張富坤，孫 媛，高藝菲，王 嬌，高世杰，趙 盼，柯仲成 ，趙東升,

（1.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學實驗中心，山東濟南 250355；3.黃山學院化學化工學院，安徽黃山 245041）

柿葉為柿樹科柿樹屬植物柿（Diospyros kakiThunb.）的干燥葉，入藥最早見于《滇南本草》[1]，目前已作為一種天然食品添加劑廣泛用于食品生產(chǎn)，如糖果、茶飲、餅干等[2]。柿葉中富含黃酮、多糖、萜類、多酚及香豆素等多種對人體健康有益的成分[3?4]。黃酮類化合物為柿葉中主要成分之一，在抗氧化、抗菌、抗衰老、調(diào)節(jié)血壓等方面具有顯著療效[5?6]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，外源性抗氧化劑可清除活性氧及自由基，防治氧化應激給機體帶來的損傷[7]。柿葉抗氧化效果顯著，已成為天然抗氧化劑研究和開發(fā)的熱點之一。

目前，傳統(tǒng)有機溶劑在天然活性成分的提取工藝研究中占主導地位，但存在溶劑消耗量大、提取率低等問題。表面活性劑作為一種新型綠色、環(huán)保的提取劑，因具有降低固/液表面張力、增加成分溶出、縮短提取時間、減少有機試劑用量等優(yōu)點，而被廣泛應用于天然活性成分提取工藝研究中[8?10]。國內(nèi)雖已有學者利用超聲提取法[5,11?12]或復合酶協(xié)同超聲法[13]對柿葉總黃酮的提取工藝進行研究，但將超聲提取技術(shù)和表面活性劑相結(jié)合提取柿葉總黃酮的研究鮮有報道。同時，僅憑借柿葉總黃酮含量高低對提取工藝進行評價具有一定的局限性，若能將總黃酮得率與生物活性相整合則可綜合全面地評價其提取工藝[14?15]。因此，本試驗在盧鑫等[5]前期研究的基礎上，采用表面活性劑協(xié)同超聲提取技術(shù)，以總黃酮得率和抗氧化活性為雙指標參數(shù)的響應面法優(yōu)化柿葉總黃酮提取工藝，旨在為柿葉黃酮類成分資源的深入研究開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柿葉（河北易縣） 安國市御顏坊中藥材有限公司，山東中醫(yī)藥大學孫稚穎教授鑒定為柿樹科柿樹屬植物柿的干燥葉；蘆丁標準品（批號B20771） 上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2picryl-hydrazyl，DPPH，純度大于97%）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、吐溫80（Tween-80） 均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇 分析純，天津市富宇精細化工有限公司；氫氧化鈉 分析純，天津市匯杭化工科技有限公司；亞硝酸鈉 分析純，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；硝酸鋁 分析純，天津市大茂化學試劑廠。

KQ-500GVDV雙頻恒溫數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；ST16R高速冷凍離心機

賽默飛世爾科技（中國）有限公司；GFL-230電熱鼓風干燥箱 天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；QE-300高速離心機 浙江屹立工貿(mào)有限公司；FA1204B電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；UV 9100 B紫外可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柿葉總黃酮的提取

1.2.1.1 樣品預處理 取適量柿葉藥材，置于50 ℃烘箱中，干燥6 h至恒重，用打粉機粉碎，過三號篩，即得柿葉粉末。

1.2.1.2 柿葉總黃酮的提取 參照劉釗等[9]報道的方法，精確稱取柿葉粉末0.20 g，置于15 mL離心管中，按照一定的液料比加入一定體積的溶劑，在一定溫度下進行超聲（固定頻率45 kHz）提取，在溫度25 ℃和轉(zhuǎn)速13000 r/min下離心15 min，取上清液作為總黃酮提取液。

1.2.2 單因素實驗 在前期研究報道的基礎上，固定乙醇濃度70%，超聲功率350 W[5]，分別考察表面活性劑種類、表面活性劑質(zhì)量分數(shù)、液料比、超聲時間、超聲溫度五個因素對柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.1 不同表面活性劑種類對柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 準確稱取柿葉粉末0.20 g，在表面活性劑含量0.5%、液料比20:1（mL/g）、超聲溫度30 ℃、超聲時間10 min的條件下，探究非離子型表面活性劑—吐溫80（Tween-80）、陰離子型表面活性劑—十二烷基硫酸鈉（SDS）、陽離子型表面活性劑—十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、70%乙醇對柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.2 SDS質(zhì)量分數(shù)對柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 準確稱取柿葉粉末0.20 g，在液料比20:1（mL/g）、超聲時間10 min、超聲溫度30 ℃、乙醇體積分數(shù)70%條件下，探究SDS質(zhì)量分數(shù)為0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%對柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.3 液料比對柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 準確稱取柿葉粉末0.20 g，在SDS質(zhì)量分數(shù)0.5%、超聲時間10 min、超聲溫度30 ℃、乙醇體積分數(shù)70%的條件下，探究液料比為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1（mL/g）對柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.4 超聲時間對柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 準確稱取柿葉粉末0.20 g，在SDS質(zhì)量分數(shù)0.5%、液料比20:1（mL/g）、超聲溫度30 ℃、乙醇體積分數(shù)70%的條件下，探究超聲時間為5、10、15、20、25 min對柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.5 超聲溫度對柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 準確稱取柿葉粉末0.20 g，在SDS質(zhì)量分數(shù)0.5%、液料比20:1（mL/g）、超聲時間10 min、乙醇體積分數(shù)70%的條件下，探究超聲溫度為30、40、50、60、70 ℃對柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響。

1.2.3 響應面試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果和文獻報道[5]，選擇影響較大的三個因素為自變量，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，以柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率為雙響應值，進行提取工藝優(yōu)化。響應面試驗分析因素水平設計見表1。

表1 響應面試驗分析因素水平設計Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 總黃酮的測定 參照秦晶晶等[11]報道的柿葉總黃酮測定方法，并稍作修改。依次吸取系列蘆丁對照品溶液，分別置于10 mL容量瓶，加水至2.5 mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加4%氫氧化鈉溶液6 mL，加乙醇至刻度，搖勻，靜置15 min，于510 nm處測定吸光度A。以A為縱坐標，濃度C（mg/mL）為橫坐標，測得標準曲線方程為A=11.646C+0.0003，相關系數(shù)r=0.9996，表明蘆丁在0~0.05 mg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好線性關系。

取提取液0.1 mL，加水至2.5 mL，按上述方法測定，計算柿葉總黃酮得率。公式如下：

式中：C為根據(jù)回歸方程計算得到的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；n為樣品稀釋倍數(shù)；m為柿葉粉末質(zhì)量，g。

1.2.4.2 DPPH自由基清除率的測定 參照文獻報道的DPPH自由基清除率測定方法[11]。取提取液1 mL，加入無水乙醇，稀釋至25 mL。取2 mL稀釋液，加入0.1 mg/mL的DPPH溶液2 mL，混合搖勻，室溫避光反應30 min，于517 nm測定吸光度A。

式中：A空白為2 mL DPPH溶液加入2 mL乙醇溶液的吸光度；A樣品為2 mL DPPH溶液加入2 mL柿葉樣品稀釋液的吸光度；A對照為2 mL柿葉樣品稀釋液加入2 mL無水乙醇的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗操作均重復3次，結(jié)果以平均值±SD表示。采用軟件SPSS26.0、Design-Expert 8.0.6進行數(shù)據(jù)分析和繪圖。方差分析中P<0.05表示差異具有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 表面活性劑的種類對總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 從圖1可知，不同類型表面活性劑破壞細胞膜的能力不同，導致提取成分的含量也存在一定的差異[9]，Tween-80總黃酮得率和DPPH自由基清除率最低，SDS總黃酮得率和DPPH自由基清除率最高，CTAB和70%乙醇次之。因此，實驗選擇SDS作為表面活性劑。

圖1 表面活性劑種類對總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of surfactant types on yield of total flavonoids and radical scavenging rate of DPPH

2.1.2 SDS含量對總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 從圖2可知，SDS含量在0.0%~0.5%之間，總黃酮得率呈上升趨勢；當SDS質(zhì)量分數(shù)為0.5%時，總黃酮得率最高，存在明顯差異；SDS含量在0.5%~2%之間，總黃酮得率呈下降趨勢。這與前期報道的現(xiàn)象一致，隨著SDS含量的增加，溶液中形成的膠束數(shù)目增多，對柿葉總黃酮的增溶作用加大[16]，當SDS含量增加到一定數(shù)值時，膠束形態(tài)發(fā)生改變，總黃酮得率不再增加，而對其他成分起到較強增溶作用[17]，導致總黃酮得率有所下降。對于DPPH自由基清除率，其變化趨勢與總黃酮得率一致。綜合考慮，SDS質(zhì)量分數(shù)為0.5%較為合適。

圖2 SDS含量對總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of SDS content on yield of total flavonoids and radical scavenging rate of DPPH

2.1.3 液料比對總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 從圖3可知，柿葉總黃酮得率隨液料比的增大而增加，在20:1 mL/g時達到最高值，之后再增大液料比總黃酮得率反而降低。隨著液料比的增加，雖然增大了提取溶劑與柿葉粉末的接觸面積，其他雜質(zhì)、色素的溶出也增多[18?19]，使得總黃酮得率出現(xiàn)了下降的趨勢。從DPPH清除率角度來看，其變化趨勢與總黃酮得率呈現(xiàn)一致性。從節(jié)約成本并保證清除率的角度綜合考慮，選擇液料比為20:1 mL/g。

圖3 液料比對總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on rate of total flavonoids and radical scavenging rate of DPPH

2.1.4 超聲時間對總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 由圖4可知，隨著超聲時間的延長，柿葉總黃酮得率與DPPH清除率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在超聲時間10 min時達到最大值，這與前期報道的超聲提取柿葉總黃酮工藝相比，大大縮短了提取時間[5,13]。隨著超聲時間的延長，柿葉總黃酮得率增加，但空化效應減弱，柿葉對總黃酮的吸附能力增強[20?21]，從而對DPPH自由基的清除能力也有所減弱。因此，從柿葉總黃酮得率和DPPH清除率角度綜合考慮，確定超聲時間為10 min。

圖4 超聲時間對總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on yield of total flavonoids and radical scavenging rate of DPPH

2.1.5 超聲溫度對總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響 從圖5可知，隨著溫度的升高，總黃酮得率和DPPH清除率均呈現(xiàn)下降的趨勢，溫度在30 ℃時為最高點，40~60 ℃相對平穩(wěn)，70 ℃時明顯下降。此現(xiàn)象與前期研究結(jié)果相一致，溫度過高會破壞黃酮的結(jié)構(gòu)，使形成的部分膠束發(fā)生離解，導致增溶能力下降[22]。因此，從降低能耗和保證DPPH自由基清除率的角度綜合考慮，選擇超聲溫度為30 ℃。

圖5 超聲溫度對總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on yield of total flavonoids and radical scavenging rate of DPPH

2.2 響應面試驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型建立與方差分析 在單因素實驗結(jié)果分析基礎上，選取SDS含量（A）、液料比（B）、超聲時間（C）為自變量，總黃酮得率（Y1）和DPPH自由基清除率（Y2）為響應值，運用Box-Behnken設計原理進行三因素三水平的試驗設計（表2）。運用Design-Expert 11.0軟件對雙響應面進行分析，得到Y(jié)1和Y2的回歸方程分別為：

表2 雙響應面分析設計及結(jié)果Table 2 Design and results of double response surface analysis

由表3和表4可知，兩模型均達到極顯著水平（P<0.01），且失擬項不顯著（P>0.05），說明模型擬合效果較好，無失擬因素存在。總黃酮得率和DPPH自由基清除率的模型決定系數(shù)分別為R2=0.9779、R2=0.9695，說明該模型擬合度較好，可以用于表面活性劑輔助超聲提取柿葉總黃酮提取工藝的初步和預測。變異系數(shù)CV%是衡量每個測量平均值偏離真實情況的參數(shù)，兩個模型的變異系數(shù)分別為1.44%和1.70%，均小于5%，說明模型的實驗操作可信、重復性較好[23]。

表3 柿葉總黃酮得率的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance on the extraction rate of total flavonoids from persimmon leaves

表4 DPPH自由基清除率的方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance on the radical scavenging rate of DPPH

總黃酮得率和DPPH自由基清除率的分析結(jié)果顯示，一次項A、B、C與二次項A2、B2均達到顯著水平（P<0.05）。通過對F值的比較，各因素對總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響程度均為SDS含量（A）>超聲時間（C）>液料比（B）。其中A、B和C因素以及A2、B2對柿葉總黃酮得率和DPPH自由基清除率的影響具有顯著性意義（P<0.05），而各因素交互作用AB、BC、AC的影響均不具有顯著性（P>0.05）。

2.2.2 響應面最佳工藝預測及驗證實驗 通過Design Expert11.0.0軟件的分析優(yōu)化，得到的最佳提取工藝理論值為SDS含量0.63%，液料比22.07:1 mL/g，超聲時間7.28 min，此時柿葉總黃酮得率的理論值為103.73 mg/g，DPPH自由基清除率理論值為65.47%。為了便于操作，實際操作時將最優(yōu)條件調(diào)整為SDS含量0.6%，液料比22:1 mL/g，超聲時間7.3 min，在此優(yōu)化條件下重復實驗3次，得到柿葉總黃酮得率的實際值為（103.63±0.10）mg/g，DPPH自由基清除率為（65.35%±0.12%），與理論值無顯著性差異（P>0.05），說明此方法可行。這與前期僅采用超聲提取柿葉總黃酮工藝的研究[5,13]結(jié)果相比，表面活性劑大大提高了總黃酮的提取效率。

3 結(jié)論

本研究以總黃酮得率和DPPH自由基清除率為雙指標參數(shù)，將化學成分與生物活性進行有機整合，采用雙響應面法優(yōu)化表面活性劑輔助超聲提取柿葉總黃酮工藝。表面活性劑的加入使得柿葉總黃酮提取效率和DPPH自由基清除率大大提高，縮短了提取時間，并且用量較低，具有經(jīng)濟和綠色的雙重效果。所得最佳提取工藝參數(shù)穩(wěn)定可行，有利于柿葉總黃酮作為天然抗氧化劑在飲品、藥品、化妝品和食品等領域的推廣應用，為功能性柿葉產(chǎn)品的深入研究與開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。同時，本研究中仍存在一些尚待解決的問題，需先采用質(zhì)譜對總黃酮粗提物中化學成分進行定性分析，再利用HPLC對其所含主要黃酮化合物進行定量分析，將為后續(xù)進一步從柿葉資源中分離、純化天然抗氧化劑提供一定的指導作用。