杜椅楠，閻佳楠，王昱喬，姜昕昱，許詩(shī)琦，吳海濤,2,

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034；2.國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116034）

大黃魚(yú)是我國(guó)近海主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，其因味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富而深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。2020年，我國(guó)大黃魚(yú)產(chǎn)量高達(dá)25.4萬(wàn)噸。目前，大黃魚(yú)的主要加工方式是鮮食或加工成魚(yú)罐頭等，魚(yú)卵約占魚(yú)體總質(zhì)量的15%~20%[1]，加工過(guò)程中，大黃魚(yú)卵大多作為副產(chǎn)物被丟棄或制備成低值飼料，而魚(yú)卵中蛋白含量豐富，這就造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。前期研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)鹽溶法可以從大黃魚(yú)卵中獲得分離蛋白。經(jīng)鑒定，分離蛋白的主要組成為卵黃蛋白原、卵黃蛋白原B和卵黃蛋白原C，且其具有良好的持水特性[2]。因此，進(jìn)一步研究大黃魚(yú)卵分離蛋白的凝膠特性對(duì)大黃魚(yú)的高值化利用具有重要意義。

近年來(lái)，有關(guān)蛋白質(zhì)凝膠特性的研究日益增多。凝膠特性是蛋白質(zhì)的重要特性之一，在食品工業(yè)中，蛋白質(zhì)的凝膠化會(huì)影響產(chǎn)品的感官特性，尤其是產(chǎn)品質(zhì)地，因此適當(dāng)添加具有凝膠能力的蛋白質(zhì)可以改善食品品質(zhì)[3]。研究顯示，大豆蛋白[4]、花生蛋白[4]、乳清蛋白[5]、豬肉[6]、雞肉[7]、魚(yú)類(lèi)肌原纖維蛋白[8]、雞蛋蛋白[9]等均具有良好的凝膠特性。LI等[10]研究發(fā)現(xiàn)從大黃魚(yú)（Pseudosciaena crocea）肌肉中獲取的肌原纖維蛋白表現(xiàn)出較好的凝膠特性。然而，關(guān)于大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠特性的研究，還未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究以大黃魚(yú)卵分離蛋白為研究對(duì)象，利用熱誘導(dǎo)凝膠化的方法制備大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠，并對(duì)其成膠條件和凝膠特性進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用大黃魚(yú)卵奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃魚(yú)卵 山東青島魚(yú)姐有限公司，經(jīng)勻漿、冷凍干燥后獲得均勻的大黃魚(yú)卵凍干粉，于?30 ℃冷凍保存；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Discovery HR-1流變儀 美國(guó)TA公司；Meso-MR23-060V-1核磁共振成像分析儀 上海紐邁公司；Hitachi冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本株式會(huì)社日立制作所；PP3010T cryo-SEM掃描電鏡冷凍傳輸系統(tǒng) 英國(guó)Quorum科技公司；PHS-3精密pH計(jì)

上海雷磁儀器公司；Frontier紅外光譜儀 美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大黃魚(yú)卵分離蛋白的制備 參照前期的研究方法制備大黃魚(yú)卵分離蛋白[2]。取10 g大黃魚(yú)卵凍干粉，按照1:10（w/v）的料液比加入0.6 mol/L的NaCl溶液，攪拌浸提2 h，離心（8000 r/min，15 min）后除去上層油脂并收集中間層清液。剩余固體物質(zhì)再按照1:10（w/v）的料液比加入相同溶液攪拌浸提1 h后再次離心，混合兩次離心以后的中間層清液。將溶液于4 ℃條件下用去離子水透析除鹽72 h后凍干，即得大黃魚(yú)卵分離蛋白。

1.2.2 大黃魚(yú)卵分離蛋白最低凝膠濃度的確定 制備濃度為50、75和100 mg/mL的大黃魚(yú)卵分離蛋白溶液，并用0.5 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至9.0，將溶液置于85 ℃水浴中加熱20 min，于室溫下放置12 h穩(wěn)定凝膠后測(cè)定其流變特性。

1.2.3 大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的制備 參照DàVILA等[11]的方法制備大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠。首先制備濃度為100 mg/mL的大黃魚(yú)卵分離蛋白溶液，并用0.5 mol/L的HCl溶液或0.5 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，后將溶液置于85 ℃水浴中加熱20 min使其凝膠化制得大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠，在進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)前將大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠于室溫下放置12 h使其穩(wěn)定。

1.2.4 大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的特性分析

1.2.4.1 流變特性 參照YAN等[12]的方法進(jìn)行測(cè)定。用流變儀對(duì)不同pH條件下制備的大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的流變特性進(jìn)行分析。測(cè)試參數(shù)為：40 mm的平行板夾具，溫度：25 ℃，進(jìn)行頻率掃描模式的測(cè)量，掃描范圍分別為：頻率：0.1~10 Hz，應(yīng)變：0.3%。此外還探究了溫度對(duì)大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的影響，將樣品直接放置于流變儀上，測(cè)試參數(shù)設(shè)置為：40 mm的平行板夾具，溫度范圍：4~80 ℃，升溫/降溫速率：4 ℃/min，保留時(shí)間：3 min，頻率：1 Hz，應(yīng)變：0.3%，進(jìn)行溫度掃描模式的測(cè)量。所設(shè)應(yīng)變值在蛋白凝膠的線性黏彈區(qū)內(nèi)。

1.2.4.2 大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠中的水分分布測(cè)定

參照YAN等[13]的方法進(jìn)行測(cè)定。將2 g凝膠樣

品放入特定塑料管中，并插入核磁共振成像分析儀的樣品床中，設(shè)定參數(shù)分別為：τ值：100，回波NECH的數(shù)量：5000，TW：3000 ms，掃描之間的重復(fù)時(shí)間：8 s。每個(gè)樣品至少重復(fù)測(cè)定三次并通過(guò)MultiExp Inv分析軟件擬合Carr-Purcell-Meiboom-Gill衰變曲線的NMR T2數(shù)據(jù)分布。

1.2.4.3 掃描電鏡（SEM）測(cè)定 將不同處理的凝膠樣品用液氮淬斷，在Hitachi冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下放大5000倍，觀察凝膠截面的微觀形態(tài)。每組不同部位重復(fù)掃描3次。

1.2.4.4 紅外光譜測(cè)定 將1 mg凝膠凍干粉與100 mg干燥的溴化鉀粉末混勻，研磨并壓制成薄盤(pán)。通過(guò)紅外光譜儀記錄樣品在4000~400 cm?1之間的紅外光譜，并使用OMNIC 8.2軟件分析光譜中的峰值信號(hào)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，進(jìn)行平均值計(jì)算，利用Origin 2017 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃魚(yú)卵分離蛋白的最低凝膠濃度

采用流變儀對(duì)不同濃度制備的大黃魚(yú)卵分離蛋白的流變特性進(jìn)行分析。由圖1可知，隨著分離蛋白濃度的增加，凝膠的儲(chǔ)能模量（G’）和損耗模量（G”）都增加，表明凝膠的黏性和彈性都與濃度呈現(xiàn)出一定的依賴(lài)關(guān)系。且在75及100 mg/mL的濃度條件下，G’和G”平行且與頻率之間呈現(xiàn)出線性相關(guān)關(guān)系，這是一種典型的凝膠頻率掃描結(jié)果[14]。此外，在50 mg/mL的濃度條件下，樣品的tanδ不穩(wěn)定，而75、100 mg/mL條件下制得的樣品其tanδ分別穩(wěn)定在0.50和0.14左右，表明75 mg/mL的樣品相對(duì)黏性較強(qiáng)，因而呈現(xiàn)出一定的流動(dòng)狀態(tài)，而在100 mg/mL濃度條件下凝膠的tanδ值較小，表明凝膠形成更為緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使得蛋白熱誘導(dǎo)凝膠傾向于固體，更有彈性。因此，這些結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)探究的大黃魚(yú)卵分離蛋白最低凝膠濃度是100 mg/mL。

圖1 不同濃度下大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的頻率掃描Fig.1 The frequency sweep of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea） roe protein isolate gels at different concentration

2.2 大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的流變特性分析

在大黃魚(yú)卵分離蛋白濃度為100 mg/mL的條件下，分離蛋白在pH4.0~6.0的條件下無(wú)法形成凝膠，呈現(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)，在pH7.0~9.0的條件下可以形成凝膠，結(jié)果如圖2所示。因此進(jìn)一步探究pH對(duì)大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠特性的影響。

圖2 不同pH下大黃魚(yú)卵分離蛋白的外觀形態(tài)Fig.2 The visual appearance of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea） roe protein isolates at different pH

流變特性是膠體的重要特性之一，可以用來(lái)表現(xiàn)流體的彈性特征和黏性特征[15?16]。圖3a是不同pH條件下制備的大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的儲(chǔ)能模量（G’）和損耗模量（G”）與振蕩頻率關(guān)系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在pH8.0條件下制得的蛋白質(zhì)凝膠的儲(chǔ)能模量和損耗模量均高于其他pH條件下制得的分離蛋白凝膠。這主要是由于大黃魚(yú)卵分離蛋白的等電點(diǎn)約為pH6.0左右，溶液的pH增加會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解度，從而改善凝膠性質(zhì)[17]。但是，當(dāng)溶液的pH較高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生更多的負(fù)電荷，這會(huì)影響蛋白質(zhì)分子之間的靜電相互作用，而靜電相互作用是形成凝膠的主要?jiǎng)恿18]。所以大黃魚(yú)卵分離蛋白的黏性和彈性隨著pH的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。

圖3 不同pH下大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的頻率掃描（a）和溫度掃描（b）Fig.3 The frequency sweep（a） and temperature sweep（b） of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea） roe protein isolate gels prepared at different pH

溫度掃描進(jìn)一步評(píng)估了溫度變化對(duì)大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠流變特性的影響。如圖3b所示，在加熱過(guò)程中，大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的儲(chǔ)能模量均有所下降，但是在冷卻后能夠再次升高，甚至高于初始的模量強(qiáng)度，除了在pH9.0條件下制備的大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠在經(jīng)過(guò)加熱冷卻后的儲(chǔ)能模量稍低于初始狀態(tài)。這是由于隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)凝膠體系的黏度降低，流動(dòng)性增大，蛋白質(zhì)分子間的相互作用減弱，其儲(chǔ)能模量隨之降低，但是一直維持在100 Pa以上，隨后隨著溫度的下降，蛋白質(zhì)分子間相互作用逐漸增強(qiáng)，使其能夠恢復(fù)到初始的凝膠狀態(tài)。此外，在pH8.0條件下制備的大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的儲(chǔ)能模量明顯高于在其他pH條件下制備的分離蛋白凝膠，這與頻率掃描的結(jié)果相一致。RENKEMA等[19]發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白凝膠的儲(chǔ)能模量也在加熱過(guò)程中下降，在冷卻后會(huì)再次增加。這些結(jié)果表明，大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠在加熱和冷卻條件下是比較穩(wěn)定的，可應(yīng)用于某些需要加熱制備的食品中以改善其凝膠特性。

2.3 大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的水分分布

低場(chǎng)核磁共振技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于肉制品、果蔬等食品領(lǐng)域的檢測(cè)，可以無(wú)損高效的檢測(cè)產(chǎn)品的水分狀態(tài)及含量[20?21]。從大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的弛豫時(shí)間圖譜(圖4)可以看出，大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的T2在0.01~10000 ms范圍內(nèi)只有一個(gè)峰，出現(xiàn)于100~1000 ms之間，代表自由水[13]。進(jìn)一步通過(guò)在8000 r/min離心10 min的方法檢測(cè)其持水性，結(jié)果表明，在pH7.0條件下制得的凝膠持水力為（94.1%±0.4%），而在pH8.0和pH9.0條件下制得的凝膠經(jīng)過(guò)離心后無(wú)水分析出，持水力接近100%，該結(jié)果表明

圖4 不同pH下大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的弛豫時(shí)間T2Fig.4 The relaxation time（T2） of of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea） roe protein isolate gels prepared at different pH

盡管樣品中含有的水分組成主要為自由水，但蛋白凝膠仍具有較好的持水能力，這可能主要是由于蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而截留了較多的水分子。此外，隨著pH的增加，大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的弛豫時(shí)間曲線向左偏移，表明分離蛋白凝膠與水的結(jié)合力增加。這一結(jié)果與LI等[22]的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)隨著pH的增加，熱誘導(dǎo)制備的雞蛋清蛋白凝膠的弛豫時(shí)間曲線也呈現(xiàn)向左偏移的趨勢(shì)。前期研究表明，大黃魚(yú)卵分離蛋白的等電點(diǎn)約為pH6.0，在溶液的pH逐漸遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)具有更大的溶解性，且在pH7.0~9.0的條件下，蛋白質(zhì)溶解度為86.9%~97.4%[2]。因此，隨著成膠pH的增大，蛋白質(zhì)溶解度增加可能會(huì)促進(jìn)了更多的水分子與蛋白質(zhì)結(jié)合。此外，pH的上升增加了蛋白質(zhì)攜帶的凈電荷數(shù)量，促進(jìn)蛋白質(zhì)之間形成了更加致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)了凝膠的保水能力[17]。

2.4 大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)

冷場(chǎng)掃描電鏡因其可以直觀地顯示蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)而被廣泛用于研究蛋白質(zhì)凝膠的微觀結(jié)構(gòu)[23?24]。如圖5所示，大黃魚(yú)卵分離蛋白經(jīng)熱誘導(dǎo)后可以形成具有連續(xù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠。在pH7.0條件下制備的分離蛋白凝膠表面相對(duì)粗糙，出現(xiàn)斷裂，但是在pH8.0和pH9.0條件下制備的凝膠具有更加光滑的表面，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加連續(xù)。這主要是由于pH可以影響蛋白質(zhì)的溶解度并改變蛋白質(zhì)凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。此外，大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠結(jié)構(gòu)在較高pH條件下更加細(xì)化緊致，對(duì)水分流動(dòng)的阻滯能力更強(qiáng)，因而持水力更強(qiáng)，這與持水力的結(jié)果一致。熱誘導(dǎo)的羊肌原纖維蛋白[25]、乳清蛋白和大豆蛋白的混合物[26]、血漿蛋白和雞肉肌原纖維的混合蛋白[27]凝膠也表現(xiàn)出與本研究相似的多孔結(jié)構(gòu)。ZHANG等[28]也發(fā)現(xiàn)，pH的增加會(huì)導(dǎo)致雞肉肌原纖維蛋白凝膠形成更加有序、多孔的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果表明在堿性條件下制備的大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠結(jié)構(gòu)更加連續(xù)，這也可能是其能夠保留更多自由水的原因。

圖5 pH對(duì)大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 The effect of pH on the microstructures of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea） roe protein isolate gels

2.5 大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的紅外光譜

紅外光譜可以進(jìn)一步用來(lái)探究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變及其特征基團(tuán)的變化[29]。如圖6所示，大黃魚(yú)卵分離蛋白紅外光譜特征峰出現(xiàn)于1531 cm?1（酰胺II帶），1657 cm?1（酰胺I帶）和3293 cm?1（酰胺A帶）。與大黃魚(yú)卵分離蛋白凍干粉的紅外光譜相比，在不同pH下制備的分離蛋白凝膠光譜中特征峰的位置沒(méi)有明顯變化，表明溶液的pH改變對(duì)分離蛋白的特征基團(tuán)沒(méi)有明顯的作用。SONG等[30]的研究也發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白的FTIR譜圖中特征峰位置與其熱誘導(dǎo)凝膠之間沒(méi)有明顯差異。

圖6 不同pH下大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠的紅外光譜Fig.6 The FTIR spectra of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea） roe protein isolate gels prepared at different pH

3 結(jié)論

本文研究了pH對(duì)大黃魚(yú)卵分離蛋白凝膠特性的影響，結(jié)果表明，大黃魚(yú)卵分離蛋白在pH4.0~6.0的條件下無(wú)法形成凝膠，在pH7.0~9.0的條件下可以形成熱誘導(dǎo)凝膠，且分離蛋白最低成膠濃度為100 mg/mL，在pH8.0條件下制備的分離蛋白凝膠具有最大的儲(chǔ)能模量G’。此外隨著成膠pH的增加，蛋白凝膠具有更高的持水能力和更加致密均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，后續(xù)研究將圍繞大黃魚(yú)卵分離蛋白的成膠機(jī)制及其在食品加工中的應(yīng)用進(jìn)行深入探討。