng)[16]，這與上述觀念相沖突，表明可能存在更加復(fù)雜的路徑和相互作用，需要進(jìn)一步研究。

1.2.5 抗氧化活性 研究發(fā)現(xiàn)HA可消除自由基，具有一定的抗氧化活性。高分子量HA可保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的影響，過(guò)量的活性氧會(huì)破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA，HA的某些抗氧化特性包括其減少紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，酸誘導(dǎo)的DNA損傷等能力[17]。馮寧等[18]研究了口服HA后血清的超氧化物歧化酶活性，發(fā)現(xiàn)HA具有體內(nèi)抗氧化作用，于?；鄣萚19]研究發(fā)現(xiàn)大鯢黏液HA具有一定的體外抗氧化活性，能夠清除 DPPH·、·OH、ABTS+·和還原 Fe3+。有學(xué)者推測(cè)HA的抗氧化性能是由于HA結(jié)構(gòu)上的羥基官能團(tuán)可以吸收活性氧[14]。

1.2.6 抗衰老作用 研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)透明質(zhì)酸含量隨年齡增加會(huì)有降低的現(xiàn)象，60歲與20歲時(shí)相比HA含量下降75%，年齡越大體內(nèi)透明質(zhì)酸含量越低，同年齡人群體內(nèi)的HA含量也不同，體內(nèi)HA含量高的人群看起來(lái)更加年輕，出現(xiàn)衰老癥狀的人群體內(nèi)HA含量明顯較低[20]。皮膚中HA含量降低，細(xì)胞間膠狀基質(zhì)所填充的空間減小，導(dǎo)致細(xì)胞排列緊密，膠原蛋白失水硬化，使皮膚粗糙，失去彈性。研究發(fā)現(xiàn)HA可治愈由紫外線照射引起的皮膚損害，高濃度HA可影響膠原蛋白的表達(dá)[21]。

綜上，HA的生理功能與其分子量大小息息相關(guān)，不同分子量HA在創(chuàng)傷愈合，調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、分化，血管生成及抗氧化活性等生理功能中發(fā)揮著不同的作用，低分子量HA誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，高分子量HA抗氧化活性?xún)?yōu)于低分子量HA。這種生理功能上的差異導(dǎo)致其最終在產(chǎn)品上的應(yīng)用有所不同。

2 透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

2.1 透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)

HA是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖等摩爾重復(fù)交替連接組成的一種高分子量酸性黏多糖，兩種單糖之間通過(guò)β-1,3-糖苷鍵相連，雙糖單位通過(guò)β-1,4-糖苷鍵相連，HA的一級(jí)結(jié)構(gòu)如圖1所示[22]。HA作為目前發(fā)現(xiàn)的唯一不含硫的糖胺聚糖與普通糖胺聚糖的區(qū)別在于HA通過(guò)細(xì)胞膜表面膜蛋白合成而非由細(xì)胞高爾基體合成[23]，不同來(lái)源HA結(jié)構(gòu)無(wú)差異。

圖1 透明質(zhì)酸一級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1 Primary structure of hyaluronic acid

2.2 透明質(zhì)酸的理化性質(zhì)

HA為白色無(wú)定形固體，有酸性粘多糖的共同性質(zhì)，溶于水不溶于乙醇等有機(jī)溶劑[24]。HA水溶液具有特異的流變學(xué)性質(zhì)，擁有良好的粘彈性，低濃度或小分子量HA以單體狀態(tài)存在，粘度變化小，高分子量高濃度HA粘彈性較好[25]，呈非牛頓流體特性，非常適合模擬關(guān)節(jié)滑液，滑液的粘彈性與HA濃度有關(guān)[13]，合理改變HA的分子量和溶液濃度均能獲得較好的粘彈性。由于HA分子鏈單糖間氫鍵的存在，低濃度HA也能形成獨(dú)特的蜂窩狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使HA能吸附約自身1000倍的水分，具有很強(qiáng)的保濕性[26]。不同分子量HA具有不同理化性質(zhì)，高分子量HA有更高的粘度，較長(zhǎng)鏈HA隨機(jī)卷曲結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，短鏈更容易膨脹[27]。細(xì)胞區(qū)分高分子量和低分子量HA的方法及生物學(xué)途徑差異仍未知。

3 透明質(zhì)酸的制備及純化

3.1 透明質(zhì)酸來(lái)源途徑

3.1.1 動(dòng)物組織來(lái)源途徑 動(dòng)物組織來(lái)源可分為陸地生物來(lái)源和海洋生物來(lái)源，目前主要從雞冠、人臍帶、蛋殼膜、豬皮等陸地生物組織中提取HA。雞冠作為HA含量較高的動(dòng)物組織，廣泛用于透明質(zhì)酸的提取。陸生生物組織提取由于受到原料的限制，不能進(jìn)行大批量生產(chǎn)，研究者在不斷嘗試從其他動(dòng)物組織或其他原料來(lái)源中進(jìn)行提取。海洋生物資源如動(dòng)物殘?jiān)U棄物、副產(chǎn)品等由于其長(zhǎng)期的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益，一直以來(lái)都得到了廣泛的關(guān)注，作為HA等物質(zhì)的提取來(lái)源具有重大潛力[28]。研究者們已從海洋生物眼玻璃體如金烏賊眼、魷魚(yú)眼、金槍魚(yú)眼、蛙皮、魚(yú)體粘液、淡水蚌肉汁水等生物組織中提取到HA[19,25,29]。易喻等[29]首次從金槍魚(yú)眼玻璃體中提取HA，最終提取率為0.013%，于海慧等[19]從大鯢體表黏液中進(jìn)行提取，在胰蛋白酶添加量1.5%時(shí)，HA得率為1.7041 mg/g ，提取到的HA結(jié)構(gòu)與標(biāo)準(zhǔn)品相同，相比于雞冠、臍帶等陸地生物組織，提取率較低，但可作為HA提取的穩(wěn)定來(lái)源。

3.1.2 微生物發(fā)酵來(lái)源途徑 HA廣泛分布在部分細(xì)菌的細(xì)胞夾膜中，能避免氧氣對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害，前人對(duì)細(xì)菌中透明質(zhì)酸的探究主要是為了探索莢膜的組成及功能。日本資生堂首先將發(fā)酵法制備HA應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。HA在菌體中的合成復(fù)雜且連續(xù)，葡萄糖在葡萄糖激酶的作用下生成葡萄糖-6-磷酸，之后在異構(gòu)酶、葡萄糖磷酸變異酶等多種酶的作用下生成前體物質(zhì)尿苷二磷酸-N-酰基-氨基葡萄糖和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸，二者在HA合酶的作用下交替的添加到HA分子鏈中[30]。來(lái)自C群的獸疫鏈球菌是獲取透明質(zhì)酸的主要來(lái)源[31]，由于其致病性和野生型菌株中的內(nèi)毒素等原因，在實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)野生型菌株進(jìn)行改良，通過(guò)非致病菌株生產(chǎn)HA已成為普遍做法[32]。對(duì)菌種進(jìn)行處理的手段主要有基因工程、誘變育種和原生質(zhì)體育種，JIN等[33]通過(guò)整合水蛭來(lái)源的透明質(zhì)酸水解酶LHyal基因，通過(guò)序列優(yōu)化和N-端融合His標(biāo)簽策略調(diào)控LHAase的表達(dá)，改良構(gòu)建枯草芽孢桿菌的HA合成途徑，獲得一株在3 L發(fā)酵罐發(fā)酵100 h時(shí)HA累積至19.38 g/L的高產(chǎn)菌株。韋朝寶等[34]在此基礎(chǔ)上選擇生產(chǎn)周期短、強(qiáng)度高的獸疫鏈球菌進(jìn)行構(gòu)建，獲得了能緩解發(fā)酵過(guò)程中溶氧問(wèn)題的高產(chǎn)菌株。目前，已在枯草芽孢桿菌[35]、乳酸菌[36]、谷氨酸棒桿菌[37]等不同宿主中通過(guò)異源表達(dá)HA合酶實(shí)現(xiàn)HA的合成。

3.2 透明質(zhì)酸的制備

3.2.1 動(dòng)物組織源透明質(zhì)酸制備 對(duì)于動(dòng)物組織來(lái)源HA的生產(chǎn)常采用組織提取法，完整的工藝流程包括預(yù)處理、提取、分離純化、干燥等，加工工藝已較為成熟，提取法工藝簡(jiǎn)單，提取到的多為大分子量HA[38]，粘度大，保濕性能好，主要用于醫(yī)藥和化妝品行業(yè)。提取方法主要有鹽提和酶提，無(wú)機(jī)鹽和酶的加入可以解除動(dòng)物組織中透明質(zhì)酸HA與蛋白質(zhì)的絡(luò)合，此外酶能水解蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)，利于HA的提取[39]。KALKANDELEN等[40]通過(guò)丙酮將組織勻漿脫脂、經(jīng)醋酸鈉溶液多次提取成功從雞冠中提取到HA。但組織提取法程序復(fù)雜，提取率較低，酶法提取因其高效性成為研究熱點(diǎn)，目前常用的提取的酶有中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等。üRGEOVá等[41]比較了胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶從蛋殼膜中提取HA的結(jié)果，結(jié)果表明胰蛋白酶比其他兩種酶更有效，在pH為8、37 ℃、胰蛋白酶用量為50 U/g酶解蛋殼膜時(shí)，HA提取率為44.82 mg/g蛋殼膜。為了獲得更好的提取效果，實(shí)驗(yàn)中常采用酶混合物或超聲等手段輔助提取，陳勝軍等[42]利用超聲（200 W，30 kHz）輔助胰蛋白酶和復(fù)合蛋白酶從羅非魚(yú)眼中提取、優(yōu)化后HA得率為11.44%，與單純酶解法相比得率約提高5%。

3.2.2 微生物源透明質(zhì)酸的制備 微生物發(fā)酵法工藝流程主要包括菌種培養(yǎng)、發(fā)酵、分離純化、干燥等。目前，提高微生物發(fā)酵法提取效果的研究主要集中在培育優(yōu)良菌株、選擇合適的培養(yǎng)基及優(yōu)化發(fā)酵條件。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基條件和發(fā)酵工藝條件進(jìn)行控制獲得高產(chǎn)量HA的研究已有很多，相比于組織提取法制備HA，微生物發(fā)酵法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于可以在發(fā)酵過(guò)程中調(diào)控HA的分子量，這也是目前關(guān)于HA發(fā)酵工藝研究的主要內(nèi)容。HA分子量的調(diào)控受到HA合成酶及其與底物結(jié)合的相對(duì)強(qiáng)度、HA前體物質(zhì)濃度與HA合酶濃度比例影響[43]。碳源產(chǎn)生的果糖-6-磷酸會(huì)被用來(lái)合成乳酸，抑制菌體生長(zhǎng)和HA合成，可以通過(guò)抑制與HA競(jìng)爭(zhēng)碳源的其他途徑（糖酵解途徑等），將更多碳源用于合成HA，增加HA產(chǎn)量和分子量[44]。代謝流的平衡可影響HA的分子量[45]，對(duì)溫度、通氣量、pH、攪拌速度等影響HA產(chǎn)量及分子量的發(fā)酵條件進(jìn)行了一定研究，如劉金龍等[46]研究了發(fā)酵條件對(duì)馬鏈球菌合成HA分子量的影響，分批培養(yǎng)發(fā)酵模式比葡糖糖補(bǔ)料培養(yǎng)模式更利于高分子量HA生成；在0~45%溶氧濃度范圍內(nèi)，相對(duì)分子質(zhì)量隨溶氧水平的增加增長(zhǎng)了109.4%；低溫有利于HA的合成，低溫下HA的產(chǎn)量和分子量都相對(duì)較高，在33 ℃時(shí)HA產(chǎn)量和分子量分別為4.41 g/L和2.54×106；pH對(duì)HA的產(chǎn)量和分子量具有不同的影響，pH為7時(shí)HA產(chǎn)量最高（3.72 g/L），pH為8時(shí)HA產(chǎn)量最低（3.01 g/L），但pH為8時(shí)取得了最大的分子量（2.38×106），說(shuō)明可以在生產(chǎn)過(guò)程中通過(guò)控制發(fā)酵工藝條件實(shí)現(xiàn)HA的高質(zhì)量生產(chǎn)。

動(dòng)物組織提取法和微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)HA最常用的兩種方法，組織提取法用于動(dòng)物組織中HA的提取，此法常在早期使用，提取過(guò)程復(fù)雜，HA產(chǎn)率較低，受到原料來(lái)源限制，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)酵法因成本低、產(chǎn)率高，易規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢(shì)成為工業(yè)生產(chǎn)HA的主流方法。隨著制備方法的不斷完善，人們對(duì)HA的生產(chǎn)需求逐漸從高產(chǎn)量轉(zhuǎn)向高品質(zhì)，目前的研究主要在于通過(guò)基因工程、誘變育種等方式生產(chǎn)特定分子量的HA以滿足HA在不同應(yīng)用中的需要，建立一種高效安全的HA制備方法以生產(chǎn)符合各種應(yīng)用場(chǎng)景的特定分子量HA將成為研究熱點(diǎn)。

3.3 透明質(zhì)酸的分離純化

無(wú)論組織提取法或發(fā)酵法，其提取的透明質(zhì)酸粗品中都含有一些蛋白質(zhì)、核酸及其他雜質(zhì)，需要進(jìn)行分離純化得到HA純品，按照分離純化的原理可大體分為沉淀、過(guò)濾、吸附三種方式。

3.3.1 沉淀 沉淀方式主要有季銨鹽沉淀和有機(jī)溶劑沉淀，季銨鹽純化法的原理是季銨鹽與HA在水溶液中所帶電荷不同，兩者在低鹽溶液中絡(luò)合沉淀，在高鹽溶液中解離溶解，從而達(dá)到除去不與HA絡(luò)合沉淀的雜質(zhì)的目的。常用的季銨鹽有溴代十六烷基吡啶（CPB）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、氯代十六烷基三甲基吡啶（CPC）和其他長(zhǎng)鏈季銨鹽[47]，該法提純的HA純度高，效果好，能除去不和季銨鹽絡(luò)合的雜質(zhì)。有機(jī)溶劑沉淀法主要通過(guò)影響介質(zhì)的介電常數(shù)，造成分子內(nèi)和分子間聚集，從而達(dá)到去除蛋白質(zhì)的目的[48]，相比于氯仿、丙酮等限制級(jí)試劑，乙醇因其安全性和低成本應(yīng)用較多，宋磊等[49]在乙醇粗提后對(duì)影響HA純度的因素進(jìn)行優(yōu)化結(jié)合板框過(guò)濾法得到含量為93.71%的高純度HA。CAVALCANTI等[50]探究了乙醇和發(fā)酵液比例對(duì)介電常數(shù)的影響，以及pH對(duì)HA純化的影響，在pH為4，乙醇發(fā)酵液比例2:1時(shí)，HA純度為55%，回收率為85%，有機(jī)溶劑沉淀用于HA初始純化具有良好效果。

3.3.2 過(guò)濾 過(guò)濾法原理主要是根據(jù)顆粒大小將其保留在多孔膜上，過(guò)濾法相比于有機(jī)溶劑沉淀沒(méi)有有機(jī)溶劑成本消耗，工藝簡(jiǎn)單，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，但單純使用過(guò)濾法蛋白質(zhì)去除效果不佳，隨著純化的進(jìn)行會(huì)出現(xiàn)孔堵塞的現(xiàn)象，限制了其在HA純化過(guò)程中的應(yīng)用。切向過(guò)濾或使用助濾劑可以很大程度減輕孔堵塞現(xiàn)象[51]，G?ZKE等[52]提出了一種膜過(guò)濾和電泳結(jié)合的電過(guò)濾技術(shù)，電場(chǎng)對(duì)HA的過(guò)濾有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，與常規(guī)過(guò)濾相比，相同實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，基于樣品滲透質(zhì)量的濃縮因子提高了近4倍，并且這種過(guò)濾方法不會(huì)對(duì)HA的分子結(jié)構(gòu)和平均分子量產(chǎn)生負(fù)面影響，為HA的下游純化工藝提供了新的可能。

3.3.3 吸附 吸附是依據(jù)化合物在多孔固體表面選擇性保留來(lái)進(jìn)行HA純化，常用的吸附劑有活性炭、樹(shù)脂、硅膠等?；钚蕴坑捎谄渚哂袕?qiáng)烈吸附蛋白質(zhì)核酸而對(duì)大分子量中性多糖吸附較弱的特點(diǎn)，是分離純化HA的理想材料。魏琳娜等[53]在提取高原鼢鼠組織中HA的工藝中采用乙醇沉淀結(jié)合活性炭吸附方法，提取到的HA回收率可達(dá)72.73%。CAVALCANTI等[50]研究發(fā)現(xiàn)不同pH下的HA結(jié)構(gòu)對(duì)沉淀性能具有重要影響，在pH為4時(shí)，HA的回收率為85%，pH為7時(shí)，HA的回收率為70%，在使用活性炭的過(guò)程中，調(diào)節(jié)合適的pH可使HA的回收率提高。電泳是一種廣泛使用的蛋白質(zhì)分離方法，其分離效率受到凝膠的影響，與其他操作相比，其HA純化效率較低。離子交換層析法也是在生物大分子提純中廣泛應(yīng)用的方法之一，該法純化溫和不引起分子結(jié)構(gòu)變化，但成本較高，需選擇合適的交換樹(shù)脂和交換條件，操作復(fù)雜，主要用于醫(yī)用級(jí)HA的生產(chǎn)。倪杭生等[54]采用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和經(jīng)組氨酸基團(tuán)修飾的強(qiáng)堿型陰離子樹(shù)脂串聯(lián)，HA粗品中的雜質(zhì)蛋白質(zhì)在偏酸性溶液中與強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換劑發(fā)生交換吸附而被純化，以氯化鈉溶液洗脫，得到的HA精品的蛋白質(zhì)含量低于0.075%，平均分子量大于9.41×105，純化重量收率為58%~61%。

分離純化是制備高純度、高品質(zhì)HA必不可少的步驟，目前關(guān)于HA的純化方面的研究中，對(duì)于純化過(guò)程中各種純化操作對(duì)HA純度變化的研究?jī)?nèi)容較少，CAVALCANTI等[51]以HA或蛋白質(zhì)在溶液中的百分比表示純化程度，總結(jié)了純化過(guò)程中HA純度的變化，來(lái)源于獸疫鏈球菌的HA發(fā)酵液首先經(jīng)異丙醇沉淀操作后蛋白質(zhì)含量為14.1%，經(jīng)硅膠吸附操作后蛋白質(zhì)含量為4.5%，經(jīng)過(guò)濾與吸附作用相結(jié)合的木炭過(guò)濾器組件作用后蛋白質(zhì)含量?jī)H為0.6%，最后經(jīng)透析過(guò)濾操作蛋白質(zhì)含量可達(dá)0.06%。各種分離純化方法都有其優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中常根據(jù)原料來(lái)源及終端產(chǎn)品的不同要求對(duì)幾種分離純化方法進(jìn)行合理組合以達(dá)到分離純化最大效果。

4 透明質(zhì)酸的應(yīng)用

4.1 食品領(lǐng)域的應(yīng)用

HA在日本食品市場(chǎng)應(yīng)用廣泛，除保健類(lèi)食品外，在普通食品如飲料、軟糖、果醬中也得到了廣泛的應(yīng)用。在美國(guó)食品市場(chǎng)，HA主要作為膳食補(bǔ)充劑使用[55]。目前，我國(guó)含HA的產(chǎn)品主要是保健食品，主要功效為改善皮膚水分，查圣華等[56]以透明質(zhì)酸鈉為主要原料研制了一種燕窩罐頭可有效提高皮膚水分，并無(wú)其他不良反應(yīng)，市面上類(lèi)型主要有膠囊型，口服型，沖劑型等。HA經(jīng)口服消化吸收后，體內(nèi)HA合成的前體增加，使體內(nèi)HA含量提高并集中定位于皮膚組織，進(jìn)而增強(qiáng)皮膚的保水能力，軟化皮膚角質(zhì)層，進(jìn)一步改善肌膚彈性和減少皺紋[57]。

4.2 化妝品及日用品中的應(yīng)用

HA大量存在于人體及其它生物組織中，具有極強(qiáng)的保濕性能，在化妝品中主要作為保濕劑、增稠劑、乳化劑[58?59]使用。目前，市場(chǎng)上幾乎全部種類(lèi)的化妝品配方中都含有HA。HA易在皮膚上形成水化膜提升皮膚潤(rùn)滑感，可促進(jìn)皮膚對(duì)活性物質(zhì)的吸收，膜的形成在一定程度上有隔離細(xì)菌作用，利于皮膚消炎及修護(hù)，延緩皮膚老化[60]。HA為皮膚組織本身存在的成分有更高的安全性。此外，由于HA在口腔中具有抗炎修復(fù)作用，添加到牙膏中能起到一定的保濕和功效作用[61]，HA在日用品中的應(yīng)用在不斷擴(kuò)展與深入。

4.3 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

HA作為關(guān)節(jié)滑液的重要組分，在關(guān)節(jié)的保護(hù)方面發(fā)揮著重要的生理功能，HA在關(guān)節(jié)中的合成或代謝異常就可導(dǎo)致關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生，此時(shí)可通過(guò)注射外源性HA對(duì)關(guān)節(jié)滑液進(jìn)行補(bǔ)充，改善關(guān)節(jié)生理功能[62]。由于HA獨(dú)特的理化性質(zhì)和生物相容性，被廣泛用于視網(wǎng)膜、白內(nèi)障等相關(guān)眼科手術(shù)中。HA在醫(yī)美整形中作為填充劑進(jìn)行皮下注射以達(dá)到消除面部皺紋、疤痕，使面部飽滿的效果[63]。HA噴霧可用于患者面部激光術(shù)后的修復(fù)治療，能有效恢復(fù)皮膚屏障損傷[64]。HA衍生物在眼用制劑方面也得到廣泛的應(yīng)用，如HA鈉可以代替淚液黏性蛋白的作用，用于干眼病的治療緩解干眼不適癥狀[65]。研究發(fā)現(xiàn)很多疾病發(fā)生時(shí)體內(nèi)HA含量會(huì)出現(xiàn)升高現(xiàn)象，所以臨床上可通過(guò)檢測(cè)HA在血清中的含量水平，來(lái)反映出各種疾病的變化，對(duì)輔助診斷等具有重要的意義。

HA在食品、化妝品、日用品及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其在功能性護(hù)膚品、眼科、骨科等方面的應(yīng)用已比較成熟，在食品領(lǐng)域應(yīng)用中還存在巨大潛力，口服HA相比于外敷注射更加溫和，更能由內(nèi)而外激發(fā)活力，2021年1月，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)批準(zhǔn)透明質(zhì)酸作為新資源食品原料在普通食品中添加，這表明HA在食品領(lǐng)域的應(yīng)用將迎來(lái)大規(guī)模的增長(zhǎng)。此外，HA分子存在很多修飾位點(diǎn)，對(duì)其活性基團(tuán)進(jìn)行修飾如交聯(lián)、酯化、接枝等使其具有更好的理化性質(zhì)和抗酶解能力[66]，可使HA應(yīng)用在更加復(fù)雜的環(huán)境中。隨著技術(shù)的進(jìn)步，HA在各領(lǐng)域中的應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越深入。

5 結(jié)論與展望

HA具有重要的理化性質(zhì)和生理功能，其覆蓋領(lǐng)域廣，市場(chǎng)需求量大，全球HA原料銷(xiāo)量呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。目前，工業(yè)制備HA的方法主要是動(dòng)物組織提取法和微生物發(fā)酵法，微生物發(fā)酵法具有成本低、易大批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，但有些產(chǎn)品被檢測(cè)出有毒性，目前微生物發(fā)酵法研究的重點(diǎn)在于通過(guò)基因工程或誘變育種培育優(yōu)良菌株以及通過(guò)調(diào)控發(fā)酵工藝獲得高品質(zhì)HA。雖然組織提取法有原料來(lái)源受限以及生產(chǎn)成本高等不足，但近年來(lái)關(guān)于提取法的研究中用到的原料主要為雞頭、魚(yú)頭、魚(yú)眼等副產(chǎn)物及加工產(chǎn)生的廢棄物，這些廢棄物組織中含有豐富的HA，利用這些廢棄物為原料可避免資源浪費(fèi)、保護(hù)環(huán)境、又可降低生產(chǎn)成本、滿足市場(chǎng)需求，并能為一些低附加值的產(chǎn)業(yè)提供更多選擇。隨著HA應(yīng)用場(chǎng)景的不斷拓展，市場(chǎng)需求量的不斷增長(zhǎng)，建立一種高效安全的HA提取純化工藝，對(duì)HA分子進(jìn)行修飾以生產(chǎn)符合不同應(yīng)用場(chǎng)景的特定分子量HA將成為研究熱點(diǎn)。