郭其洪，李興麗，范江平，王雪峰

（云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，云南昆明 650201）

辣木（Moringa oleifera）屬于熱帶落葉喬木，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國云南、廣西、臺灣等地區(qū)均有大面積種植[1]。辣木籽含有豐富的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)[2]，其中不飽和脂肪酸含量高達脂質(zhì)的80%[3]，且蛋白質(zhì)、氨基酸的含量均高于FAO/WHO的推薦標準[4]。研究發(fā)現(xiàn)，辣木籽中還含有多種生理活性物質(zhì)，如：抗氧化肽、ACE抑制肽、黃酮等，具有延緩機體衰老、降低人體血壓、控制血糖、殺菌消炎等功能[5]；此外，辣木籽中還含有的維生素D、微量元素（鋅、鐵、碘）等人體生長、發(fā)育必須的營養(yǎng)元素[6?7]。

多肽是由2個及以上的α-氨基酸以不同的排列順序并以肽鍵為連接點連接而成的化合物的總稱[8]?？寡趸嚯囊蛐再|(zhì)穩(wěn)定、具有抗菌、抗氧化作用而表現(xiàn)出諸多生理活性[9?10]。隋曉等[11]綜述了芝麻活性肽類，具有抑菌、抗氧化及金屬螯合作用，展現(xiàn)了其較好的應(yīng)用前景。然而在實際生產(chǎn)加工過程及應(yīng)用過程中，肽類物質(zhì)因受到氧化、水解、螯合等作用的影響而發(fā)生降解，不同的加工環(huán)境（pH、金屬離子、加熱）也會使多肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響其抗氧化活性及功能[12]。所以，研究不同加工條件對肽活性的影響，對肽功能性食品的應(yīng)用具有重要的價值。辣木籽多肽因含有高含量的纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸等也被報道具有一定的抗氧化、抗菌作用[13?14]，但這些多肽的活性及結(jié)構(gòu)也會受到加工條件的影響。劉華勇等[15]研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)純化的辣木籽抗氧化肽在加熱條件下其活性會受到糖類物質(zhì)的影響，美拉德反應(yīng)會使辣木籽肽的活性增加。目前，雖然已有研究報道辣木多肽的功能活性，但大多都只是在研究粗多肽階段，而沒有深入進行分離純化、鑒定及其穩(wěn)定性分析。

因此，本研究以柱層析純化后的辣木籽抗氧化肽為研究對象，旨在探究不同加工條件對其穩(wěn)定性的影響，為提高辣木籽及其蛋白肽的利用率提供實驗基礎(chǔ)并為后續(xù)功能性多肽產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣木籽 云南天佑科技開發(fā)有限公司，樣品前處理后經(jīng)粉碎過60目篩，備用；DPPH、堿性蛋白酶（10萬U/g） 上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸、氯化鉀、硫酸銅、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鈉（≥99.5%） 分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司。

JJ500型電子天平 常熟雙杰測試儀器廠；TGL20M型高速冷凍離心機 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；RE-52A1A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化精密科學儀器廠；Sephadex G-15 層析柱、凝膠填料美國GE公司；SCIENTZ-18N型真空冷凍干燥機上海比朗儀器制造有限公司；Merck Millipore超濾杯 上海軒儀儀器設(shè)備有限公司；UV-1800CP紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；STARTER 3100 pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；Agliebt 1200型高效液相色譜儀 安捷倫公司；UItimate3000型高效液相色譜儀、Fusion高分辨質(zhì)譜儀、ultiskan GO酶聯(lián)免疫檢測儀 美國Thermo Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木籽蛋白粉的制備 配制0.3 mol/L NaCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液。蛋白提?。簩? g辣木籽粉與10 mL配置好的NaCl溶液混合均勻，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.15放入水浴鍋，在50 ℃下攪拌提取30 min，抽濾去渣，收集濾液，真空冷凍干燥，得到辣木籽蛋白粉。

1.2.2 辣木籽粗蛋白肽的制備

1.2.2.1 酶解液的制備 將5 g辣木籽蛋白粉溶解于150 mL去離子水中，勻漿5 min，添加0.275 g堿性蛋白酶酶解，酶解條件：溫度55 ℃、時間4.5 h、pH9，酶解完成后95 ℃水浴滅酶10 min，離心（4000 r/min，30 min），取上清液至?20 ℃冰箱保存。

1.2.2.2 酶解液的超濾分離 將1.2.2.1制得的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮10倍，過3 kDa的超濾膜，收集濾液后真空冷凍干燥，得到凍干粗蛋白肽。

1.2.3 Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱層純化辣木籽蛋白肽 Sephadex G-15葡聚糖凝膠按說明書進行前處理結(jié)束后，裝柱，用去離子水平衡24 h。柱子平衡后將1.2.2中制得的辣木籽粗蛋白肽配制為10 mg/mL濃度，過0.45 μm的有機孔膜后上樣，用去離子水洗脫，控制流速25 mL/h，每管收集8 mL，用紫外分光光度計（波長215 nm）測定每管的出峰值，繪制洗脫曲線，收集洗脫峰組分，旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到純化后的辣木籽蛋白肽。

1.2.4 辣木籽蛋白肽的HPLC-MS/MS鑒定 將1.2.3中純化得到的辣木籽蛋白肽經(jīng)過前處理后進行LCMS/MS鑒定。

色譜條件：色譜柱Trap column，100 μm×20 mm（RP-C18 ,Thermo Inc），柱溫25 ℃，液相A液為0.1%甲酸-水溶液，B液為0.1%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫：0~39 min，10%~23% B；39~49 min，23%~35% B；49~50 min，35%~93% B；50~57 min，93% B；57~60 min，93%~10% B；流速為300 mL/min。

質(zhì)譜條件：母離子掃描范圍：350~1950 m/z，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式下，每次全掃描后采集最強的10個碎片圖譜，碎裂方式：高能碰撞解離，NCE能量28，動態(tài)排除時間：30 s，MS1在M/Z 200時分辨率為60000，AGC target設(shè)置為4e5，最大注射時間50 ms，MS2分辨率設(shè)置為15000，AGC target設(shè)置為5e4，最大注射時間50 ms。

1.2.5 不同分離階段辣木籽粗蛋白肽的RP-HPLC純度分析 將辣木籽蛋白酶解液、3 kDa超濾液、柱層析純化物凍干后用超純水溶解成溶液，采用分析型Aglient1200高效液相色譜儀分析。色譜條件：流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量：5 μL；檢測波長215 nm；流動相：A相為0.1%三氟乙酸乙腈溶液，B相為0.1%三氟乙酸水溶液，洗脫條件為梯度洗脫：0.01 min，A：10%，B：90%；15 min，A：50%，B：50%。

1.2.6 辣木籽粗蛋白酶解液、超濾液、柱層析純化物的抗氧化活性分析

1.2.6.1 總還原力的測定 根據(jù)裴斐等[16]方法并稍作修改。分別將辣木籽粗蛋白凍干酶解物、超濾物、柱層析純化物依次配置成6個濃度梯度：0.6、0.8、2、4、6、8 mg/mL。在1 mL各濃度樣品中加入2.5 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀溶液和2.5 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH6.6），混合后在50 ℃條件下保溫20 min，然后加入2.5 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸，混合后以3000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和2.5 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的三氯化鐵，混勻后，從每個樣品中取出200 μL加入到96孔板中，并在700 nm檢測波長下測定其吸光值，還原力用吸光值A(chǔ)700表示，Vc為陽性對照。

1.2.6.2 DPPH自由基清除率的測定 將辣木籽蛋白酶解物、超濾物、柱層析純化物依次配置成6個濃度梯度：0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL，自由基清除率測定按照劉紅等[17]的方法，并稍作調(diào)整[18]，配制0.2 mmol/L DPPH（避光）溶液和70%的無水乙醇放入冰箱備用。溶液混合后室溫下避光反應(yīng)30 min，以酶聯(lián)免疫檢測儀測定其在517 nm下的吸光值。

式中：A0為1 mL DPPH與1 mL 70%乙醇的吸光值；Ai為1 mL DPPH與1 mL樣品的吸光值；Aj為1 mL 70%乙醇與1 mL樣品的吸光值。

1.2.7 辣木籽抗氧化肽穩(wěn)定性分析

1.2.7.1 不同溫度對辣木籽抗氧化肽活性的影響將辣木籽抗氧化肽（凍干粉）配制成0.1 mg/mL溶液，采用工業(yè)中常見的3種加熱方式（65、100、115 ℃）分別加熱20 min后，使溫度自然降低到25 ℃，測定其DPPH自由基清除率。

1.2.7.2 pH對辣木籽抗氧化肽活性的影響 朱楚楚[19]的研究表明，堿性條件下抗氧化肽會發(fā)生消旋作用，使肽鏈的構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致其活性損失，因此本研究將辣木籽肽（凍干粉）配制成0.1 mg/mL（原始pH7.3），調(diào)節(jié)pH至酸性范圍：3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0，一組樣品溶液靜置1 h后直接測定各樣品溶液的DPPH自由基清除率；另一組樣品靜置1 h后，115 ℃下加熱20 min，自然冷卻到25 ℃后測定各樣品溶液的DPPH自由基清除率。

1.2.7.3 金屬離子對辣木籽抗氧化肽活性的影響辣木籽肽（凍干粉）配制成0.1 mg/mL溶液，向樣品溶液中加入硫酸銅、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鉀，使各樣品金屬離子的濃度分別達到0.25、0.5、1、2 mmol/L，一組樣品溶液靜置1 h后直接測定各樣品溶液DPPH自由基清除率；另一組樣品溶液靜止1 h后，115 ℃下加熱20 min，冷卻至25 ℃后測定各樣品溶液的DPPH自由基清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進行整理和顯著性分析，ProteomeDiscover2.4數(shù)據(jù)處理軟件，對實驗組樣本進行蛋白定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱層析純化辣木籽蛋白肽

2.1.1 葡聚糖柱層析洗脫效果 通過3 kDa超濾膜進行分離的辣木籽蛋白酶解液，洗脫曲線如圖1所示。在215 nm波長測定下，從第18管到40管出現(xiàn)單一洗脫對稱峰，為較均一的辣木籽蛋白肽。

圖1 層析柱純化后得到的洗脫峰Fig.1 The elution peaks obtained after column separation

2.2 辣木籽抗氧化肽的鑒定

按照1.2.4中的方法對的樣品進行HPLCMS/MS分析鑒定，結(jié)合ProteomeDiscover2.4數(shù)據(jù)處理軟件，對實驗組樣本進行蛋白定性和相對定量分析。圖2是樣品鑒定過程中的色譜圖。如表1所示，經(jīng)柱層析純化后的辣木籽蛋白肽通過HPLCMS/MS主要鑒定出5條多肽，分子量分布在2000~3100 Da，含有18~26個氨基酸殘基。XIA等[20]鑒定出大麥谷蛋白抗氧化肽序列中的疏水氨基酸占總殘基的50%~67%，本實驗中通過計算五條多肽中疏水性氨基酸分子量與總分子量的比值，發(fā)現(xiàn)鑒定出的KVLTMTGGKFVVNDVNGNVR、MSINLQSHA FAGNPLRSRTPK、NRLSLAMERTGQWVFSQDIPS 3條抗氧化多肽中疏水性氨基酸占據(jù)總氨基酸含量的50%~54%。此外，疏水性氨基酸殘基Leu、Val、Ala、Pro及Phe能夠提高肽在脂相中的溶解度，有利于肽與脂質(zhì)中自由基的相互作用[21?23]。本研究中，QQTLAREHNQEYKAALQR序列中疏水性氨基酸Ala-Ala的疊加作用進一步提高了抗氧化肽抑制脂質(zhì)過氧化的能力。

圖2 分離組分超高效液相色譜圖Fig.2 Ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry of the separated components

表1 辣木籽蛋白肽組分的鑒定Table 1 Identification of Moringa oleifera seed protein peptides

GUO等[24]研究蜂王漿蛋白抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在C-末端含有Lys殘基或Arg殘基的肽序列Phe-Lys、Phe-Pro-Arg表現(xiàn)出較強的抗氧化活性，本試驗從辣木籽中分離純化的抗氧化肽序列MSINLQSHAFAGNPLRSRTPK（Thr-Pro-Lys）與上述肽段的相似結(jié)構(gòu)，所以該條多肽的抗氧化活性可能與C-末端含有的Lys殘基有重要關(guān)系。有研究報道，Pro中的吡咯烷環(huán)可以與肽的二級結(jié)構(gòu)相互作用，增加其柔性，由于其較低電離電勢也能夠淬滅單線態(tài)氧，從而起到抗氧化作用[25]。相似地，Gly中單個氫原子也可以增加肽骨架的柔性并有助于肽段抗氧化性質(zhì)，Glu能夠與Ca、Fe、Zn等形成螯合物而有助于其抗氧化性質(zhì)[26]，所以，本研究鑒定出的五條肽序列中所含的Gly、Glu、Pro可能是其表現(xiàn)出抗氧化活性的重要原因之一。此外，5條肽中含有Met、His、Trp、Tyr等供氫或供電子能力的氨基酸殘基，也被證明均具有良好的清除自由基的能力[27?29]。

2.3 辣木籽粗蛋白酶解物、超濾液、柱層析純化物的RP-HPLC純度分析

采用分析型Aglient 1200 型RP-HPLC進行純度分析，結(jié)果如圖3所示。辣木籽蛋白酶解液中的蛋白肽可通過超濾分離得到比較對稱的峰形，進一步柱層析純化后得到的目標物峰形較對稱，雜峰較少。說明對辣木籽蛋白酶解液通過超濾、Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱層析分離純化可獲得純度較高的辣木籽蛋白肽。

圖3 辣木籽粗蛋白酶解物、超濾收集液、柱層析純化物的RP-HPLC純化Fig.3 Purification of Moringa oleifera seed crude protease hydrolysate, ultrafiltration collection solution and column chromatography purification by RP-HPLC

2.4 辣木籽粗蛋白酶解液、超濾液、柱層析純化物的抗氧化活性分析

將辣木籽蛋白酶解物、超濾物、柱層析純化物按照1.2.6中的濃度梯度配置好后，對其分別進行總還原力及DPPH自由基清除率的測定，結(jié)果如圖4、圖5所示。由圖4可知：隨著辣木籽蛋白酶解物、超濾物、以及柱層析純化物的濃度逐漸增加，其還原能力值也在不斷增大，在濃度范圍內(nèi)，酶解物的還原能力吸光值由0.058上升到0.21，超濾物還原力吸光值由0.133上升到0.75，柱層析純化物的還原能力值由0.21上升到0.83，三者的還原能力大小排序為：柱層析純化物>超濾物>酶解物。圖5中，辣木籽蛋白酶解物、超濾物、柱層析純化物的DPPH自由基清除率也隨著三者濃度的增加而不斷增大，活性也隨之增強，三者的濃度在0.6 mg/mL時，其DPPH自由基清除率分別為50%、65%和71%，DPPH自由基清除率排序為：柱層析純化物>超濾物>酶解物，說明超濾和柱層析純化具有較好的分離效果。

圖4 辣木籽粗蛋白酶解物、超濾液、柱層析純化物的還原能力Fig.4 Reducing ability of Moringa oleifera seed crude proteolysis product, ultrafiltration collection solution, column chromatography purification product

圖5 辣木籽粗蛋白酶解物、超濾液、柱層析純化物的DPPH自由基清除能力Fig.5 The scavenging ability of DPPH free radicals of Moringa oleifera seed crude proteolysis product, ultrafiltration collection solution, and column chromatography purification product

2.5 辣木籽蛋白肽穩(wěn)定性分析

2.5.1 不同溫度對辣木籽抗氧化肽活性的影響 由圖6可知，在65 ℃條件下，其辣木籽抗氧化肽的自由基清除率最高為18%，在115 ℃和不加熱的條件下自由基清除率未見顯著變化（P>0.05），在100 ℃下其自由基清除率為12%。劉丹等[18]以大豆?jié)饪s蛋白為原料，利用酶法制備得到的大豆抗氧化肽，發(fā)現(xiàn)當加熱溫度在63~70 ℃范圍內(nèi)時，其抗氧化活性會增加，本實驗中加熱到65 ℃時的自由基清除率較不加熱提高了4%。當溫度達到95 ℃以上時，由于高溫可能會使辣木籽抗氧化肽發(fā)生分解，使其抗氧化活性降低，此時100 ℃條件下的自由基清除率相比65 ℃條件時降低至12%。

圖6 溫度對辣木籽肽抗氧化活性影響Fig.6 Effect of temperature on the activity of Moringa oleifera seed antioxidative peptide

2.5.2 常溫與加熱條件下pH對辣木籽抗氧化肽穩(wěn)定性的影響 由圖7得知，非熱條件處理下，pH在3.4~5.4范圍內(nèi)，其DPPH自由基清除能力保持在17%左右，趨于平穩(wěn)。劉華勇等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，辣木籽抗氧化肽的穩(wěn)定性更好，且對辣木籽多肽的活性影響不明顯，但是，當pH為6.0接近6.3時的自由基清除率為26%。由圖8可知，在加熱條件處理下，當pH在3.4~5.4范圍時，與非加熱相比，加熱條件下的自由基清除率增加了4%左右，說明在酸性條件下加熱能提高辣木籽抗氧化肽的活性。朱楚楚[19]研究pH對金瓜籽抗氧化肽活性時發(fā)現(xiàn)，堿性條件下抗氧化肽會發(fā)生消旋作用，會使肽鏈的構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致其活性損失，若將辣木籽肽應(yīng)用于酸性飲料，經(jīng)熱處理后，能適當提高抗氧化活性。

圖7 常溫條件下pH對辣木籽抗氧化肽活性的影響Fig.7 Effect of pH on the activity of Moringa oleifera seed antioxidative peptide under non-heat treatment

圖8 115 ℃加熱條件下pH對辣木籽抗氧化肽活性的影響Fig.8 Effect of pH on the activity of Moringa oleifera seed antioxidative peptide under heating at 115 ℃

2.5.3 常溫條件處理和熱條件處理下金屬離子對辣木籽抗氧化肽活性的影響 由圖9可知，4種金屬離子對自由基清除率的影響均不同，其中不同質(zhì)量濃度的Ca2+、Mg2+對自由基清除率沒有明顯影響，當K+和Cu2+濃度為2 mmol/L時的自由基清除率分別為34%和28%，辣木籽抗氧化肽的自由基清除率較不加熱未添加金屬離子樣品分別提高了20%和14%（見圖6）；研究表明[30]，金屬離子對抗氧化物的抗氧化能力有一定影響，過渡金屬離子K+、Cu2+具有未充滿電子的階層d軌道，更容易形成配合物，能夠引發(fā)自由基和非自由基活性氧的產(chǎn)生。由圖10可知，2 mmol/L K+、Cu2+、Mg2+濃度對應(yīng)的自由基清除能力為9%、23%和11%，較不加熱添加金屬離子條件相比下降了25%、5%和4%，4種金屬離子對自由基清除率均有所下降，這是因為加熱可能加速促進辣木籽肽與金屬離子的螯合反應(yīng)，形成部分絮凝產(chǎn)物，因此其抗氧化活性降低；然而隨著Cu2+的濃度增加，其自由基清除能力有所提高，這可能與辣木籽肽與Cu2+形成的螯合物的空間結(jié)構(gòu)特性相關(guān)，需進一步研究，探明其作用機理。因此，若辣木籽多肽產(chǎn)品需要暴露在熱條件下，應(yīng)避免和K+、Mg2+和Ca2+接觸。

圖9 常溫下金屬離子對辣木籽抗氧化肽活性的影響Fig.9 Effects of metal ions on antioxidant peptide activity of Moringa oleifera seeds under room temperature

圖10 加熱條件下金屬離子對辣木籽抗氧化肽活性的影響Fig.10 Effects of metal ions on antioxidant peptide activity of Moringa oleifera seeds under heating conditions

3 結(jié)論

本實驗以辣木籽蛋白為原料，通過堿性蛋白酶水解制備抗氧化肽，采用超濾和Sephadex G-15葡聚糖柱層析分離純化抗氧化肽，進一步對純化物進行了肽序列鑒定，探究了pH、金屬離子、溫度對純化物活性穩(wěn)定性的影響。通過反向高效液相色譜分析酶解物、超濾物、柱層析純化物得到的目標物純度較高，峰形較對稱；酶解物、超濾物、柱層析純化物在濃度8 mg/mL時的還原力值分別為0.21、0.75、0.83，在濃度為0.6 mg/mL時，自由基清除率達到最高，分別為50%、65%和71%，說明目標物有較好的抗氧化效果；柱層析純化物中主要鑒定出5條潛在的抗氧化肽，分別為KVLTMTGGKFVVNDVNGNVR、MS INLQSHAFAGNPLRSRTPK、QQTLAREHNQEYK AALQR、NRLSLAMERTGQWVFSQDIPS、EHAIN TDIQMSAFHEIEEDKAPDTPS。柱層析純化物抗氧化活性穩(wěn)定性研究表明：常溫條件下pH3.4~5.4范圍內(nèi)其活性較為穩(wěn)定，加熱條件下其活性提高了4%；加熱條件下，Cu2+、Ca2+、K+、Mg2+對辣木籽肽的活性較常溫條件下分別降低了5%、23%、25%和4%，熱處理條件下金屬離子對辣木籽抗氧化肽活性的影響較大，該研究可為后續(xù)辣木籽抗氧化肽的開發(fā)應(yīng)用提供參考。