文愉熙，黃曉舟 ，林曉思

（1.泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院，福建泉州 362000；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；3.福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建泉州 362000）

裸藻是體長(zhǎng)約50 μm的微藻類生物，它可以邊進(jìn)行光合作用邊運(yùn)動(dòng)[1]。裸藻含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、葉綠素、DHA、EPA等，共59種營(yíng)養(yǎng)素，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值超越其他所有藻類，完勝冬蟲(chóng)夏草、靈芝等生物，它可以全面的補(bǔ)充人體所需的營(yíng)養(yǎng)[2]。裸藻作為一種新食品原料，在日本已成為一種必需的營(yíng)養(yǎng)添加劑，廣泛地應(yīng)用于健康食品、保健品和天然調(diào)味料中[3?4]。近年來(lái)，裸藻因其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及其生物活性代謝物而被廣泛研究。

海藻中富含各種高分子多糖，這些多糖可分為非水溶性和水溶性兩類[5]。先前的研究發(fā)現(xiàn)，藻類中水溶性多糖的結(jié)構(gòu)新穎，活性多樣，如抗癌、抗凝血、抗氧化、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫等[6]。并且由于來(lái)源和結(jié)構(gòu)（單糖組成、糖苷鍵和分子量等）的不同，藻類多糖的生物活性也有很大差異[7]。除裸藻外，其他藻類非水溶性多糖研究較少，裸藻副淀粉（非水溶性多糖）是裸藻體內(nèi)特有的儲(chǔ)存多糖，它是具有特定類型的β-1-3-葡聚糖，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)免疫治療痛風(fēng)、降低膽固醇、調(diào)節(jié)血糖和抗氧化等作用[8]。裸藻副淀粉具有顯著的細(xì)胞因子相關(guān)免疫增強(qiáng)和免疫刺激作用，可以作為一種安全有效的輔助調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)反應(yīng)的天然因子[8]。此外，當(dāng)加入到飲食中時(shí)，它具有降低膽固醇的作用，并參與調(diào)節(jié)人類餐后血糖和胰島素的反應(yīng)[9]。由于具有抗氧化特性，裸藻副淀粉可抑制四氯化碳引起的小鼠肝損傷，并防止特應(yīng)性皮炎樣病變的發(fā)展[9]，它在健康和醫(yī)療方面具有巨大的生物技術(shù)潛力。但是目前對(duì)裸藻中多糖的研究多集中在非水溶性多糖（副淀粉）上，而對(duì)于裸藻水溶性多糖結(jié)構(gòu)和活性的研究鮮有報(bào)道。研究表明，裸藻水提物的總抗氧化能力遠(yuǎn)超于裸藻、裸藻副淀粉和堿溶的裸藻副淀粉，裸藻的水提物具有強(qiáng)抗氧化性作用，但該作用是否與裸藻水溶性多糖有關(guān)尚未可知[10]。

本文以裸藻為研究對(duì)象，對(duì)其分離純化后的非水溶性和水溶性多糖組分的官能團(tuán)、分子量、單糖組成等基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，進(jìn)而對(duì)其抗氧化活性比較分析，以期為進(jìn)一步研究裸藻多糖構(gòu)效關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為裸藻多糖的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裸藻（藻粉） 上海光語(yǔ)生物科技有限公司；DEAE-52纖維素、Sephadex G-100凝膠、透析袋北京索萊寶科技有限公司；中性蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS） 上海麥克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；不同分子量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%） Sigma公司；無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、濃硫酸、H2O2西隴科學(xué)股份有限公司；苯酚、水楊酸、硫酸亞鐵、氯化鈉等試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司；TU-1950紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；UGC-24M氮吹儀 力辰科技公司；Nicolet iS50傅里葉紅外光譜儀 Thermo Scientific；LC-10A高效液相色譜儀 Shimadzu公司；RI-10A示差檢測(cè)器 Shimadzu；ICS5000離子色譜儀

ThermoFisher公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 裸藻多糖的制備

1.2.1.1 裸藻非水溶性多糖的提取 參考鞠海軍[11]的方法，稱取100 g裸藻粉末，懸浮于2 L的SDS溶液（8.5 g/L）中，超聲輔助提取18.5 min（60 ℃，45 kHz，200 W），離心（4000 r/min，5 min）取沉淀，并往沉淀中加入3 L SDS溶液（1 g/L），置于95 ℃水浴1 h，離心棄上清，依次用水、丙酮、乙醚反復(fù)洗滌沉淀除去蛋白等雜質(zhì)，離心取沉淀后，冷凍干燥得裸藻非水溶性多糖EGP-1。

1.2.1.2 裸藻水溶性多糖的提取 參考葛智超等[12]的方法并稍加修改，稱取100 g裸藻藻粉，溶于4 L去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.5~7.9；超聲輔助提取2 h（60 ℃，45 kHz，200 W），離心（5000 r/min，10 min）取上清液；旋蒸濃縮后，加入4倍體積無(wú)水乙醇；隨后置于4 °C層析柜中，醇沉過(guò)夜；再離心（5000 r/min，10 min）取沉淀于50 ℃烘箱烘干（12 h），粉碎稱重；將粉碎物溶于去離子水，至完全溶解并調(diào)節(jié)pH至7.0~8.0后，加入11.2%粗多糖重量的中性蛋白酶（100 U/mg）50 ℃水浴1 h，100 ℃沸水煮10 min；離心（5000 r/min，10 min）取上清，濃縮；最后用8~14 kDa分子量（MW）透析袋處理濃縮液2 d；濃縮凍干得裸藻水溶性粗多糖EGP-2。

1.2.2 多糖和蛋白含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法對(duì)各組分多糖含量進(jìn)行測(cè)定[11]。取1 mL樣品（標(biāo)準(zhǔn)品），依次加入1 mL 5%苯酚和5 mL濃硫酸，于490 nm處測(cè)其吸光度。以D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、10、20、50、80、100 mg/mL）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.006x+0.05413，R2=0.99，根據(jù)其計(jì)算樣品中多糖的含量。

采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒對(duì)各組分中的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。以牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.0052x+0.0391，R2=0.99，根據(jù)其計(jì)算樣品中蛋白的含量。

1.2.3 裸藻水溶性多糖的分離純化

1.2.3.1 離子層析柱分離純化 采用DEAE-52纖維素柱對(duì)裸藻水溶性多糖進(jìn)行分離純化[13]。將制備的裸藻水溶性粗多糖，過(guò)0.45 μm濾膜后上樣，以0、0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L的NaCl溶液為洗脫液。用苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量，收集單一組分的多糖溶液，用1000 Da透析袋在DI水的條件下透析48 h除去NaCl，旋蒸濃縮后凍干。

1.2.3.2 凝膠層析柱分離純化 采用Sephadex G-100凝膠柱對(duì)DEAE-52過(guò)柱后得到的餾分進(jìn)一步分離純化[14]。樣品以10 mg/mL的濃度，上樣2 mL，以DI水為洗脫液，苯酚-硫酸法對(duì)多糖含量測(cè)定，收集單一組分多糖溶液，濃縮凍干得多糖組分，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 純度鑒定 采用紫外-可見(jiàn)光吸收光譜掃描分析多糖組分純度[11]。將裸藻水溶性多糖和非水溶性多糖分別溶解于DI水和0.50 mol/L NaOH溶液中配制成0.5 mg/mL的多糖溶液，再分別以DI水和0.50 mol/L NaOH為空白對(duì)照，在200~400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描。

1.2.5 結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.5.1 分子量測(cè)定 采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）進(jìn)行測(cè)定[15]。精密稱取樣品和標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品的分子量為5000、11600、23800、48600、80900、148000、273000、409800、667800、3693000 Da），分別采用DMSO溶液/0.05 mol/L NaCl溶液配制成5 mg/mL溶液，12000 r/min離心10 min，上清液用有機(jī)微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾，然后將樣品轉(zhuǎn)置于1.8 mL進(jìn)樣小瓶中。

非水溶性多糖色譜方法：色譜柱：BRT806色譜柱（8 mm×300 mm）；流動(dòng)相：DMSO溶液；流速：0.6 mL/min，柱溫：60 ℃；進(jìn)樣量：50 μL；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器RI-10A。

水溶性多糖色譜方法：色譜柱：BRT105-104-102串聯(lián)凝膠柱（8 mm×300 mm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L NaCl溶液；流速：0.6 mL/min，柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器RI-10A。

1.2.5.2 紅外光譜 采集背景數(shù)據(jù)去除干擾后，在4000~650 cm?1區(qū)域掃描樣品，對(duì)主要峰（強(qiáng)度和波數(shù)）進(jìn)行識(shí)別和分析[13]。

1.2.5.3 單糖組成 通過(guò)對(duì)比樣品與單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間來(lái)確定組分的單糖組成[16]。精密稱量樣品10 mg，加入3 mol/L三氟乙酸10 mL，120 ℃水解3 h。準(zhǔn)確吸取酸水解溶液轉(zhuǎn)移至管中氮吹吹干，加入5 mL水渦旋混勻，取100 μL加入900 μL DI水，離心（12000 r/min，5 min）取上清液，進(jìn)離子色譜儀分析。

色譜柱：DionexCarbopacTMPA20 （3 mm×150 mm）；流動(dòng)相：A：H2O，B：15 mmol/L NaOH，C：15 mmol/L NaOH &100 mmol/L NaOAC（3:20）；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：電化學(xué)檢測(cè)器。

1.2.6 抗氧化活性分析

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力 參考栗曉慶等[17]的方法，測(cè)定樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力。分別稱取EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1和VC溶于水或DMSO中配制成樣品溶液。量取樣品和DPPH-乙醇溶液（0.2 mmol/L）各100 μL，充分混勻靜置反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定其吸光度。同時(shí)對(duì)照組用無(wú)水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，空白組用水或DMSO替代樣品溶液。按下列公式計(jì)算：

1.2.6.2 羥自由基清除能力 參考宋佳敏等[18]的方法，通過(guò)水楊酸法進(jìn)行測(cè)定。按1.2.6.1方法制備EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1和VC的不同系列樣品溶液。取0.5 mL樣品溶液，依次加入FeSO4（6 mmol/L）和H2O2溶液（6 mmol/L）各0.5 mL，室溫反應(yīng)10 min，再加入6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液0.5 mL，搖勻，37 ℃反應(yīng)30 min后，于510 nm處測(cè)定吸光度，對(duì)照組用水代替H2O2溶液，空白組用水代替樣品。按下列公式計(jì)算清除率：

1.2.6.3 還原能力 參考董揚(yáng)等[19]的方法，采用鐵氰化鉀法進(jìn)行測(cè)定。按1.2.6.1方法制備EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1和VC的不同系列樣品溶液。取樣品溶液、1%鐵氰化鉀溶液和磷酸緩沖液（pH6.6）各1.0 mL，混勻后在50 ℃反應(yīng)20 min，加入10%三氯乙酸2.0 mL，3000 r/min離心10 min，取上清液和水各2.0 mL、0.3%三氯化鐵0.4 mL，50 ℃反應(yīng)10 min，測(cè)定700 nm波長(zhǎng)處的吸光度。對(duì)照組以水代替三氯化鐵溶液。按下列公式計(jì)算還原力：

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果都以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。采用SPSS 25和Origin 2019軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 裸藻各組分多糖和蛋白的含量

通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)得裸藻粗多糖中非水溶性多糖和水溶性多糖含量分別為93.89±2.36%和69.62±0.60%。

通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得從裸藻中提取得到的非水溶性多糖和水溶性多糖每100 μg中的蛋白含量分別為0.10 μg和5.62 μg。

2.2 水溶性多糖分離純化的結(jié)果

圖1為EGP-2在DEAE-52層析柱上的洗脫曲線圖。以0、0.1、0.3、0.5和0.7 mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，得到2個(gè)主要洗脫組分（EGP-2A和EGP-2B），其他組分的含量較低，很難進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。所以僅對(duì)DEAE-52柱層析分離得到的2個(gè)主要組分收集后進(jìn)行透析并冷凍干燥備用，進(jìn)一步采用Sephadex G-100繼續(xù)分離純化。EGP-2A和EGP-2B組分經(jīng)Sephadex G-100凝膠層析柱洗脫得到兩個(gè)主要的洗脫峰，如圖2所示，收集兩個(gè)主要組分，透析后將其命名為EGP-2A-1和EGP-2B-1。

圖1 裸藻水溶性粗多糖DEAE-52層析柱洗脫曲線Fig.1 The elution curve of DEAE-52 column of water-soluble crude polysaccharide of Euglena gracilis

圖2 裸藻EGP-2A和EGP-2B組分多糖的凝膠層析洗脫曲線Fig.2 Gel column elution curve EGP-2A and EGP-2B fraction polysaccharides of Euglena gracilis

2.3 多糖組分純度鑒定

紫外可見(jiàn)分光光度法可于260和280 nm處定性測(cè)量核酸及蛋白質(zhì)[20]。如圖3所示，糖及其復(fù)合物于200 nm處擁有非常強(qiáng)的吸收峰，樣品溶液符合多糖的紫外吸收特征，并且掃描結(jié)果顯示在260和280 nm處的核酸和蛋白質(zhì)吸收峰平坦，表明樣品中均不含或含極少量蛋白質(zhì)、核酸，具有較髙的純度。

圖3 裸藻EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1組分多糖的紫外光譜掃描圖Fig.3 Ultraviolet spectrum of EGP-1, EGP-2A-1 and EGP-2B-1 fraction polysaccharides of Euglena gracilis

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

2.4.1 分子量測(cè)定 采用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1的分子量。如圖4所示，三個(gè)組分的HPGPC圖譜為單一對(duì)稱峰，平均分子量分別為1.01×104、2.91×106和1.70×106Da。多糖來(lái)源和制備方法的不同會(huì)導(dǎo)致單糖組成和分子量的較大差異，從而影響其生物功能活性[7]。同一來(lái)源的多糖由于其分子量的不同，往往具有不同的功能活性，較高分子量的多糖具有更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其表現(xiàn)出的生物活性也更為廣泛，分子量過(guò)低，難以形成具有活性的聚合結(jié)構(gòu)[21]。因此，分子量較高的EGP-2A-1和EGP-2B-1可能在某些方面具有優(yōu)勢(shì)。

圖4 EGP-1（A）、EGP-2A-1（B）和EGP-2B-1（C）的HPGPC色譜圖Fig.4 HPGPC chromatograms of EGP-1（A）, EGP-2A-1（B）and EGP-2B-1（C）

2.4.2 紅外光譜 EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1的紅外譜圖如圖5所示。結(jié)果顯示，三種組分在3400和2930 cm?1附近具有O-H和C-H伸縮振動(dòng)峰，符合糖類的一般結(jié)構(gòu)特征[22?23]；1650 cm?1附近的吸收峰反映了C=O的非對(duì)稱振動(dòng)，可能存在糖醛酸[24]；1380 cm?1附近的吸收峰被認(rèn)為是CH3?的對(duì)稱變角振動(dòng)引起的伸縮帶[25]；1250 cm?1處是吡喃糖環(huán)上的C-O-H和C-O-C的C-O伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，在1000~1200 cm?1附近是吡喃糖環(huán)的C-O-C和CO-H的單鍵吸收峰[26]；890 cm?1處是β-D-吡喃葡萄糖特征峰[27]；834 cm?1附近的特征峰說(shuō)明多糖含有α-吡喃糖苷鍵[28]；803 cm?1處的吸收峰可能是樣品含有吡喃甘露糖殘基[29]（表1）。以上結(jié)果表明，EGP-1是一種含有β-糖苷鍵和吡喃葡萄糖環(huán)的多糖，EGP-2A-1和EGP-2B-1是含有α-和β-糖苷鍵并具有吡喃糖環(huán)的多糖。

表1 裸藻多糖傅里葉紅外光譜數(shù)據(jù)Table 1 Fourier infrared spectroscopy data of Euglena gracilis polysaccharide

圖5 裸藻多糖的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrum of Euglena gracilis polysaccharide

2.4.3 單糖組成 圖6為混合單糖標(biāo)品與EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1的離子色譜圖。在三個(gè)樣品中，EGP-1中鑒定出葡萄糖、甘露糖、巖藻糖和鼠李糖四種主要單糖，其摩爾比為0.873:0.066:0.030:0.030，其中葡萄糖摩爾含量最高。在鞠海軍[11]的研究中，裸藻中分離出的非水溶性多糖的主要是β-葡聚糖，單糖主要為葡萄糖，與本文的結(jié)果一致。然而，與EGP-1相比，EGP-2A-1和EGP-2B-1組分含有至少9種單糖，并且二者的單糖組成類型相同，均為巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸，只是摩爾比例略有差異，比分別為0.150:0.208:0.014:0.002:0.015:0.007:0.010:0.588:0.005 和 0.151:0.218:0.010:0.003:0.025:0.008:0.012:0.565:0.008。摩爾比值表明，兩種多糖的甘露糖含量最高，葡萄糖醛酸含量較低，并且兩種多糖均在其紅外光譜803 cm?1和1650 cm?1附近出現(xiàn)特征峰。葛智超等[12]從裸藻中分離出分子量為3~5 kDa的水溶性多糖組分中含量較高的單糖為半乳糖、巖藻糖、木糖，該結(jié)果與EGP-2A-1和EGP-2B-1的結(jié)果不同，造成這種差異的可能原因是提取的是不同分子量段的多糖，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)存在差異。

圖6 混標(biāo)、EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1的離子色譜圖Fig.6 Ion chromatograms of mixed standard, EGP-1,EGP-2A-1 and EGP-2B-1

2.5 抗氧化活性分析

2.5.1 DPPH自由基清除能力 人類的多種疾病均與自由基有關(guān)，包括炎癥、癌癥、糖尿病等等。自由基屬于強(qiáng)氧化劑，一旦在人體內(nèi)蓄積過(guò)量，會(huì)加速細(xì)胞老化甚至凋亡[30]?？寡趸瘎┛上杂苫?，對(duì)人體正常的新陳代謝有重要意義。

根據(jù)作用方式的不同，抗氧化劑主要分為兩大類：初級(jí)（鏈斷裂）抗氧化劑和次級(jí)（預(yù)防性）抗氧化劑[31]。初級(jí)抗氧化劑通常充當(dāng)自由基的受體，抑制起始步驟或干擾自氧化的傳播步驟，能夠?qū)湓泳栀?zèng)給自由基[32]。次級(jí)抗氧化劑能夠通過(guò)多種不同機(jī)制減緩氧化反應(yīng)的速率[33]。例如，次級(jí)抗氧化劑可以提供H原子給初級(jí)抗氧化劑，用作氧清除劑或?qū)溥^(guò)氧化物轉(zhuǎn)換為非自由基物質(zhì)[34]。

DPPH法是檢測(cè)抗氧化能力的常用標(biāo)準(zhǔn)方法，DPPH自由基能夠接受來(lái)自抗氧化劑的H原子形成穩(wěn)定的分子，導(dǎo)致溶液顏色變淺。如圖7所示，各樣品均對(duì)DPPH·具有一定的清除活性，當(dāng)多糖濃度從0.1增加到10.0 mg/mL時(shí)，3種多糖對(duì)DPPH自由基清除能力隨樣品濃度的升高而增大。IC50是指清除率為50%時(shí)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，物質(zhì)IC50值越小，表明其抗氧化性越好[35]。裸藻EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1的IC50值分別為11.954、5.397和9.458 mg/mL，說(shuō)明3種樣品的初級(jí)抗氧化能力較強(qiáng)。因此，還需對(duì)裸藻多糖樣品的次級(jí)抗氧化活性進(jìn)行研究，以確定它們的總抗氧化能力。

圖7 DPPH自由基清除能力Fig.7 DPPH free radical scavenging ability

2.5.2 羥基自由基清除能力 用水楊酸法測(cè)定裸藻多糖樣品的次級(jí)抗氧化能力。3種多糖和VC對(duì)羥基自由基的清除能力如圖8所示，其自由基清除率和樣品濃度成線性依賴關(guān)系，存在明顯的劑量效應(yīng)。且在相同濃度下，樣品的清除能力強(qiáng)弱依次為EGP-2A-1>EGP-2B-1>EGP-1，但其清除能力與VC相比還有一定的差距，經(jīng)計(jì)算得EGP-1、EGP-2A-1、EGP-2B-1和VC的IC50值分別為13.264、4.327、9.142和0.539 mg/mL。先前的文獻(xiàn)報(bào)道，羊棲菜多糖在濃度為9.85 mg/mL時(shí)，其羥自由基清除能力接近50%[36]，紫菜、羅漢果和山藥多糖在濃度為2 mg/mL時(shí)，清除率均低于20%[37]。相比之下，EGP-2A-1具有較好的次級(jí)抗氧化活性。

圖8 羥基自由基清除能力Fig.8 OH radical scavenging ability

2.5.3 還原能力 吸光度值表示物質(zhì)的還原能力，物質(zhì)的還原力越高，表明其抗氧化性越好[19]。如圖9所示，裸藻多糖的還原能力隨著樣品濃度的增加而增強(qiáng)，在濃度為1~2 mg/mL時(shí)，EGP-2A-1和EGP-2B-1組分的還原能力低于EGP-1，而在4~10 mg/mL范圍內(nèi)，EGP-2A-1和EGP-2B-1的還原能力逐漸高于EGP-1，差距不斷拉大。當(dāng)濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，EGP-2A-1和EGP-2B-1的吸光度分別為0.23和0.18。雖然陽(yáng)性對(duì)照VC的還原能力遠(yuǎn)高于3種組分多糖，但本實(shí)驗(yàn)仍能證明裸藻多糖具有一定的還原能力，還原能力大小依次為：EGP-2A-1>EGP-2B-1>EGP-1。

圖9 還原能力Fig.9 Reduction ability

2.5.4 總體抗氧化能力分析 EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1組分在質(zhì)量濃度10 mg/mL時(shí)的抗氧化能力可以通過(guò)在雷達(dá)圖上面積的比較進(jìn)行分析。如圖10所示，EGP-2A-1的面積最大，說(shuō)明該組分多糖的抗氧化能力最強(qiáng)。三種組分的抗氧化活性大小為：EGP-2A-1>EGP-2B-1>EGP-1。

圖10 裸藻多糖的抗氧化能力雷達(dá)圖Fig.10 Radar chart of the antioxidant capacity of Euglena gracilis polysaccharides

有研究表明，分子量也是影響多糖抗氧化性的一方面因素，高分子量多糖的空間結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，這有利于維持生物活性，但也有研究表明低分子量多糖由于松散的構(gòu)象，更容易被吸收，具有更好的活性[38]。在本研究中，分子量的大小為：EGP-2A-1>EGP-2B-1>EGP-1，可見(jiàn)分子量的大小對(duì)于裸藻多糖的抗氧化活性具有一定影響，在三種多糖組分中，分子量越大抗氧化活性越好。

Luo和Wang等[39?40]研究了石斛多糖單糖組成與抗氧化活性之間的關(guān)系，結(jié)果表明石斛多糖是否具有抗氧化活性受葡萄糖的影響，但是其活性大小受甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖的影響。艾于杰[38]對(duì)茶多糖和抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖和甘露糖含量與抗氧化活性正相關(guān)，而隨著葡萄糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖含量的增加，DPPH自由基清除能力降低。黃依佳等[41]對(duì)比了兩種藍(lán)藻多糖的羥基自由基清除能力及其單糖組成之間存在的差異，研究發(fā)現(xiàn)以甘露糖為主要單糖的CB-2-1比以葡萄糖為主要組分的CCB活性更好。

本研究純化的三個(gè)組分中均含有葡萄糖，實(shí)驗(yàn)證明都具有抗氧化活性，與劉袆帆等的結(jié)果一致[42]。但是EGP-1的抗氧化活性最低，可能是由于EGP-1中葡萄糖含量為87.3%，成分較單一，并且甘露糖和鼠李糖只含有6.6%和3.0%，從而導(dǎo)致其活性不高。組分EGP-2A-1和EGP-2B-1均表現(xiàn)較好的清除DPPH活性，其中甘露糖和鼠李糖為主要單糖，并且EGP-2A-1組分中半乳糖和葡萄糖醛酸的含量低于EGP-2B-1，但是在EGP-2A-1中阿拉伯糖的含量更高，經(jīng)過(guò)各種單糖的協(xié)同作用最后表現(xiàn)出裸藻多糖的DPPH清除能力為EGP-2A-1高于EGP-2B-1，存在極顯著差異（P<0.01）。EGP-2A-1的羥基自由基清除能力遠(yuǎn)高于EGP-2B-1，具有極顯著差異（P<0.01），根據(jù)兩者的單糖組成分析，可能有甘露糖含量的影響，但是因兩者單糖組成相似，并且多糖的活性還與糖苷鍵、空間構(gòu)象等有密切關(guān)系，其更深入的原因需要進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

本研究中，首次對(duì)裸藻水溶性多糖和非水溶性多糖的主要組分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究分析，并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行比較分析。通過(guò)不同方法對(duì)裸藻中水溶性多糖和非水溶性多糖進(jìn)行提取，并進(jìn)一步分離純化后得到3個(gè)主要組分多糖EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1。結(jié)合紫外可見(jiàn)光、紅外光譜、凝膠色譜、離子色譜等多種技術(shù)對(duì)3個(gè)組分多糖進(jìn)行分析。紫外光譜表明3種樣品均不含或含少量蛋白和核酸，純度較高；紅外光譜結(jié)果表明3個(gè)組分多糖均存在糖的羰基、羥基、吡喃環(huán)等多糖常見(jiàn)官能團(tuán)和結(jié)構(gòu)，其中EGP-1含有β-糖苷鍵，EGP-2A-1和EGP-2B-1中均含有α-和β-糖苷鍵。通過(guò)滲透色譜測(cè)定EGP-1、EGP-2A-1和EGP-2B-1的相對(duì)分子質(zhì)量分別為1.01×104、2.91×106和1.70×106Da。離子色譜分析表明EGP-1中鑒定出葡萄糖、甘露糖、巖藻糖和鼠李糖四種主要單糖，EGP-2A-1和EGP-2B-1組分均由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸組成。通過(guò)體外抗氧化研究發(fā)現(xiàn)，裸藻多糖對(duì)DPPH和OH自由基均具有清除作用，且均具有一定的還原能力。各組分活性存在差異，在相同質(zhì)量濃度下，抗氧化活性VC>EGP-2A-1>EGP-2B-1>EGP-1。綜上所述，裸藻多糖具有抗氧化能力，且其水溶性多糖的抗氧化能力強(qiáng)于非水溶性多糖，推測(cè)這可能是由于單糖組成和分子量的不同造成的，這種差異還可能與多糖的糖苷鍵類型、三螺旋結(jié)構(gòu)等因素有關(guān)，因此后續(xù)還需進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)深入探究裸藻多糖結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性之間的關(guān)系。