闕 鳳，高天麒，汪 超，熊光權(quán)，石 柳，吳文錦，喬 宇，丁安子，李 新，汪 蘭,

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430068；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究分中心，湖北武漢 430064）

隨著中國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)的穩(wěn)步發(fā)展，淡水魚產(chǎn)量不斷提高，魚類產(chǎn)品加工業(yè)不斷發(fā)展，對(duì)草魚的需求不斷增加。草魚是中國(guó)傳統(tǒng)的四大家魚之一，是重要的淡水魚品種，價(jià)格優(yōu)、產(chǎn)量高及肉厚刺少等特點(diǎn)使其常作為魚糜加工的主要原料之一[1]。魚糜制品是魚類深加工中的產(chǎn)品，大多為魚糜凝膠，因其高蛋白、低膽固醇、低脂肪、口感鮮嫩、食用方便等特點(diǎn)，具有廣闊的利用價(jià)值，越來越受到消費(fèi)者的重視[2]。為了延長(zhǎng)魚糜制品貨架期，最常用的方法是低溫儲(chǔ)存；然而，魚肉蛋白質(zhì)在凍藏過程中容易發(fā)生變性，導(dǎo)致魚肉品質(zhì)惡化，魚肉蛋白質(zhì)的保水性、可溶性和凝膠性等功能降低，將會(huì)影響魚糜制品的味道和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]。通常采用添加抗凍劑的方式防止魚糜蛋白質(zhì)冷凍變性，當(dāng)前商用抗凍劑主要包括4%蔗糖和4%山梨糖醇的混合物（簡(jiǎn)稱“商業(yè)抗凍劑”）。且在工業(yè)化生產(chǎn)的魚糜中添加4%~8%的蔗糖作為冷凍保護(hù)劑，但是蔗糖的甜度和熱量較高，不符合現(xiàn)代生活中人們對(duì)健康飲食的追求[4]，關(guān)于開發(fā)低甜度、低熱量抗凍劑的研究有待進(jìn)一步深入。

葡聚糖是以葡萄糖為單糖組成的同型多糖，葡萄糖單元之間由糖苷鍵相連接，僅由D-葡萄糖組成，主鏈?zhǔn)铅粒?，6）鍵，也有α（1，4）或α（1，3）鍵的支鏈。它能夠減少低密度脂蛋白含量，提高高密度脂蛋白的含量。海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子以α,α,1,1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，甜度是蔗糖的45%，性質(zhì)穩(wěn)定[5]。海藻糖能較好地防止蛋白質(zhì)在冷凍、高溫或干燥時(shí)變性，有效保護(hù)蛋白質(zhì)分子的天然結(jié)構(gòu)，使食品的風(fēng)味和質(zhì)地保持不變[6]。低聚果糖是由β-D-呋喃果糖苷酶作用于蔗糖，使蔗糖分子中的D-果糖以β-（2→1）糖苷鏈連接1~3個(gè)果糖而成的，屬于果糖和葡萄糖構(gòu)成的直鏈雜低聚糖，具有超強(qiáng)雙歧因子和水溶性膳食纖維，有類似于糖或葡萄糖漿的功能，提供良好平衡的甜味特征[7]，其甜度為蔗糖的30%~60%。低聚木糖是一種低分子量功能性多糖，由2~7個(gè)木糖分子和β-1，4糖苷鍵組成。蘇趙等[8]的研究表明海藻糖能抑制草魚魚糜蛋白在凍藏過程中的變性，延緩魚糜凍藏品質(zhì)的下降。Chou等[9]的研究表明，添加低聚木糖，在低溫條件下鹽溶性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和溶解性高于添加其他糖類或組合，推測(cè)低聚木糖可能會(huì)降低蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)的暴露。Wang[10]指出魚糜凝膠中添加魔芋葡甘露聚糖（KGM）會(huì)影響魚糜凝膠的持水性、膠強(qiáng)度和變性。多糖是高分子量聚合物，廣泛用于食品的增稠、成膜、凝膠等，多糖和蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用形成復(fù)合物，會(huì)改變蛋白質(zhì)凝膠特性[11]。

本實(shí)驗(yàn)擬在魚糜制品加工過程中分別添加4%葡聚糖、蔗糖、海藻糖、低聚果糖、低聚木糖，探討其對(duì)草魚魚糜微觀結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、水分分布、白度、凝膠質(zhì)構(gòu)特性等性質(zhì)的影響，旨在為糖類抗凍劑在魚糜制品加工中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮草魚（質(zhì)量約4 kg） 購(gòu)自白沙洲水產(chǎn)市場(chǎng)；葡聚糖（7000 Da）、蔗糖、海藻糖（378.33 Da）、低聚果糖（180.158 Da）、低聚木糖（300.28~1050.98 Da）、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉、雙縮脲試劑、標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

PL602-L電子天平、AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器 國(guó)華電器有限公司；IKA均質(zhì)機(jī) 廣州東南科創(chuàng)科技有限公司；DHG-9078A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；CR-400/410色彩色差儀 美能達(dá)（中國(guó)）投資有限公司；Eclipse CI光學(xué)顯微鏡、NMI20-025V-I成像系統(tǒng)日本尼康公司；NMI20-025V-I核磁共振成像分析儀

蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；TA.XT 2i/50質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；VERTEX70傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Bruker Optice公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 草魚魚糜凝膠的制備 將新鮮草魚帶冰水于30 min內(nèi)活運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，于4 ℃冷庫(kù)宰殺，去魚鱗、內(nèi)臟，清洗干凈后取草魚背部肉，去除可見的紅色肉、結(jié)締組織等，切碎用斬拌機(jī)低速（5擋）斬拌5 min，將粉碎后的草魚肉用五倍體積的冷水和0.5%NaCl溶液沖洗，然后將碎肉通過四層300目紗布過濾，脫水2次以獲得魚糜，處理過程中溫度保持在10 ℃以下（冷庫(kù)中進(jìn)行）。稱取一定質(zhì)量的魚糜，用斬拌機(jī)低速（5檔）斬拌1 min，分別加入魚糜質(zhì)量2%的NaCl和4%的糖類，將混合物的水分含量調(diào)整至78%，高速（9檔）斬拌5 min后裝入裱花袋，擠壓灌入腸衣，兩端封口，控制其長(zhǎng)度和直徑分別為15 cm和3 cm。將制好的魚腸于90 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min，然后置于冰水中冷卻15 min，于4 ℃冰箱中冷藏過夜，次日取出測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。以不添加糖的魚糜凝膠為空白對(duì)照[12]。

1.2.2 微觀結(jié)構(gòu) 將魚糜凝膠用軟刀片切成2.5 mm×2.5 mm×2.5 mm的小塊置于1.5 mL的離心管中，加入2倍體積的2.5%的戊二醛，置于4 ℃冰箱放置2~24 h；用0.1 mol/L PBS緩沖溶液（pH7.0）洗滌3次，每次浸泡10~15 min；用不同濃度乙醇（30%、50%、70%、90%、100%）進(jìn)行梯度洗脫，每次浸泡10~15 min；100%的乙酸異戊酯洗脫一次浸泡5~10 min，重新更換乙酸異戊酯浸泡樣品，存放于4 ℃冰箱。將樣品冷凍干燥后用導(dǎo)電膠固定在樣品臺(tái)上，樣品表面真空噴金，用掃描電鏡觀察，加速電壓為20 kV[13]。

1.2.3 傅里葉紅外光譜分析 取適量添加不同糖的草魚魚糜凍干樣品置于檢測(cè)器上，程序參數(shù)：掃描范圍4000~400 cm?1，分辨率4 cm?1，掃描頻率10 kHz[14]。

1.2.4 低場(chǎng)核磁共振測(cè)定樣品水分分布 參考李銀等[15]的方法并加以修改，使用NMI20-025V-I核磁共振分析及成像系統(tǒng)測(cè)定樣品水分與組織結(jié)合程度和水分分布情況。將魚糜凝膠切成18 mm×18 mm×20 mm的長(zhǎng)方體，在磁共振成像儀上通過多自旋回波（MSE）成像序列獲得凝膠的質(zhì)子密度成像。重復(fù)時(shí)間為1500 ms，回波時(shí)間為18.2 ms，中心頻率為23.319 MHz。凝膠成像層面為4，每層厚度為2.0 mm。

1.2.5 白度的測(cè)定 參考胡亞芹等[16]的方法，用色度儀測(cè)定并記錄L*（明亮度）、a*（紅綠偏差）和b*（黃藍(lán)偏差）值，每個(gè)樣品測(cè)量平行10次。白度按下列公式計(jì)算：

1.2.6 質(zhì)地剖面分析TPA（Texture profile analysis）測(cè)定 參考王蒙娜等[17]的方法，使用配備有探針P/36R的質(zhì)構(gòu)分析儀進(jìn)行魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)圖分析（TPA）。將凝膠樣品切成厚度為2 cm圓柱體，在40%的壓縮度下壓縮，測(cè)試前和測(cè)試后的速度設(shè)定為2 mm/s，測(cè)試速度為1 mm/s以獲得TPA參數(shù)（硬度、彈性、粘結(jié)性、咀嚼性和回復(fù)性）。使用5.0 g觸發(fā)力，觸發(fā)類型為auto。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2019，Origin-2017及Graph Pad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同糖類對(duì)草魚魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖1所顯示的分別為空白對(duì)照和添加4%的葡聚糖、蔗糖、海藻糖、低聚果糖、低聚木糖的草魚魚糜凝膠在掃描電鏡下的微觀結(jié)構(gòu)。從圖中可以看出空白對(duì)照組魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)組織結(jié)構(gòu)較疏松，孔洞較大（圖1A）；添加葡聚糖、蔗糖的魚糜樣品形成了更緊密的凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔洞較小且分布相對(duì)均勻（圖1B，圖1C）；添加海藻糖的魚糜凝膠較致密，其表面存在較多大小不一的孔洞（圖1D）；添加低聚果糖的魚糜凝膠切面凹凸不平（圖1E）；添加低聚木糖的魚糜凝膠分布較均勻，但表面比較疏松出現(xiàn)了空隙，孔洞較大（圖1F）。多糖分子結(jié)構(gòu)特殊，與魚糜凝膠肌原纖維蛋白結(jié)合相互作用會(huì)形成網(wǎng)絡(luò)交織[11]。添加4%的多糖均有利于草魚肌原纖維蛋白凝膠形成均勻致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且添加葡聚糖和蔗糖的效果最好，可能是糖作為填料填充了蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)之間的間隙，加強(qiáng)其結(jié)構(gòu)[18]。含低聚果糖樣品中無明顯網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成，推測(cè)與添加量有關(guān)，可能是因?yàn)榈途酃蔷酆隙容^?。▓D1E）。精細(xì)而有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)更有可能吸收水[19]，使得魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)中的破裂太嚴(yán)重而不能形成連續(xù)相[7]；不同種類多糖對(duì)魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響不同，這很可能與糖類自身凝膠形成能力有關(guān)。不同種類糖在最適添加量下的魚糜凝膠的致密程度、孔洞大小以及分布存在一定的差異性[20]。

圖1 不同糖類對(duì)魚糜凝膠的微觀掃描電鏡圖（2000×）Fig.1 Electron micrograph of microscopic scanning of surimi gel with different carbohydrates （2000×）

2.2 不同糖類對(duì)草魚魚糜凝膠蛋白的FITR測(cè)定結(jié)果及分析

紅外光譜中酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶可用于定量分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，其中酰胺Ⅰ帶信號(hào)強(qiáng)，但酰胺Ⅰ帶結(jié)構(gòu)中有水振動(dòng)帶的強(qiáng)干擾和相對(duì)非結(jié)構(gòu)化的光譜輪廓等限制[21]。因此，本文采用紅外光譜中酰胺Ⅲ帶（1220~1330 cm?1）分析魚糜凝膠蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖2B所示。α-螺旋和β-折疊為肌原纖維蛋白主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)，空白組、添加蔗糖、海藻糖、低聚果糖、低聚木糖和葡聚糖的魚糜凝膠α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量分別為39.26%、36.99%、35.7%、37.51%、42.85%和39.6%，β-折疊含量為19%~30%。添加低聚木糖樣品中α-螺旋的含量最高為42.85%，葡聚糖樣品中β-轉(zhuǎn)角含量最高為22.23%，海藻糖樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲含量最高為20.87%。與空白相比，添加蔗糖、海藻糖和低聚果糖魚糜凝膠中α-螺旋結(jié)構(gòu)占比下降。Zhuang等[22]報(bào)道添加魔芋葡甘低聚糖會(huì)使豬肉肌原纖維蛋白中α-螺旋含量減少，β-折疊含量增加。Hong等[23]也表明樹膠促進(jìn)了魚糜蛋白的α-螺旋轉(zhuǎn)化為其他結(jié)構(gòu)。添加不同低分子糖類的魚糜凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)不一樣，這可能是由于糖的分子組成及糖苷鍵不一樣，與魚糜蛋白質(zhì)形成凝膠過程中相互作用有差異。

圖2 不同糖類對(duì)魚糜凝膠蛋白的FTIR分析Fig.2 FTIR analysis of different carbohydrates on surimi gel protein

2.3 不同糖類對(duì)草魚魚糜凝膠水分子分布的影響

MRI是利用磁場(chǎng)和射頻脈沖使樣品中的氫核振動(dòng)發(fā)出射頻信號(hào)，然后經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后成像的一種技術(shù)，通過該技術(shù)可以獲得肌肉中水分的高分辨率MRI成像[24]。質(zhì)子密度圖像可以直觀地觀察樣品中水的空間分布[25]，核磁共振成像還可以突出樣品中水的不同相的信號(hào)，若信號(hào)值強(qiáng)顯紅色，無信號(hào)值顯藍(lán)色，同時(shí)其質(zhì)子密度越高，MRI圖像中亮度越強(qiáng)，樣品中水分含量越高[26]。常用低信號(hào)強(qiáng)度（暗或藍(lán)色區(qū)域）是反映與大分子相關(guān)的結(jié)合水或不動(dòng)水，而高信號(hào)強(qiáng)度（亮或紅色）則表示自由的水[27]。由圖3A可知，在空白樣品、添加蔗糖和海藻糖的魚糜凝膠核磁成像為亮綠色，添加低聚木糖和葡聚糖的魚糜凝膠為藍(lán)色，低聚果糖介于兩者之間；部分圖片中能觀察到少量橙色光點(diǎn)，提示有水分子分布不均勻的現(xiàn)象。圖3B為草魚魚糜凝膠橫向弛豫時(shí)間T2分布，可以明顯觀察到T22和T23兩個(gè)峰。根據(jù)水分子與組分結(jié)合的緊密情況，一般將橫向弛豫時(shí)間在0~10 ms水分子定義為結(jié)合水（T21），這部分水與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密；橫向弛豫時(shí)間在10~100 ms的水分子定義不可移動(dòng)水（T22），這部分水位于肌原纖維蛋白凝膠結(jié)構(gòu)之中；橫向弛豫時(shí)間大于100 ms的水分子定義為自由水（T23），可以自由運(yùn)動(dòng)，這部分水在凝膠結(jié)構(gòu)外[18]。顯然，魚糜凝膠的T21和T23較小，表明具有更強(qiáng)的結(jié)合水和限制水分子自由運(yùn)動(dòng)的能力[18]。與對(duì)照組相比，5種多糖的添加均減緩了魚糜凝膠的水分遷移。如表1所示，與空白魚糜凝膠相比，添加蔗糖的魚糜凝膠，T22顯著升高，T23顯著降低（P<0.05）；添加葡聚糖、海藻糖、低聚果糖、低聚木糖均增加了魚糜凝膠的T21和T22，說明這幾類糖的添加會(huì)降低魚糜凝膠的水分子運(yùn)動(dòng)性，這可能是自由水轉(zhuǎn)移至不可移動(dòng)水中，水的流動(dòng)性降低所導(dǎo)致。除蔗糖外，所有糖均增加了魚糜凝膠中結(jié)合水（P21），但降低了魚糜凝膠自由水（T23）所占比例P23，說明在魚糜中添加糖促進(jìn)了水與蛋白質(zhì)更緊密的結(jié)合，而且限制水分子從不可移動(dòng)水轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤?。不同種類的糖最適添加量有所不同，添加量不足或過量均會(huì)引起蛋白質(zhì)分子聚集[28]，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)高速聚集時(shí)，魚糜凝膠形成具有不均勻和大孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[29]，可能影響到凝膠中水分子的運(yùn)動(dòng)性。

圖3 糖類對(duì)魚糜凝膠核磁共振成像偽彩圖和水分分布的影響Fig.3 Effect of various carbohydrates on surimi gel MRI pseudo-color image and water distribution

表1 不同糖類對(duì)魚糜凝膠水分分布的影響Table 1 Effect of different carbohydrates on the water distribution of surimi gel

2.4 不同糖類對(duì)草魚魚糜外觀形態(tài)、質(zhì)構(gòu)凝膠特性和白度的影響

質(zhì)構(gòu)和白度是衡量魚糜品質(zhì)的重要指標(biāo)[30]。添加不同種類糖的草魚魚糜白度如圖4A及表2所示，添加5種糖均不會(huì)對(duì)魚糜凝膠樣品的外觀色澤造成影響。圖1B為不同種類糖溶液，其中低聚木糖糖溶液偏黃，葡聚糖糖溶液呈淡黃色。Duangmal等[31]和Gao等[32]發(fā)現(xiàn)魚糜凝膠的顏色特征主要取決于添加劑的類型。低聚木糖溶液呈黃色，降低了魚糜凝膠白度。添加蔗糖、海藻糖、低聚果糖、葡聚糖可在一定程度上增加凝膠的白度（P<0.05）。如表2所示，添加5種糖的魚糜凝膠硬度和咀嚼性顯著降低（P<0.05），彈性和膠黏性無明顯變化，多糖的加入會(huì)減小魚糜發(fā)生形變時(shí)所產(chǎn)生的應(yīng)力。其中低聚果糖樣品的硬度、彈性和咀嚼性最低，這可能是因?yàn)榈途酃撬只疃容^高、粘度較大，硬度降低，而對(duì)彈性的影響不大（P>0.05）。添加葡聚糖樣品的回復(fù)性最低，為0.373±0.006，推測(cè)這可能與糖的分子量有關(guān)。若干研究報(bào)告稱，肉類產(chǎn)品的凝膠強(qiáng)度或彈性降低可能會(huì)導(dǎo)致咀嚼性或膠黏性下降[18，33]，而Cardoso等[34]的研究則持相反的結(jié)果。這些差異取決于所用肉和添加劑的類型。

表2 不同糖類對(duì)魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性和白度的影響Table 2 Effects of different carbohydrates on the texture properties and whiteness of surimi gel

2.5 不同糖類對(duì)草魚魚糜凝膠特性及二級(jí)結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

由表3可知，添加糖后的魚糜凝膠咀嚼性與硬度極顯著相關(guān)（P<0.01），β-折疊與其回復(fù)性顯著正相關(guān)（P<0.05），無規(guī)則卷曲與硬度、咀嚼性、白度之間顯著相關(guān)（P<0.05），無序結(jié)構(gòu)與彈性呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。魚糜凝膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)與質(zhì)構(gòu)特性有關(guān)，推測(cè)可能是因?yàn)椴糠痔翘娲鞍踪|(zhì)，蛋白分子間相互交聯(lián)，與Zhang等[35]報(bào)道結(jié)果一致，α-螺旋減少，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，魚糜凝膠的咀嚼性和回復(fù)性下降。由于形狀不規(guī)則，無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量不利于有序凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成[36]。Zhuang等[22]也表示魚糜凝膠強(qiáng)度與α-螺旋轉(zhuǎn)換為其他類型的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

表3 添加不同種類糖對(duì)魚糜凝膠特性各指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of various indexes of surimi gel properties by adding different kinds of carbohydrates

3 結(jié)論

本文主要探究了添加葡聚糖、蔗糖、海藻糖、低聚果糖和低聚木糖等不同糖對(duì)草魚魚糜凝膠特性的影響。添加4%葡聚糖、蔗糖和海藻糖可以促進(jìn)致密有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)形成。糖的分子組成不同，與蛋白質(zhì)交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有所差異，對(duì)肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)作用不同，無序結(jié)構(gòu)多，魚糜凝膠彈性較好。糖的添加會(huì)使魚糜凝膠中的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢梢苿?dòng)水和結(jié)合水。添加葡聚糖、蔗糖、海藻糖和低聚果糖可在一定程度上提高草魚魚糜凝膠的白度，但是降低了魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)凝膠特性，5種糖均導(dǎo)致草魚魚糜凝膠的硬度和咀嚼性顯著下降，說明糖與魚糜凝膠蛋白質(zhì)之間可能結(jié)合發(fā)生相互作用，進(jìn)而改變了魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)。