焦詠宜 綜述 張曉良 審校

血管鈣化(VC)是慢性腎臟病(CKD)最常見的并發(fā)癥之一,最新的流行病學調查顯示,中國透析患者的VC患病率已高達77.4%[1]。VC與心血管疾病(CVD)高發(fā)病率及高死亡率密切相關,因此尋找可靠的生物標志物對于CKD患者VC早期診斷、預后評估和治療十分重要。本文將對VC生物標志物研究的最新進展進行綜述。

維生素K依賴性蛋白(VKDPs)

VKDPs是一類需要維生素K作為輔助因子翻譯修飾后才能發(fā)揮生物活性的蛋白質,與VC及CVD的發(fā)生密切相關。VKDPs主要分為兩類,一類是與維生素K1相關的凝血因子,另一類是與維生素K2相關的鈣化相關因子。近年來多項研究均表明維生素K2具有抑制VC的作用。

基質γ羧基谷氨酸蛋白(MGP)MGP是一種維生素K依賴的鈣化抑制因子,在鈣磷沉積的血管平滑肌細胞(VSMCs)中高度表達。循環(huán)中存在四種不同類型的MGP,即去磷酸化未羧化MGP(dp-uc MGP)、去磷酸化羧化MGP(dp-c MGP)、磷酸化未羧化MGP(p-uc MGP)和磷酸化羧化MGP(p-c MGP)。MGP可以通過螯合鈣離子、抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)形成、結合基質囊泡和抗凋亡等途徑抑制VC。研究表明,MGP基因敲除的小鼠會出現(xiàn)軟骨過度、生長板礦化和動脈中膜鈣化,可導致早期死亡[2]。

dp-uc MGP在VC早期診斷、進展和預后評估方面具有重要價值。一項以CKD 3～5期患者為研究對象的研究表明隨腎臟功能減退,dp-uc MGP的水平不斷升高,且與VC程度呈正相關[3]。同時,一項包括136例血液透析患者的隊列研究表明,dp-uc MGP與VC分數(shù)顯著相關[4]。Mayer等[5]則在799例合并CVD的患者中發(fā)現(xiàn),dp-uc MGP可獨立預測心血管死亡率及全因死亡率。

維生素K是MGP羧化過程中必需的輔助因子,應用華法林或者維生素K缺乏會導致MGP羧化不足和功能受損,dp-uc MGP水平上升。預防及延緩VC主要是選擇補充維生素K2,而dp-uc MGP是評估血管內維生素K狀態(tài)的最佳生物標志物[2]。一項涉及200例血液透析患者的前瞻性隨機單盲研究顯示,補充維生素K2可劑量依賴性地降低dp-uc MGP水平[6]。

總之,dp-uc MGP是 VC早期診斷和預后評估最重要的指標,是目前最有希望應用于臨床的生物標志物,同時也可以用于評估血管內維生素K狀態(tài)。

骨鈣素(OC)OC是由成骨細胞合成和分泌的骨γ羥基氨酸蛋白,是一種VKDP,它可以反映骨骼的動態(tài)變化。OC包括羧化不全骨鈣素(ucOC)和羧化完全骨鈣素(cOC)。

OC與VC密切相關,但其作用機制尚不明確。目前研究認為OC是鈣化促進因子,可以通過缺氧誘導因子信號途徑、Runx2信號等途徑促進VC。cOC則對羥基磷灰石晶體具有強親和力,與其結合后可促進VC。

OC是骨代謝的一項重要生物標志物,但其能否作為VC的生物標志物尚存在爭議。在臨床研究中,一項涉及108例維持性血液透析患者的橫斷面研究表明,CKD患者OC水平顯著升高,且升高水平與血磷、甲狀旁腺激素、成纖維細胞生長因子23(FGF-23)呈正相關,因此認為OC是VC的危險因素[7]。但有病例對照研究與薈萃分析表達了相反的觀點,認為在CKD患者和普通人群中均不能證明OC與VC之間存在某種關系[8-9]。

ucOC除了作為維生素K評價指標外,可能與VC也存在某種聯(lián)系。近年來研究者發(fā)現(xiàn)ucOC可以通過刺激PI3K/Akt信號通路、上調血管內皮細胞中一氧化氮和核因子κB(NF-κB)的表達,從而發(fā)揮保護內皮功能、抑制VC的作用。Qaradakhi等[10]分別以正常飲食與ucOC喂食合并有動脈粥樣硬化的白兔,結果表明ucOC可以改善動脈粥樣硬化后受損的內皮依賴性血管舒張功能。但在一項21d的體外研究中卻未觀察到ucOC對VC的積極作用[8]。因此未來研究中可以更加關注ucOC與VC之間的關聯(lián)。

焦磷酸鹽(PPi)

PPi是以胞外三磷酸腺苷(ATP)為原料的鈣化抑制因子,可以抑制羥基磷灰石的形成和生長。PPi與以下兩種酶密切相關:(1)組織非特異性堿性磷酸酶(TNAP)能夠抑制PPi,促進VC形成。采用小分子化合物選擇性抑制TNAP是靶向治療VC的最新策略,Tani等[11]在CKD-MBD小鼠模型中,使用新型TNAP抑制劑SBI-425可以抑制VC形成、降低死亡率,且不影響正常骨骼形成和殘余腎功能;(2)外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶I (eNPP I)可以水解胞外ATP產(chǎn)生PPi,是循環(huán)中PPi的主要來源,在敲除eNPPI基因的小鼠中,其PPi顯著降低,促進VC發(fā)生[12]。

在臨床研究中,PPi也被證明與VC密切相關。O’Neill等[13]發(fā)現(xiàn)PPi水平與CKD患者的VC呈負相關,且不受是否透析、透析方式、營養(yǎng)狀態(tài)及炎癥狀態(tài)等因素的影響,可成為評價VC發(fā)生與進展的生物學標志物。

骨保護素(OPG)

OPG可直接抑制破骨細胞的分化成熟和誘導成骨細胞的發(fā)生,是重要的鈣化抑制因子。OPG也可通過OPG/NF-κB受體活化因子(RANK)/RANK配體(RANKL)系統(tǒng)抑制VC,RANK由破骨細胞分泌,而OPG及RANKL則由成骨細胞分泌合成,當OPG受到Wnt/β-catenin途徑的調節(jié)而競爭性結合RANKL時,可以抑制RANKL與RANK在破骨細胞上的結合,從而抑制骨吸收。

動物試驗普遍認為OPG是VC的保護因素,OPG可以抑制大鼠VSMC向成骨細胞分化。在小鼠鈣化血管中,RANKL表達水平較高,且OPG表達水平較低。然而,大量臨床試驗研究結果與動物試驗相反,提出OPG升高可能是預測死亡風險的有效生物學標志物。Tschiderer等[14]在一項涉及26 442例普通人群的薈萃分析中認為OPG水平的升高與普通人群發(fā)生CVD的風險增加有關。Morena等[15]在195例非透析CKD患者中發(fā)現(xiàn)高OPG與中度冠狀動脈鈣化(評分100～400)密切相關,是其強有力的生物學標志物。Morena等[16]也在一項涉及185例血液透析患者的隊列研究中表明OPG水平升高是全因死亡率和心血管死亡率的獨立預測因子。目前多項臨床研究認為OPG在VC風險預測方面具有重要價值,該指標具有良好的臨床轉化前景。

FGF-23與Klotho蛋白

FGF-23是一種由骨細胞和成骨細胞分泌的激素蛋白,是調節(jié)CKD患者磷酸鹽的重要因子。Klotho蛋白是FGF-23發(fā)揮生理功能的重要輔助因子,它是一種單跨膜蛋白,主要包括α、β和γ三種形式,其中α-Klotho(αKL)又可以分為可溶性αKL(cKL)與膜型αKL。FGF-23發(fā)揮活性需要與FGF受體(FGFR)和Klotho共受體相結合,其中Klotho共受體可以促進FGF-23與FGFR結合。

FGF-23主要通過以下機制在腎臟中發(fā)揮作用:(1)在近端腎小管,FGF-23/FGFR1/Klotho復合體能夠直接激活ERK1/2和SGK1,從而抑制鈉磷協(xié)同轉運子的表達,誘導尿磷增加;(2)下調25-羥維生素D1-α-羥化酶表達,從而減少骨化三醇的合成和磷酸鹽的吸收。Klotho蛋白則是通過與FGF-23聯(lián)合作用降低血磷以及直接抑制VSMC向成骨細胞表型的分化這兩種途徑抑制VC。

FGF-23的升高與Klotho蛋白的降低在CKD患者VC形成過程中均起著關鍵作用,可作為VC早期診斷和預后評估的生物標志物。在合并VC的CKD患者中往往會出現(xiàn)Klotho蛋白缺乏,同時FGF-23水平因磷酸鹽沉積而反饋性上升,高水平FGF-23、低水平cKL蛋白與CVD及全因死亡率密切相關[17-18]。Morena等[15]在195例非透析CKD患者中發(fā)現(xiàn)高水平FGF-23與重度冠狀動脈鈣化(評分>400)密切相關,是重度VC可靠的預測因子。

Klotho蛋白是VC新的治療靶點,在CKD-MBD的小鼠模型中,持續(xù)的cKL治療可以降低高磷血癥、預防VC[19]。研究者發(fā)現(xiàn)多種藥物可通過上調Klotho蛋白治療VC, Klotho蛋白水平可作為評價治療效果的有效指標:(1)雷帕霉素可通過抑制雷帕霉素靶蛋白信號從而上調cKL的表達,有效地抑制VC[20];(2)Intermedin1-53(IMD1-53)是一種降鈣素/降鈣素基因相關肽,在動物研究中發(fā)現(xiàn)IMD1-53可通過CRLR/RAMP3受體復合物和激活cAMP/PKA信號傳導來上調αKL水平,從而抑制VC[21]。

鈣蛋白顆粒

胎球蛋白A是一種鈣化抑制因子,可以與鈣磷結合形成蛋白質-礦物復合物,即鈣蛋白單體。鈣蛋白單體聚合后可形成血漿可溶性無定形膠體顆粒,稱為初級鈣蛋白顆粒(CPPⅠ)。CPPⅠ在血漿中循環(huán),最終重排成直徑更大、不溶于血清、具有針狀晶體結構次級鈣蛋白顆粒(CPPⅡ)[22]。CPP可以通過誘導VSMC內膜增生、促炎、誘導氧化應激及上調鈣化促進因子等途徑誘導VC,CPPⅡ在其中發(fā)揮主要作用。

CPPⅠ自發(fā)轉換成CPPⅡ所需時間的一半稱為T50,是評價VC傾向的最佳生物標志物,與低T50相比,高T50更不容易出現(xiàn)VC。多項研究表明T50具有極大的臨床應用價值,在CKD患者中,低T50和高CPPⅡ與VC程度正相關,與CVD、全因死亡率的增加亦密切相關[23-24]。

降低CPP水平是VC治療的一個新方向,在治療過程中CPP水平及T50可作為治療效果的一個重要觀察指標。目前主要存在以下幾種方式:(1)鎂鹽(Mg2+):Bressendorff等[25]發(fā)現(xiàn)在提高透析液中Mg2+濃度可增加T50,從而降低鈣化傾向。(2)磷酸鹽結合劑:Smith等在使用司維拉姆減輕鈣化程度的同時觀察到血清中CPPⅠ水平顯著降低[26],Thiem等[27]通過羥基氫氧化亞鐵降低磷酸鹽水平減輕VC時發(fā)現(xiàn)T50顯著延長。(3)擬鈣劑依替卡列肽注射溶液目前用于治療繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進,有研究表明該藥也可以抑制VC傾向,延長T50[28]。因此, CPP及T50有望成為評價VC的治療及預后效果的重要生物標志物。

Wnt/β-catenin抑制劑

Wnt/β-catenin是一種細胞內信號通路,可調節(jié)成骨細胞活性,在骨形成中起關鍵作用。該途徑的激活始于Wnt配體和其受體、卷曲蛋白和低密度脂蛋白受體相關蛋白LRP5/6結合,使糖原合成酶激酶3失活,從而穩(wěn)定細胞質中的β-catenin并使其進入細胞核內,啟動骨形成基因的轉錄。骨硬化蛋白與Dickkopf-1(Dkk-1)均為分泌型糖蛋白,可以通過抑制Wnt/β-catenin途徑從而抑制成骨細胞分化。

骨硬化蛋白骨硬化蛋白是由骨細胞分泌,通過與LRP5/6結合抑制成骨細胞的Wnt信號傳導途徑、影響B(tài)MP的活性、調節(jié)骨化三醇和FGF-23分泌等途徑抑制成骨細胞的分化。

目前,關于骨硬化蛋白是否能成為CKD患者VC早期診斷與預后評估的敏感生物標志物尚存在爭議。Yang等[29]觀察到125例維持性血液透析患者的骨硬化蛋白與VC及CVD呈負相關,即骨硬化蛋白是VC的保護性因素。同樣,Jean等[30]在207例血液透析患者中發(fā)現(xiàn)，較高的血清硬化素水平與較高的骨密度、較低的主動脈鈣化積分及較高的生存率相關。但該結論尚存在爭議,Wang等[31]在161例CKD 3～5D期患者中發(fā)現(xiàn)，其血清骨硬化蛋白水平與腹主動脈鈣化呈正相關,但是與鈣化程度呈負相關。Qureshi等[32]在89例終末期腎病患者中發(fā)現(xiàn)，高水平的骨硬化蛋白與VC發(fā)生呈正相關,且認為高水平骨硬化蛋白可以作為預測VC發(fā)生的指標。

Dkk1Dkk1主要由成骨細胞和骨細胞分泌表達,其抑制VC主要是通過與LRP5/6相結合從而抑制Wnt信號通路,可抑制成骨細胞產(chǎn)生OPG,增加RANKL/OPG比例和破骨細胞活動。

近年研究發(fā)現(xiàn)Dkk1有望成為VC臨床診斷及預后評估的新型生物標志物。Thambiah等[33]發(fā)現(xiàn)在未透析的CKD的患者中,Dkk1水平與骨密度和動脈僵硬度成負相關。Lee等[34]研究表明在透析患者中,Dkk1水平與腹主動脈鈣化程度稱負相關。在一項涉及706例普通人群的前瞻性研究中,Dkk1水平與CVD密切相關,其中以腦卒中事件為主[35]。然而,在另一項涉及125例血液透析患者的前瞻性研究則認為是骨硬化蛋白而非Dkk1與CVD相關[29]。

小結：近年來,人們一直深入研究CKD患者VC發(fā)生與發(fā)展的病理生理機制,并試圖尋找可靠的血清學生物標志物,這對于早期診斷、早期干預以及改善預后十分重要。但是目前的生物標志物研究均處于臨床研究階段,尚未廣泛應用于臨床。因此本文梳理了傳統(tǒng)的VC標志物(如MGP、PPi、OPG、OC)的診斷價值,同時也分析了新型標志物(如CCP、FGF-23、Klotho蛋白、骨硬化蛋白、Dkk1)的研究結果(表1),為進一步深入研究和未來的臨床應用提供了新思路。

表1 慢性腎臟病患者VC生物標志物