田 然，馮俊然，隋曉楠，江連洲

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

大豆蛋白組分按離心過程中的沉淀性質(zhì)可以分為四種—2S、7S、11S和15S，其中7S和11S球蛋白是大豆蛋白的主要成分，占總量的65%~80%[1]。7S主要組成部分為β-伴大豆球蛋白，分子量約150~200 kDa，糖含量約為5%，是由β（~47.8 kDa）、α（~63.5 kDa）和α'（~67.2 kDa）三個(gè)亞基通過氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用組成的三聚糖蛋白[2]。11S主要組成部分為大豆球蛋白，分子量約為320~375 kDa，是一種六聚體蛋白質(zhì)，它由兩個(gè)重疊的六邊形環(huán)組成，由酸性亞基A（~38 kDa）和堿性亞基B（~20 kDa）通過疏水相互作用和靜電相互作用結(jié)合在一起[3]。有研究將六聚體中的五個(gè)亞基分為兩個(gè)亞基組合，根據(jù)氨基酸序列的特點(diǎn)分為亞基組Ⅰ（A1aB2，A1bB1b和A2B1a）和亞基組Ⅱ（A3B4和A5A4B3）。作為大豆蛋白的兩個(gè)主要組成部分，7S和11S由于其結(jié)構(gòu)的固有差異，會(huì)影響大豆蛋白的功能特性。然而，天然大豆蛋白具有緊密的球狀結(jié)構(gòu)，因此其功能性會(huì)被其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)所限制。因此，需要對(duì)大豆蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，使其具有更高的表面活性狀態(tài)，以改善特定的功能性質(zhì)，這可以通過物理、化學(xué)或酶法來實(shí)現(xiàn)[4]。

超聲處理是一種非熱加工技術(shù)，具有環(huán)境友好、節(jié)能、無毒、相對(duì)經(jīng)濟(jì)和易于操作的特點(diǎn)[5]。超聲處理的應(yīng)用被認(rèn)為是食品工業(yè)的一個(gè)潛在增長領(lǐng)域，在提高食品質(zhì)量方面具有良好的效果[6]。超聲波可分為兩種類型，即高頻低強(qiáng)度（100 kHz~1 MHz，強(qiáng)度<1 W/cm2）和低頻高強(qiáng)度（16~100 kHz，強(qiáng)度10~2000 W/cm2）[7]。低頻高強(qiáng)度超聲也被稱為“功率超聲”，廣泛用于改變食品的特性[8]。

近年來，高強(qiáng)度超聲處理作為一種可以改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的物理方法，一直是研究的熱門話題。以往的研究表明，超聲處理可以破壞大豆蛋白的非共價(jià)相互作用從而改變其結(jié)構(gòu)[9]。Morales等[10]發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白在20 kHz、4.27 W的超聲處理下，蛋白的粒徑減小。Huang等[1]的研究表明，當(dāng)超聲時(shí)間較短時(shí)，大豆蛋白樣品α-螺旋含量較低，無規(guī)卷曲量較高；而在較長時(shí)間（超過20 min）處理的中則相反，樣品α-螺旋較高，無規(guī)卷曲含量較低，說明蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。Zheng等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理還可以有效地提升大豆分離蛋白的疏水性和巰基含量。然而目前，超聲處理對(duì)7S和11S的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的影響少有報(bào)道，也缺乏關(guān)于超聲對(duì)二者熱特性影響的研究。另外，在以往的研究中，高強(qiáng)度超聲處理蛋白的應(yīng)用通常被限制在100 W/cm2以下的相對(duì)較小的范圍內(nèi)。

因此，本研究通過施加更高功率（150 、450 、1350 W）不同時(shí)間（15 、30 min）的超聲處理，探究7S和11S二三級(jí)結(jié)構(gòu)、粒徑分布、微觀形貌、溶解性、乳化性等結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)以及熱特性在超聲后的變化，為高強(qiáng)度超聲處理在大豆蛋白開發(fā)利用方面的研究提供進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供；大豆油 九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）制備試劑盒、2×蛋白上樣緩沖液、彩虹廣譜蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品 北京索萊寶科技有限公司；尿素（Urea）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate,SDS）、甘氨酸 美國Amresco公司；β-巰基乙醇Geniview公司； 考馬斯亮藍(lán)R-250 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（ANS） 美國Sigma-Aldrich；其它所有化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純。

XH-300A+電腦微波超聲波組合合成萃取儀北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；KjelFlex K-370凱氏定氮儀 瑞士步琦公司；Mini-PROTEAN Trtra垂直電泳槽 Bio-Rad公司；Gel DocTM EZ imager 凝膠電泳成像系統(tǒng) Bio-Rad公司；MAGNA-IR560 傅里葉紅外光譜儀 梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；RF-6000 型熒光分光光度計(jì) 日本島津公司；NANO ZS90粒度及電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；DSC Q2000 差示掃描量熱儀 美國TA儀器公司；SU8010 場發(fā)射掃描電子顯微鏡（配備PP3010T型冷凍傳輸系統(tǒng)） 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 7S和11S的制備 7S和11S按照Matsumura等[12]的方法制備。將成熟大豆磨碎成細(xì)粉，按1:5（w/w）的比例用正己烷脫脂。將脫脂豆粉分散在去離子水（1:8，w/v）中，用2.0 mol/L NaOH調(diào)pH至8.0，在20 °C下連續(xù)攪拌1 h后，將分散液在10000×g，4 °C下離心30 min收集上清液。收集的上清液中加入1.0 mmol/L的還原劑Na2SO3以增加蛋白質(zhì)的溶解度，并用2.0 mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至5.8。然后將溶液在6500×g離心30 min，沉淀得到11S粗品。分離后得到的剩余水相部分，用2.0 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)至pH5.0。將酸化后的樣品在室溫下攪拌1 h，然后在10000×g和4 °C下再次離心30 min。收集上清液，使用2.0 mol/L的HCl調(diào)pH至4.5并離心（20 min，6500×g，4 °C），分離得到7S粗品。將分離出的7S或11S粗品分散在去離子水中，用2.0 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至中性，然后用去離子水洗滌3次。將7S和11S冷凍干燥，并儲(chǔ)存在干燥器中。用凱氏定氮法[13]測定出制得的7S和11S樣品的蛋白質(zhì)含量分別為92.21%和93.37%。

1.2.2 7S和11S的超聲處理 將等量的7S和11S分散于去離子水（1:25，w/v）中，攪拌2 h，用NaOH（2.0 mol/L）調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0。分別對(duì)7S和11S溶液進(jìn)行超聲處理，頻率為20 kHz，功率輸出為150、450和1350 W，超聲處理時(shí)間設(shè)定為15 min和30 min。通過浸泡在冰水浴中，樣品在整個(gè)超聲處理過程中一直保持在較低的溫度。然后將7S和11S在4 °C下保存或凍干以備后續(xù)分析。由于超聲系統(tǒng)中能量的損失，介質(zhì)中的實(shí)際超聲能量水平低于設(shè)定的輸出功率。因此，實(shí)際的超聲強(qiáng)度是通過量熱法[14]確定的，基于實(shí)驗(yàn)前30 s內(nèi)的溫度升高值進(jìn)行計(jì)算。當(dāng)輸出功率為150、450和1350 W時(shí)，計(jì)算出實(shí)際超聲強(qiáng)度分別為18.31、44.75和111.86 W/cm2。

1.2.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）參考Wu等[15]之前描述的方法進(jìn)行。將凍干的7S和11S溶解在SDS-PAGE緩沖液（0.124 mol/L Tris-HCl，15%甘油，2% SDS，5%β-巰基乙醇和0.0025%溴酚藍(lán)，pH=6.8）中，蛋白質(zhì)濃度為4 mg/mL，然后在100 °C的水中煮沸5 min，以10000×g離心3 min。將10 μL上清液上樣至凝膠上。分別在80 V和120 V的電壓下在濃縮膠和分離膠中進(jìn)行電泳。用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，并在脫色液（40%甲醇和10%冰醋酸）中脫色過夜。使用帶有Image Lab軟件的凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。

1.2.4 傅里葉變換紅外光譜分析 根據(jù)本課題組以前研究中的實(shí)驗(yàn)方法[16]，用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）表征超聲處理前后7S和11S的二級(jí)結(jié)構(gòu)。凍干的7S和11S與KBr按照1:10的比例充分混合進(jìn)行研磨，壓片放入托盤中。然后，托盤被轉(zhuǎn)移到樣品架上進(jìn)行光譜掃描。光譜儀的分辨率設(shè)定為4 cm?1，進(jìn)行11次掃描。用PeakFit Version 4.12軟件對(duì)酰胺I、II和III帶的數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積、峰分離和擬合分析，通過高斯積分面積計(jì)算7S和11S二級(jí)結(jié)構(gòu)各組分的含量百分比。

1.2.5 內(nèi)源熒光光譜分析 將超聲處理前后的7S和11S溶解在0.01 mol/L的PBS緩沖液（pH7.0）中，使樣品最終濃度為0.05 mg/mL。將樣品溶液置于石英比色皿中進(jìn)行內(nèi)源熒光光譜分析，激發(fā)波長設(shè)置為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為5 nm。發(fā)射波長范圍為300~450 nm，掃描速度為10 nm/s。

1.2.6 粒徑分布分析 由Wu等[15]描述的方法進(jìn)行粒徑分布測定。將凍干的7S和11S溶解在PBS（0.01 mol/L，pH7.0）中，以達(dá)到0.5 mg/mL的最終濃度。然后將分散液通過醋酸纖維素水溶液濾膜（顆粒保留率0.45 μm）過濾，以去除不溶性部分。使用Zetasizer Nano ZS90粒徑電位分析儀將1 mL濾液加入到透明的zeta cell中進(jìn)行粒度測定。

1.2.7 表面疏水性的測定 根據(jù)Kato等[17]的方法，用1-苯胺基-8-萘磺酸（ANS）作為熒光探針測定表面疏水性。將凍干的7S和11S分散在0.1 mol/L PBS（pH7.0）中，在室溫下攪拌1 h，然后離心（10000×g，30 min）。上清液用0.1 mol/L PBS（pH7.0）稀釋得到0.05~0.4 mg/mL不等的梯度濃度，蛋白質(zhì)濃度由Lowry法[18]測定。將40 μL ANS溶液（0.008 mol/L ANS溶解在0.1 mol/L PBS緩沖液中，pH7.0）與每個(gè)樣品的4 mL混合，并在黑暗中靜置3 min。用熒光光譜儀在波長390 nm（激發(fā)）和470 nm（發(fā)射）下測定樣品熒光強(qiáng)度。繪制熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系圖，線性回歸分析計(jì)算的初始斜率取為H0。

1.2.8 差示掃描量熱法分析 使用DSC Q2000熱分析儀檢測樣品的熱變化。凍干的7S和11S按照Ren等[19]描述的方法進(jìn)行處理。準(zhǔn)確地稱取每個(gè)樣品2 mg放在鋁制坩堝中。然后，用0.01 mol/L PBS（pH7.0）以約1:5（w/v）的比例潤濕樣品后密封。坩堝置于室溫下24 h以達(dá)到平衡，然后在氮?dú)猸h(huán)境下以5 °C/min的速度從25 °C加熱到110 °C，測定其熱吸收曲線。以密封的空坩堝作為參照物。

1.2.9 溶解度測定 根據(jù)Nazari等[20]的方法測定溶解度。用去離子水稀釋7S和11S分散液至1%（w/w）的濃度，并調(diào)整pH至7.0。將等體積的各個(gè)樣品在23 ℃下以20000×g離心15 min。使用Lowry法[18]測定上清液中的蛋白質(zhì)含量，并使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。隨后用下式計(jì)算蛋白質(zhì)的溶解度：

式中：m1表示上清液中蛋白質(zhì)含量，g；m2表示離心前分散液中蛋白質(zhì)的含量，g。

1.2.10 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定 使用Jamdar等[21]的方法稍作修改測定乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）。將7S和11S樣品溶液稀釋至蛋白濃度為2 mg/mL，然后與大豆油以3:1（v/v）混合后在20000 r/min下均質(zhì)2 min。分別在剛結(jié)束均質(zhì)時(shí)和均質(zhì)后10 min從容器底部吸取乳液（50 μL），然后用0.1%的SDS溶液（0.01 mol/L，pH7.0的PBS制備）將乳液稀釋至5 mL，混勻后用紫外-可見分光光度計(jì)在500 nm處測定吸光度，讀取吸光值。EAI和ESI根據(jù)如下公式（2）和（3）進(jìn)行計(jì)算：

式中：DF表示稀釋倍數(shù)（100）；A0表示剛結(jié)束均質(zhì)時(shí)乳液的吸光度；A10表示均質(zhì)后10 min時(shí)乳液的吸光度；φ表示比色皿的光程（1 cm）；θ表示油相體積分?jǐn)?shù)（0.25）；C表示蛋白質(zhì)的初始濃度，g/mL。

1.2.11 冷凍掃描電子顯微鏡的表征 根據(jù)Whitby等[22]的方法，使用冷凍掃描電子顯微鏡觀察形態(tài)。將7S和11S蛋白溶液滴入位于支架上的冷凍掃描電子顯微鏡短管中，并在氮?dú)庵羞M(jìn)行冷凍。然后，將短管轉(zhuǎn)移到超真空低溫室中，在?95 °C下切割并蝕刻60 s，切割后的切面涂上鉑金，轉(zhuǎn)移到掃描電鏡的冷凍室內(nèi)（?170 °C）。用顯微鏡控制軟件拍攝超聲處理前后的7S和11S的顯微圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究結(jié)果以3次平行的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次，利用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan檢驗(yàn)（P<0.05）作為事后檢驗(yàn)，以比較3組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是否具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 7S和11S的SDS-PAGE

經(jīng)超聲處理和未經(jīng)超聲處理的7S和11S SDSPAGE圖譜如圖1，可以清楚地表明本實(shí)驗(yàn)提取出的7S和11S的分子量，其中7S在約67、71和50 kDa處有條帶，而11S在約35和22 kDa處有條帶，這與過去報(bào)道的中的亞基分子量大致相同[23]。然而，超聲處理并沒有改變這兩種蛋白質(zhì)的分子量，這一點(diǎn)從SDS-PAGE圖像中相似的條帶上可以看出。這說明超聲處理沒有改變蛋白質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)。同樣，O'sullivan等[24]也報(bào)道了在超聲處理后豌豆蛋白的分子量幾乎沒有變化。超聲處理后蛋白質(zhì)的分子量幾乎不變，說明超聲處理可能不會(huì)破壞共價(jià)鍵，也就是說蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)沒有改變[25]。

圖1 超聲處理前后7S和11S的聚丙稀酸胺凝膠電泳條帶圖Fig.1 SDS-PAGE graph of 7S and 11S with and without ultrasound treatment

2.2 7S和11S紅外光譜分析

傅立葉變換紅外光譜（FTIR）是測定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的常用技術(shù)[26]。在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋結(jié)構(gòu)主要通過多肽中CO和NH基團(tuán)之間的氫鍵來穩(wěn)定。每4個(gè)氨基酸形成的α-螺旋結(jié)構(gòu)是非常穩(wěn)定的，因?yàn)?，每一個(gè)氨基酸，其-CO-NH-基團(tuán)都會(huì)參與形成兩個(gè)氫鍵。β-折疊結(jié)構(gòu)，無論是平行還是反平行，都是通過氫鍵來穩(wěn)定的。無規(guī)則卷曲則可以賦予蛋白質(zhì)極大的靈活性，這對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)來說是必不可少的。

酰胺I帶（1700~1600 cm?1的光譜區(qū)域）揭示了多肽結(jié)構(gòu)的振蕩與蛋白質(zhì)連接的C=O鍵的拉伸振動(dòng)有關(guān)[27]。振蕩使得酰胺I帶對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變很敏感，因此酰胺I帶也被稱為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的指紋[28?29]。通過將光譜的酰胺I帶（圖2）進(jìn)行去卷積來預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分比。從表1中可以看出，超聲處理對(duì)7S和11S的二級(jí)結(jié)構(gòu)有顯著影響（P<0.05）。超聲處理使7S的β-折疊展開，同時(shí)形成α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。經(jīng)不同超聲時(shí)間和功率條件處理的7S各結(jié)構(gòu)含量差別較小，尤其是無規(guī)則卷曲的含量，各樣品之間差異不顯著（P>0.05）。與未處理組，11S蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量略有減少，而β-折疊的含量在超聲條件為1350 W、30 min時(shí)增加了5.95%。β-折疊一般埋藏在多肽鏈內(nèi)部[30]，因此β-折疊的減少說明超聲處理改變了蛋白的空間構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散。無規(guī)則卷曲含量的增加進(jìn)一步證實(shí)了超聲處理過程中形成了更多無序的分子結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)含量的變化可能是由于超聲處理誘導(dǎo)了氫鍵的變化，導(dǎo)致11S的疏水區(qū)域暴露度進(jìn)一步增強(qiáng)[31]。在以往的研究中，Zou等[32]報(bào)道，隨著超聲處理時(shí)間的延長，貽貝肌漿蛋白的α-螺旋的含量降低（從36.9%到29.2%），β-折疊含量增加了6.2%。Wang等[33]則報(bào)道了超聲處理使α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊含量減少。這些研究同樣表明，超聲處理可以破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵等分子間相互作用，從而削弱蛋白質(zhì)的剛性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[34]。

表1 7S和11S的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 1 Secondary structure contents of 7S and 11S

圖2 超聲處理前后7S和11S紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra for the ultrasound treated and untreated 7S and 11S

2.3 7S和11S內(nèi)源熒光光譜分析

蛋白質(zhì)中的色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr），尤其是Trp殘基，與蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)密切相關(guān)，可以用來描述蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[5]。而Trp和Tyr基團(tuán)周圍的局部分子環(huán)境變化可以通過蛋白的熒光光譜反映出來[35]。圖3展示了7S和11S在進(jìn)行和未進(jìn)行超聲處理時(shí)的內(nèi)源熒光光譜，可以看出7S和11S的熒光發(fā)射峰的最大吸收波長（λmax）分別在348 nm和352 nm處，并且在超聲處理后保持不變。但未進(jìn)行超聲處理的7S和11S的熒光強(qiáng)度均為最高，而超聲處理后所有樣品的熒光強(qiáng)度均有不同程度的下降。具體來說，隨著超聲功率的增大，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，且在超聲條件為450 W、30 min 時(shí)7S和11S熒光強(qiáng)度降低幅度最大，分別高達(dá)12.65%和6.82%。超聲處理后熒光強(qiáng)度的降低與Wen等[36]的報(bào)道結(jié)果一致。熒光強(qiáng)度降低的可能原因是本實(shí)驗(yàn)相對(duì)于其他報(bào)道中使用了更高的超聲強(qiáng)度，在極端的超聲強(qiáng)度下，蛋白質(zhì)分子暴露的發(fā)色團(tuán)被淬滅，從而降低了熒光強(qiáng)度[37]。此外，超聲處理會(huì)導(dǎo)致更多的發(fā)色團(tuán)被埋沒，變得無法檢測，這也可能是熒光強(qiáng)度降低的原因之一[5]。但當(dāng)超聲功率為1350 W 時(shí)，超聲促使蛋白中部分被掩埋的發(fā)色基團(tuán)重新暴露，形成了一個(gè)反復(fù)的過程，這使得熒光強(qiáng)度又重新有所升高，但仍低于未經(jīng)過超聲處理的樣品。這種超聲處理后熒光強(qiáng)度降低但λmax不變的結(jié)果表明，超聲處理對(duì)Trp和Tyr等發(fā)色團(tuán)周圍的極性微環(huán)境影響較小，但會(huì)影響發(fā)色團(tuán)的暴露，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生一些變化[38]。

圖3 超聲處理前后7S和11S內(nèi)源熒光光譜圖Fig.3 Intrinsic fluorescence spectroscopy of 7S and 11S with and without sonication

2.4 7S和11S粒徑分布分析

蛋白質(zhì)的聚集程度可以通過測量顆粒的大小來表示[39]。如圖4所示，未經(jīng)過超聲處理的7S和11S的粒徑分布均呈現(xiàn)雙峰，且峰差明顯。7S的峰值強(qiáng)度分別位于43.8和225 nm處，11S的峰值強(qiáng)度分別位于37.8和220 nm處。出現(xiàn)這種分布，第一個(gè)峰可能是由于低聚物或單體的存在，第二個(gè)峰則是由于較大的聚集物所致[40]。超聲處理后，7S和11S的粒徑分布均向小顆粒方向移動(dòng)，且蛋白質(zhì)的粒徑分布范圍縮小。對(duì)于7S，在以450 W持續(xù)超聲處理30 min時(shí)，粒徑減小最為明顯；而對(duì)于11S，在1350 W的功率下持續(xù)超聲處理30 min時(shí)，粒徑減小最為明顯。超聲處理后蛋白質(zhì)粒徑的減小可能是由于超聲空化和聲流的綜合效應(yīng)，它們提高了蛋白質(zhì)顆粒的碰撞速度和強(qiáng)度，導(dǎo)致大的蛋白質(zhì)聚集體被分解成更小的碎片，同時(shí)降低了蛋白質(zhì)顆粒的粒徑[41?42]。隨著粒徑的減小，蛋白質(zhì)和水分子之間接觸的表面積增加，這可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與水的相互作用增強(qiáng)，進(jìn)而增加溶解度。多項(xiàng)研究表明，超聲處理可以減小蛋白質(zhì)的粒徑。Arredondo-Parada等[43]對(duì)巨魷地幔的蛋白濃縮物進(jìn)行超聲處理后，發(fā)現(xiàn)功率為38 W的超聲處理比22 W處理更能降低蛋白的粒徑。然而，與本文結(jié)果相反，Gülseren等報(bào)道[44]，當(dāng)超聲處理時(shí)間超過40 min時(shí)，牛血清白蛋白的平均粒徑隨著超聲處理時(shí)間的延長而增加，這種現(xiàn)象的可能原因是過長的超聲處理時(shí)間反而促進(jìn)了蛋白質(zhì)聚集。

圖4 超聲處理前后7S和11S的粒度分布Fig.4 Particle size distribution of 7S and 11S with and without sonication

2.5 7S和11S表面疏水性分析

蛋白質(zhì)的表面疏水性（H0）可以用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)受構(gòu)象變化影響導(dǎo)致的功能特性變化[45]。它衡量蛋白質(zhì)中暴露的疏水氨基酸殘基的數(shù)量，同時(shí)也表現(xiàn)蛋白質(zhì)親水/疏水基團(tuán)之間的平衡，反映了蛋白質(zhì)的展開程度[46]。7S和11S的表面疏水性如圖5所示。從圖中可以看出，隨著超聲強(qiáng)度和時(shí)間的增加，樣品的H0逐漸增大。超聲處理后的7S和11S的H0均顯著高于對(duì)照樣品（P<0.05）。當(dāng)超聲處理?xiàng)l件為1350 W，持續(xù)30 min時(shí)，7S的H0從16299增加到64608，11S的H0在此條件下也是最高的，比未進(jìn)行超聲處理的11S增加了約157%。此外，在同樣的超聲處理?xiàng)l件下，11S的疏水性始終高于7S。Zhang等[47]也發(fā)現(xiàn)，超聲處理后，雞胸肉中肌纖維蛋白的H0增強(qiáng)。對(duì)這一現(xiàn)象的一種可能的解釋是，超聲處理過程中不同空化水平引起的湍流、剪切和微流體效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的擾動(dòng)，促進(jìn)了蛋白質(zhì)側(cè)鏈的部分展開[48]。這種展開導(dǎo)致之前被阻斷的疏水基團(tuán)的暴露，進(jìn)一步導(dǎo)致了探針與之前被阻斷的疏水位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，H0增加[49]。

圖5 不同超聲處理?xiàng)l件對(duì)7S和11S表面疏水性的影響Fig.5 Analysis of surface hydrophobicity of 7S and 11S with and without sonication

2.6 7S和11S差示掃描量熱法分析

DSC是一種研究蛋白質(zhì)熱變性和熱力學(xué)性質(zhì)的通用方法，因?yàn)樗梢燥@示超聲后不同處理?xiàng)l件導(dǎo)致的蛋白質(zhì)自然結(jié)構(gòu)損傷的空間變化[50]。圖6顯示了經(jīng)過超聲處理和未經(jīng)過超聲處理的7S和11S的DSC圖，所有樣品都觀察到了吸熱曲線。同時(shí)分析了變性溫度（T峰）以及焓值來評(píng)估7S和11S的變性程度。由表2中數(shù)據(jù)可以看出，未經(jīng)超聲處理的7S和11S的變性溫度分別為77.29和93.93 °C，這與之前的研究結(jié)果基本一致[51]。超聲處理后，蛋白質(zhì)的焓值（ΔH）與對(duì)照組相比均出現(xiàn)了減小。一般來說，ΔH與誘導(dǎo)構(gòu)象變化所需的能量有關(guān)，而T峰則反映了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[20]。在6種超聲處理?xiàng)l件下，7S的ΔH由1.22 J/g最多下降到0.17 J/g，11S的ΔH由1.41 J/g最多下降到0.53 J/g。超聲處理后的7S和11S需要較少的能量來展開蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，反映出蛋白原有的空間結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)被超聲所破壞，從而降低了蛋白質(zhì)變性所需的能量[52]。而7S和11S之間ΔH變化程度的差異可能是由于11S的結(jié)構(gòu)更為致密，二硫鍵更多更穩(wěn)定。因此，11S受超聲處理的影響比缺乏二硫鍵的7S小。這種穩(wěn)定性的差異也可以通過2.3所述的超聲處理后熒光強(qiáng)度下降的程度反映出來。另外，觀察到T峰位置隨超聲處理而變化，但變化不明顯。T峰與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)，所以T峰的輕微變化是由于超聲處理后7S和11S的結(jié)構(gòu)變化造成的[33]，而這種結(jié)構(gòu)變化可能是由于蛋白質(zhì)中疏水鍵的改變。Mir等[53]也報(bào)道了藜麥種子分離蛋白的類似結(jié)果。超聲處理25 min后，藜麥種子蛋白的ΔH從46.78 J/g下降到38.75 J/g。

圖6 超聲處理前后的7S和11S的DSC圖Fig.6 DSC thermograms of 7S and 11S with and without sonicatio

表2 超聲處理后的7S和11S的DSC分析Table 2 Analysis of DSC of 7S and 11S with and without sonication

2.7 7S和11S溶解度分析

由于溶解度是一種影響蛋白質(zhì)功能特性的重要性質(zhì)，本文測定了7S和11S在超聲處理后和未經(jīng)過超聲處理時(shí)的溶解度。如圖7所示，與未經(jīng)超聲處理的7S相比，所有超聲處理后的7S的溶解度均顯著增加（P<0.05）。在6種不同的處理?xiàng)l件下，7S的溶解度分別增加了3.14%、4.30%、6.18%、3.08%、9.32%和12.85%。在超聲處理?xiàng)l件為450 W、30 min時(shí)，7S的溶解度增加最少。11S表現(xiàn)出與7S相似的變化規(guī)律，超聲處理使其溶解度最高增加10.57%。但當(dāng)強(qiáng)度和時(shí)間分別為1350 W和15 min時(shí)，11S的溶解度沒有明顯改善（P>0.05）。

圖7 不同超聲處理對(duì)7S和11S溶解度的影響Fig.7 The effects of different sonication conditions on solubility of 7S and 11S

在自然狀態(tài)下，蛋白質(zhì)以聚集的形式存在。而超聲處理破壞了蛋白質(zhì)的分子內(nèi)鍵，使肽鏈變得疏松，促進(jìn)了可溶性蛋白質(zhì)聚合體或單體的形成[54]。此時(shí)蛋白質(zhì)與水分子結(jié)合的能力增強(qiáng)，從而提高其溶解度。Jiang等[55]也提出，蛋白質(zhì)分子與一些較小顆粒解聚形成亞單位的過程是溶解度提高的有效驅(qū)動(dòng)力。蛋白質(zhì)溶解度增強(qiáng)的另一個(gè)可能原因是超聲處理在蛋白質(zhì)表面制造了高速的聲波流動(dòng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面活性增加，親水性增強(qiáng)[56]。然而，隨著超聲功率的持續(xù)增加及時(shí)間的延長，7S和11S的溶解度又出現(xiàn)了一定程度的下降。這一現(xiàn)象可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子進(jìn)一步展開和膨脹，暴露出了更多的疏水基團(tuán)和巰基[33]。這些結(jié)果表明，超聲處理對(duì)蛋白質(zhì)的影響是一個(gè)反復(fù)的過程，其效果可能因蛋白質(zhì)和超聲處理?xiàng)l件的不同而不同。

2.8 7S和11S的乳化性及乳化穩(wěn)定性

乳化性能表示蛋白質(zhì)單位重量穩(wěn)定的界面面積，表征蛋白質(zhì)對(duì)油水界面的吸附能力[57]。超聲處理對(duì)7S和11S的乳化性能（EAI和ESI）的影響如圖8所示。兩種蛋白經(jīng)超聲處理后，EAI均顯著高于對(duì)照組樣品（P<0.05）。7S超聲處理?xiàng)l件為1350 W，30 min時(shí)，EAI增加80.55%，11S超聲處理?xiàng)l件為450 W，30 min時(shí)，EAI增加48.96%。而當(dāng)超聲處理?xiàng)l件為1350 W時(shí)，11S的EAI有所下降，但仍高于未經(jīng)超聲處理的樣品。7S和11S的ESI與EAI的變化趨勢(shì)相似，超聲處理后均顯著升高（P<0.05）。這一發(fā)現(xiàn)與已發(fā)表的幾項(xiàng)研究一致，這些研究報(bào)道了超聲處理過的乳清蛋白[15]、小麥谷蛋白[58]的EAI和ESI都有顯著（P<0.05）的改善。超聲處理減小了7S和11S的顆粒大小，部分展開了7S和11S的結(jié)構(gòu)。更無序的結(jié)構(gòu)增加了蛋白質(zhì)在油水界面的吸附傾向[20]，從而提高了7S和11S的EAI。此外，更高的溶解度也加速了蛋白質(zhì)在界面上的擴(kuò)散。ESI與蛋白質(zhì)的高疏水性之間有很強(qiáng)的正相關(guān)性[59]。表面疏水性的增加增強(qiáng)了界面蛋白之間的疏水性相互作用，從而提高了ESI。

圖8 超聲處理對(duì)7S和11S EAI和ESI的影響Fig.8 The effects of ultrasound treatment on EAI and ESI of 7S and 11S

2.9 7S和11S冷凍電鏡表征

為了進(jìn)一步觀察不同超聲處理?xiàng)l件對(duì)7S和11S結(jié)構(gòu)的影響，拍攝了如圖9所示的蛋白質(zhì)溶液冷凍電鏡照片。圖中可以很明顯地觀察到7S和11S在經(jīng)過和未經(jīng)過超聲處理時(shí)的不同圖像。對(duì)于7S，隨著超聲強(qiáng)度和時(shí)間的增加，可以觀察到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從有序的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（A~G）逐漸發(fā)生變化。當(dāng)樣品在150 W的強(qiáng)度下超聲處理30 min時(shí)，7S結(jié)構(gòu)已經(jīng)變得疏松（C）。當(dāng)超聲處理?xiàng)l件為1350 W，持續(xù)30 min時(shí)，蛋白質(zhì)表面更粗糙，更不規(guī)則（G）。而沒有經(jīng)過超聲處理的11S則以有序、分散的結(jié)構(gòu)存在（H）。在450 W的功率下，超聲處理后的11S微觀結(jié)構(gòu)長度比對(duì)照組變短（K、L）。在超聲功率為1350 W的處理下，11S顯現(xiàn)出更多的無序結(jié)構(gòu)和許多不規(guī)則的孔隙（M、N）。7S和11S發(fā)生這些變化可能是因?yàn)槌曁幚砥茐牧说鞍踪|(zhì)分子之間的交聯(lián)[60]。這使得分子結(jié)構(gòu)隨著蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象的變化而展開[29]。這些結(jié)果與超聲處理下蛋白質(zhì)顆粒大小的變化是一致的，并為超聲處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)團(tuán)聚體破壞的假說增加了證據(jù)。

圖9 超聲處理前后7S（A~G）和11S（H~N）冷凍電鏡分析Fig.9 Cryo-scanning electron microscopy analysis of 7S （A-G） and 11S （H-N） with and without sonication

3 結(jié)論

超聲處理不改變7S和11S的分子量，但可以破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵等分子間相互作用，削弱蛋白質(zhì)的剛性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。超聲處理使蛋白質(zhì)分子暴露的生色團(tuán)淬滅，樣品的熒光強(qiáng)度下降。經(jīng)超聲處理后，7S和11S樣品焓值下降，展開蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)所需的能量變少。超聲處理提高了7S和11S的表面疏水性、溶解性和乳化性，減小了平均粒徑，且粒徑分布范圍縮小，7S和11S從較為有序的網(wǎng)狀聚集狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序的狀態(tài)。

以上結(jié)果表明超聲處理能一定程度地調(diào)控7S和11S的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改善其理化特性。本研究為超聲處理7S和11S對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)產(chǎn)生的影響提供了部分參考，使超聲改性蛋白的合理應(yīng)用有一定的理論依據(jù)。