邊海濤

張雨萌2

勇艷華1

李 鵬1

王立娜1

蘇春敏1

(1. 大連市檢驗檢測認證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧 大連 116630；2. 沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016)

GB 16740—2014《食品安全國家標準 保健食品》中明確指出保健食品不以治療疾病為目的，并且不得對人體產(chǎn)生任何危害。然而，一些不法分子為了牟取經(jīng)濟利益，宣稱所生產(chǎn)的保健食品具有治療疾病的功效，并通過非法添加化學藥物來達到所謂的療效，對消費者構(gòu)成極大的健康威脅。輔助降血糖類保健食品是最為暢銷的保健食品種類之一，其非法添加成分包括磺脲類胰島素促泌劑(醋磺己脲、格列本脲、格列美脲、格列喹酮)[1-2]、雙胍類(二甲雙胍、苯乙雙胍、丁二胍)[3-5]、α-葡萄糖苷酶抑制劑(阿卡波糖、伏格列波糖)[4]、胰島素增敏劑(羅格列酮、吡格列酮)[6-7]、二肽基肽酶-4抑制劑(維格列汀)[8]等多種類型降血糖類藥物。恩格列凈屬于鈉—葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2抑制劑，利格列汀、沙格列汀和阿格列汀屬于二肽基肽酶-4抑制劑，用于治療2型糖尿病，且均已在中國上市，存在被不法分子非法添加到保健食品中的風險。

目前，保健食品中降血糖類藥物的檢測方法有薄層色譜法[9]、紅外光譜法[10]、質(zhì)譜法[11]、拉曼光譜法[12-13]、高效液相色譜法[6-7,14-15]、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[1-2,4,16-19]、高效液相色譜—高分辨質(zhì)譜法[20]等。液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、可以通過二級質(zhì)譜分析對結(jié)構(gòu)進行確證的特點，是近年來保健食品中降血糖類藥物檢測方面的主流方法，也被廣泛應(yīng)用于血漿、尿液等生物樣品中恩格列凈、利格列汀、沙格列汀、阿格列汀的測定[21-24]，但其在保健食品中上述4種降血糖類藥物檢測方面的研究尚未見報道。研究擬采用甲醇提取保健食品中的目標物，高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀進行定性和定量分析，建立一種簡便、快速、準確同時檢測保健食品中恩格列凈、利格列汀、沙格列汀和阿格列汀的方法，以期為保健食品中4種降血糖類藥物的檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：1290 Infinity-6490型，美國Agilent公司；

電子天平：BSA224S型，德國Sartorius公司；

高速離心機：CR22GⅡ型，日本HITACHI公司；

數(shù)控超聲波清洗器：SK7200G型，上?？茖С晝x器有限公司；

漩渦混合器：XW-80A型，上海精科實業(yè)有限公司；

超純水系統(tǒng)：arium?pro型，德國Sartorus公司；

甲醇：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

乙腈：色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司；

甲酸：色譜純，美國MREDA公司；

試驗用水為超純水(電導率18.2 MΩ)；

口服液、片劑、膠囊樣品：市售；

恩格列凈(CAS：864070-44-0)、利格列汀(CAS：668270-12-0)、沙格列汀(CAS：361442-04-8)、阿格列汀(CAS：850649-61-5)標準物質(zhì)：純度均>95%，加拿大Toronto Research Chemicals公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 準確稱取1 g(精確至0.001 g)樣品于100 mL離心管中，加入甲醇45 mL，渦旋混勻，超聲提取30 min，12 000 r/min離心3 min，取上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，冷卻，加甲醇定容，搖勻，用0.22 μm濾膜過濾后備用。

1.2.2 標準溶液配制

(1) 標準溶液：分別準確稱取適量恩格列凈、利格列汀、沙格列汀、阿格列汀標準品，用甲醇定容，配制成標準儲備溶液。分別準確移取適量標準儲備溶液，甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的恩格列凈、利格列汀混合標準溶液和質(zhì)量濃度為1 mg/L的沙格列汀、阿格列汀混合標準溶液。

(2) 基質(zhì)匹配混合標準工作溶液：分別準確移取恩格列凈、利格列汀混合標準溶液20，40，80，150，300，500 μL，沙格列汀、阿格列汀混合標準溶液20，40，100，300，500，1 000 μL于10 mL容量瓶中，用空白樣品前處理后的樣品溶液定容，作為系列基質(zhì)匹配混合標準工作溶液。

1.2.3 色譜和質(zhì)譜條件

(1) 液相色譜條件：色譜柱為Agilent SB-Aq色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫25 ℃；流速0.2 mL/min；進樣量1 μL；流動相為0.1%甲酸—水溶液(A)和0.1%甲酸—乙腈溶液(B)；梯度洗脫程序：0.0～6.5 min，2%～60% B；6.5～6.6 min，60%～90% B；6.6～7.6 min，90% B；7.6～7.7 min，90%～2% B；7.7～10.0 min，2% B。

(2) 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描模式ESI+；干燥氣流量15 L/min，干燥氣溫度300 ℃；霧化氣壓力2.41×105Pa；鞘氣流量11 L/min，鞘氣溫度350 ℃；毛細管電壓4 000 V；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。

1.2.4 基質(zhì)效應(yīng) 采用提取后加入法，按式(1)對基質(zhì)效應(yīng)(ME)進行評價。ME>0為基質(zhì)增強效應(yīng)，ME<0為基質(zhì)抑制效應(yīng)。

ME=(A-B)/B×100%，

(1)

式中：

A——空白基質(zhì)提取液中定量加入4種降血糖藥物后測定的峰面積；

B——相同濃度的標準溶液測定的峰面積。

1.2.5 線性范圍測定 測定不同濃度基質(zhì)匹配混合標準工作溶液，以4種降血糖藥物濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制基質(zhì)匹配標準曲線。

1.2.6 定量限及檢出限測定 向口服液、片劑、膠囊等空白基質(zhì)中添加一定濃度的4種降血糖藥物，以10倍信噪比(S/N=10)時對應(yīng)的目標物濃度計算得到定量限，以3倍信噪比(S/N=3)計算得到檢出限。

1.2.7 回收率和精密度測定 向口服液、片劑、膠囊等空白基質(zhì)中定量添加4種降血糖藥物的標準溶液，按建立的方法進行測定并計算方法回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件確定

保健食品中降糖類藥物多采用甲醇[2,4]、甲醇—水[15]、乙腈[25]進行提取。恩格列凈、利格列汀、沙格列汀、阿格列汀在甲醇中均有良好的溶解性。試驗結(jié)果表明：采用甲醇超聲提取，4種降血糖藥物的回收率為83.1%～105.6%，可以滿足保健食品中4種降血糖藥物的提取要求。

2.2 色譜條件優(yōu)化

試驗結(jié)果表明，以水—乙腈作為流動相，沙格列汀和阿格列汀的峰形較差，加入0.1%甲酸可以顯著改善沙格列汀和阿格列汀的峰形，加入0.2%甲酸的改善效果與0.1%甲酸的無明顯差別，因此選擇0.1%甲酸—水溶液和0.1% 甲酸—乙腈溶液作為流動相。由圖1可知，4種降血糖藥物可以獲得較好的峰形、分離度和靈敏度。

圖1 標準溶液的總離子流色譜圖和多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Figure 1 TIC and MRM chromatograms ofstandard solution

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

4種降血糖藥物均在正離子模式下響應(yīng)更高，母離子、定量及定性離子和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見表1，該條件下4種降血糖藥物可達到最佳的檢測靈敏度。

表1 4種降血糖藥物的質(zhì)譜分析參考參數(shù)?Table 1 MS/MS parameters of 4 anti-diabetic medicines

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

由圖2可知，不同基質(zhì)對4種降血糖藥物的質(zhì)譜響應(yīng)有不同的效應(yīng)，口服液中4種降血糖藥物為8%～21%的增強效應(yīng)；片劑中3種降血糖藥物為3%～41%的抑制效應(yīng)，而利格列汀為70%的增強效應(yīng)；膠囊中3種降血糖藥物為28%～104%的增強效應(yīng)，而恩格列凈為37%的抑制效應(yīng)。因此，采用基質(zhì)匹配標準曲線對4種降血糖藥物進行定量，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響[26]。

圖2 4種降血糖藥物的基質(zhì)效應(yīng)Figure 2 Matrix effects of 4 anti-diabetic medicines

2.5 線性范圍、檢出限與定量限

由表2可知，沙格列汀和阿格列汀在2～100 μg/L內(nèi)線性關(guān)系良好，恩格列凈和利格列汀在20～500 μg/L內(nèi)線性關(guān)系良好，R2>0.99；沙格列汀、阿格列汀的檢出限為0.03 mg/kg，定量限為0.10 mg/kg；恩格列凈、利格列汀的檢出限為0.30 mg/kg，定量限為1.00 mg/kg。

表2 4種降血糖藥物的線性范圍、R2、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, R2, detection limits and quantification limits of 4 anti-diabetic medicines

2.6 回收率和精密度

由表3可知，4種降血糖藥物的回收率為77.5%～113.0%，相對標準偏差為0.9%～9.4%，表明方法的準確度與精密度良好。

表3 4種降血糖藥物的回收率和相對標準偏差Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 4 anti-diabetic medicines (n=6)

2.7 實際樣品測定

采用試驗建立的方法對市售的15種降糖類保健食品進行了分析測定，均未檢出恩格列凈、利格列汀、沙格列汀和阿格列汀。

3 結(jié)論

采用甲醇超聲提取，高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定，基質(zhì)匹配標準曲線外標法定量，建立了同時快速檢測保健食品中恩格列凈、利格列汀、沙格列汀和阿格列汀4種降血糖類藥物的方法。結(jié)果表明，4種降血糖藥物的回收率為77.5%～113.0%，相對標準偏差小于10%，沙格列汀、阿格列汀的檢出限和定量限分別為0.03，0.10 mg/kg，恩格列凈、利格列汀的檢出限和定量限分別為0.30，1.00 mg/kg。該方法快速、簡便、靈敏，結(jié)果準確可靠，適用于口服液、片劑、膠囊等保健食品中4種降血糖藥物的確證與定量測定。后繼將完善保健茶等基質(zhì)中4種降血糖藥物的檢測方法。