林子豪，毛新武，周慶瓊，崔世博，陳羽中，戚 平, ，錢振杰，曾 瑋

（1.廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 511400；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510641；3.沃特世科技（上海）有限公司，上海 201203）

合成色素著色力強(qiáng)、價(jià)格便宜、穩(wěn)定性好[1]，常用于食品中色澤的增強(qiáng)。但合成色素主要以苯、甲苯等工業(yè)原料，經(jīng)磺化、偶氮化等一系列有機(jī)反應(yīng)制得，進(jìn)入人體吸收后會(huì)在體內(nèi)分解成潛在的致癌物質(zhì)，對人體造成不同程度的傷害[2]。合成色素按結(jié)構(gòu)可以分為偶氮類、芳甲烷類、蒽醌類、雜環(huán)類、菁類、靛類等[3]。自2008年以來，我國陸續(xù)發(fā)布了1~5批《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》，公布了部分非食用色素名單。根據(jù)GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[4]，我國僅允許使用日落黃等11種酸性合成色素，并規(guī)定了使用限量。國際《食品添加劑通用法典標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了食品中僅允許使用胭脂紅、赤蘚紅、日落黃、莧菜紅、堅(jiān)牢綠、亮藍(lán)、靛藍(lán)、誘惑紅等8種酸性合成色素[5]。但合成色素種類繁多，不法商人在非食用色素的使用上層出不窮，給食品安全帶來隱患[6?7]。

目前，合成色素的監(jiān)督檢測主要關(guān)注蘇丹紅[8]、羅丹明[9]等堿性非食用色素以及胭脂紅、日落黃等酸性可食用色素[10?11]，酸性非食用色素的監(jiān)測存在盲區(qū)。酸性色素檢測方法的現(xiàn)有報(bào)道主要有液相色譜法[12?16]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[17?23]。液相色譜法在面對調(diào)味醬等復(fù)雜基質(zhì)樣品時(shí)容易受到天然色素的干擾，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法特異性強(qiáng)、靈敏度高，適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中酸性合成色素的高通量檢測。本研究以調(diào)味醬為研究對象，優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件和前處理方法，建立85種酸性合成色素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜篩查方法，為合成色素的監(jiān)管提供技術(shù)支撐保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、甲酸銨、乙酸銨 色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司；0.22 μm聚四氟乙烯濾膜 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；喹啉黃（純度99.50%）、偶氮玉紅（純度92%）、酸性紅60、酸性橙10、日落黃（純度90%）、鉻變素2R、鉻變素2B、酸性黃17、滂酰洋紅2B（純度93.0%）、酸性紅13、酸性紅17、熒光素鈉、滂酰紫6R、酸性紅265（純度95.0%）、酸性紅87（純度90.0%）、酸性紅52、酸性紫49、酸性紫34、酸性紅9、酸性紅 88、酸性紅92（純度85.0%）、酸性紅94、酸性紅151、直接黃8、酸性橙 6、酸性綠50、酸性藍(lán)92、酸性綠16、酸性橙20、二甲苯青FF、藏花橙 G、酸性綠9、酸性橙17、酸性藍(lán)83、酸性藍(lán)90、酸性綠27（純度75.0%）、酸性黑1（純度97.0%）、酸性黃36（純度98.0%） 日本TCI公司；酸性紅44、酸性紅66（純度60%）、剛果紅（純度98.0%）、酸性紅71、麗春紅3R、酸性黃9（純度95%）、酸性紫7（純度40%）、酸性紅50（純度60%）、酸性橙8（純度65%）、酸性藍(lán)113（純度50%） 美國Sigma公司；酸性紫3、甲基橙（純度98.0%）、酸性綠A（純度97.0%）、酸性紅289、酸性蘭27（純度98%）、酸性藍(lán)3 德國CNW公司；檸檬黃（純度90.0%）、新紅（純度92.0%）、靛藍(lán)（純度89%）、堅(jiān)牢綠（純度94.9%）、胭脂紅SX（純度90.5%）、酸性藍(lán)1（純度100.0%）、酸性黃11（純度74.6%）、酸性紫9（純度72.0%）、酸性藍(lán)62（純度91.6%）、酸性橙II（純度94%） 德國Dr.Ehrenstorfe GmbH公司；酸性紅33、酸性綠41、食品紅105 美國IL公司；酸性棕14（純度98%）、顏料紅49（純度98%） 上海damas-beta公司；酸性藍(lán)7、乙基曙紅

美國Chemservice公司；溶劑藍(lán)37 美國Santa Cruz公司；酸性黑210 上海麥克林生化科技有限公司；莧菜紅（濃度0.5 mg/mL）、胭脂紅（濃度0.5 mg/mL）、亮藍(lán)（濃度0.5 mg/mL） 中國計(jì)量科學(xué)研究院；誘惑紅（濃度1.0 mg/mL）、赤蘚紅（濃度1.0 mg/mL） 北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司；酸性紅26（純度96.0%）、色酚黃S、食品黑1（純度96.0%）、酸性紅1（純度98.0%）、橙黃IV（批號：BCBJ7871V）、酸性紅73（純度97.0%） 美國FLUKA公司；酸性藍(lán)41（純度98%） 上海金錦樂實(shí)業(yè)有限公司；番茄醬、辣椒醬等50批次樣品 購自廣州市某幾十個(gè)大型超市和生產(chǎn)企業(yè)。

Waters Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Waters公司；M37610-33CN旋渦振蕩混合器 美國Thermo Fisher Scientific公司；BSA2202S電子天平 德國Sartorius公司；Allegra X-30R冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 檸檬黃、酸性紅33、食品黑1、溶劑藍(lán)37、酸性黑210、酸性綠9、酸性紅289、酸性綠41、酸性紫34、顏料紅49、酸性紅92、酸性紅94、食品紅105、酸性藍(lán)83、酸性藍(lán)90等15種化合物：準(zhǔn)確稱取0.05 g標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL，得到5.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；移取適量各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇稀釋，得到濃度為100.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液1。

其余化合物：準(zhǔn)確稱取0.05 g標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至50 mL，得到1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；移取適量各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇稀釋，得到濃度為10.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液2。

1.2.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品（精確至0.01 g）放置于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，于旋渦振蕩混合器上渦旋5 min，以10000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液；殘?jiān)?0 mL甲醇重復(fù)提取一次，合并上清液。取2 mL上清液置于5 mL離心管中，加入200 mg C18凈化劑，旋渦1 min后，10000 r/min離心5 min，得到提取液1（以1 g為基準(zhǔn)，樣品稀釋10倍）。吸取1 mL提取液1，用水稀釋至10 mL，得到提取液2（以1 g為基準(zhǔn)，樣品稀釋100倍），過膜后待測[24]。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm, 1.8 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流速：0.4 mL/min；流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B為甲醇；梯度：0~1 min，2%B；1~15 min，2%~95%B；15~18 min，95%B；18~21 min，95%~2%B[25]。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 離子化模式：ESI-；電噴霧離子源溫度為150 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測模式；毛細(xì)管電壓為2.5 kV；脫溶劑氣溫度為500 ℃；脫溶劑氣流量為1000 L/h；錐孔氣流量為150 L/h；碰撞氣（氬氣）壓力為0.05 MPa[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

方法重復(fù)性及回收率試驗(yàn)均做6次重復(fù)試驗(yàn)，采用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析，儀器數(shù)據(jù)采集軟件為MassLynx 4.1，數(shù)據(jù)分析軟件為TargetLynx 3.12。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別配制濃度為1.0 μg/mL的各化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，儀器進(jìn)樣自動(dòng)優(yōu)化各化合物母離子、子離子、碰撞能量、錐孔電壓等參數(shù)，各優(yōu)化參數(shù)見表1。由于酸性色素為多鈉鉀鹽化合物，在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，離子峰類型均表現(xiàn)為[M-mNa/K+nH]（m-n）-，電荷數(shù)從1~4不等。對于一鈉和二鈉鹽化合物，除雜環(huán)類的二鈉鹽外，離子峰類型表現(xiàn)為失去所有的鈉；對于三鈉或以上鹽化合物，離子峰類型表現(xiàn)為失去所有的鈉后加上一個(gè)氫離子。

表1 85種酸性色素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 85 acid pigments

續(xù)表 1

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于酸性色素多為極性較強(qiáng)的離子型化合物，因此在流動(dòng)相中添加適量的緩沖鹽能有效增強(qiáng)化合物的保留效果并改善峰型[27]?？疾炝?00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液在甲醇-5 mmol/L乙酸銨和甲醇-5 mmol/L甲酸銨兩種流動(dòng)相體系下各化合物的響應(yīng)情況，結(jié)果表明，大部分化合物在甲醇-5 mmol/L乙酸銨的流動(dòng)相體系下色譜峰響應(yīng)較高（見圖1），因此，本研究采用甲醇-5 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相。85種酸性色素的總離子流圖如圖2所示。

圖1 兩種流動(dòng)相的化合物響應(yīng)值比較Fig.1 Comparison of response between two mobile phase

圖2 85種酸性色素的總離子流圖Fig.2 TIC chromatogram of 85 acid pigments

以保留時(shí)間最小的檸檬黃為對象，考察了1、2、4、6、8、10 μL等不同進(jìn)樣量對色譜峰峰型的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)進(jìn)樣量在4 μL以上時(shí)，色譜峰開始出現(xiàn)明顯的分叉，表現(xiàn)出較強(qiáng)的溶劑效應(yīng)。因此，本研究選擇2 μL作為進(jìn)樣量。

圖3 不同進(jìn)樣量對檸檬黃色譜峰的影響Fig.3 Influence of different injection volume on tartrazine

2.3 前處理方法的優(yōu)化

由于調(diào)味醬基質(zhì)復(fù)雜，樣品提取后，提取液中含有大量的共提取物，在質(zhì)譜測定時(shí)共流出，使待測物的信號發(fā)生增強(qiáng)或減弱，因此需要對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行消除。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)控制在?20%~20%的范圍內(nèi)時(shí)[28]，可以認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)較弱，基本不影響樣品定量。消除基質(zhì)效應(yīng)常見的方法有配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、采用內(nèi)標(biāo)法定量等。但由于食品種類繁多，配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)需要耗費(fèi)大量的時(shí)間；色素品種較多內(nèi)標(biāo)物較少，難以對所有色素進(jìn)行覆蓋。因此，本研究在保證靈敏度的前提下，采用增大提取液稀釋倍數(shù)的方式降低基質(zhì)效應(yīng)。分別以提取液1和提取液2作溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用計(jì)算公式（B/A?1）×100計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，其中B為基質(zhì)曲線斜率，A為相應(yīng)的溶劑曲線斜率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)稀釋倍數(shù)為100倍時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)有了明顯的下降（圖4），同時(shí)100倍稀釋也減少了溶劑效應(yīng)的干擾。

圖4 稀釋10倍與稀釋100倍基質(zhì)效應(yīng)比較Fig.4 Comparison of matrix effect between diluted 10 times and 100 times

2.4 方法學(xué)評估

將85種色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成系列濃度（檸檬黃、酸性紅33、食品黑1、溶劑藍(lán)37、酸性黑210、酸性綠9、酸性紅289、酸性綠41、酸性紫34、顏料紅49、酸性紅92、酸性紅94、食品紅105、酸性藍(lán)83、酸性藍(lán)90線性范圍為100~1000 ng/mL，其余為10~100 ng/mL，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作校正曲線，結(jié)果如表2所示。以信噪比（S/N=3）計(jì)算85種色素的檢出限，檢出限在8.08~885.2 μg/kg之 間，定 量 限 在26.94~2950.7 μg/kg之間。按照實(shí)驗(yàn)測定步驟，選取空白基質(zhì)，以高（25/2.5 mg/kg）、中（10/1.0 mg/kg）、低（5/0.5 mg/kg）3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。結(jié)果表明，85種酸性色素的回收率為70.2%~116.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%~15.0%。該方法回收率和重復(fù)性良好，滿足日常檢測需求。

表2 85種酸性色素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和回收率Table 2 Linear range, correlation coefficients (r), limits of detections (LODs), limits of quantification (LOQs) and recoveries of 85 acid pigments

2.5 實(shí)際樣品檢測

按照實(shí)驗(yàn)方法，對市售的番茄醬、辣椒醬等樣品共計(jì)50批次進(jìn)行檢測，在2批次樣品中篩查出酸性紅13、酸性橙II等禁止使用的色素（見表3），但含量較低，推測是使用了工藝較差的可食用色素作為原料。

表3 調(diào)味醬篩查結(jié)果Table 3 Screening result of sauce

續(xù)表 2

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜結(jié)合質(zhì)譜法對調(diào)味醬中85種酸性合成色素進(jìn)行檢測，優(yōu)化了流動(dòng)相、進(jìn)樣量等色譜條件以及質(zhì)譜條件，采用增大稀釋倍數(shù)的方式降低基質(zhì)效應(yīng)，建立了一個(gè)快速簡便的通用型分析方法。與現(xiàn)有固相萃取方法相比[10?11]，本方法采用QuEChERS凈化技術(shù)，操作較簡便；與其他高通量分析方法相比[20?23]，本方法通過優(yōu)化前處理方法，減少配制基質(zhì)曲線的步驟，在日常監(jiān)督檢測時(shí)可提高檢測效率。本方法通用性強(qiáng)，檢測對象范圍較廣，分析時(shí)間短，靈敏度高，為食品中合成色素的監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障。