武丹彤，常亞娟，王瑤，艾民，匡海學

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室，哈爾濱 150040)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種病因尚未完全闡明的慢性自身免疫性結(jié)締組織疾病。在全球范圍內(nèi)，SLE發(fā)病率為每年0.3/10萬人～23.2/10萬人，其發(fā)病多見于育齡期女性，女性患病率明顯高于男性，男女患病比例約為1∶9[1-2]。SLE的確切病因尚不明確且發(fā)病機制涉及多個因素，包括遺傳易感性、環(huán)境因素和雌激素等[3-4]。其特征為存在多種自身抗體和免疫復合物積累，伴有補體系統(tǒng)的參與及慢性炎癥[5-6]。SLE具有廣泛的臨床表現(xiàn)，可累及全身多個器官，包括大腦、心臟、腎臟和皮膚等[7-8]。由于SLE的異質(zhì)性，目前臨床缺乏敏感性和特異性良好的檢驗標志物，隨著相關(guān)檢驗技術(shù)手段的進步，近年開展了有關(guān)SLE患者臨床診斷技術(shù)的研究[9]。代謝組學是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學后發(fā)展起來的一門全新學科，具有整體、動態(tài)、綜合的特點，是一種基于整體性分析的技術(shù)[10]。近年隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，人們對包括SLE在內(nèi)的復雜疾病的病因和發(fā)病機制有了更多的了解，代謝組學在SLE領(lǐng)域的研究也越來越受到關(guān)注[11-12]。由于尿液標本獲取方便且無創(chuàng)傷性，代謝物豐富并能夠反映體內(nèi)整體代謝水平，今后隨著檢測設(shè)備和生物信息學技術(shù)的發(fā)展，尿液代謝物的定性和定量檢測將成為醫(yī)學研究和臨床應(yīng)用的重要手段[13]。現(xiàn)就尿液代謝組學在SLE臨床診斷和藥物評價中的應(yīng)用進展予以綜述。

1 SLE臨床診斷現(xiàn)狀

2019年，美國風濕病學會和歐洲抗風濕病聯(lián)盟聯(lián)合發(fā)表了SLE最新分類標準，其診斷的靈敏度為96.1%，特異度為93.4%[14]。該分類標準將抗核抗體滴度≥1∶80作為SLE入圍指標，之后按照7種臨床表現(xiàn)和3個免疫學指標進行加權(quán)評分，總分超過10分考慮診斷為SLE[15]。

目前，對于SLE尚無準確的早期診斷和疾病監(jiān)測指標,醫(yī)師常根據(jù)患者就診的臨床癥狀(如臉部蝴蝶斑疹、關(guān)節(jié)腫脹、發(fā)熱、疲勞)和常規(guī)檢驗指標(抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗Sm抗體、補體C3、C4等)進行診斷，但這些指標的敏感性和特異性有限[16-17]。狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是一種嚴重的SLE累及腎臟的并發(fā)癥，據(jù)統(tǒng)計SLE患者中約40%會發(fā)展為LN，而在這些患者中約10%會發(fā)展為終末期腎病。當前診斷和監(jiān)測LN依賴于腎活檢，但費用較高、操作復雜，且樣本可能不能代表整個腎臟的狀況[18]。因此，早期發(fā)現(xiàn)和及時治療可能對SLE及其并發(fā)癥的發(fā)生率和病死率產(chǎn)生重大影響，但是當前的診斷技術(shù)尚無法滿足臨床需求，臨床急需操作簡便、準確率和靈敏度高的診斷方法[19-20]。

2 代謝組學技術(shù)概述

代謝組學這一概念于1999年首次提出，主要是指運用現(xiàn)代檢測技術(shù)結(jié)合生物信息學分析方法對生物體內(nèi)組織、細胞或體液中分子量<1 500的內(nèi)源性小分子代謝物進行定性或定量檢測，獲得機體在病理生理刺激或環(huán)境因素變化等不同影響下的差異代謝標志物[21-22]。

2.1代謝組學的分類和研究過程 根據(jù)研究目的，代謝組學可分為非靶向代謝組學和靶向代謝組學。其中，非靶向代謝組學可同時檢測樣品中所有可檢測的代謝物，分析每個樣品中已知和未知代謝物，檢測后產(chǎn)生大量復雜的數(shù)據(jù)，需要結(jié)合高性能的生物信息學工具進行分析。但這些化合物中大部分的結(jié)構(gòu)仍然未知，因此化合物鑒定是非靶向代謝組學的一大障礙，目前該項技術(shù)主要應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)潛在的差異代謝標志物[23]。靶向代謝組學使用標準品定量檢測樣品中特定的代謝物，檢測結(jié)果具有良好的精確度和準確度，并與已知參考范圍進行比較，分析差異代謝物變化的潛在生物學機制[24]。

代謝組學的研究過程包括前期的樣品采集和制備、中期的代謝物檢測和數(shù)據(jù)采集，以及后期的數(shù)據(jù)分析等環(huán)節(jié)[25]。首先收集血液、尿液、糞便等生物樣品，將標本進行離心或均質(zhì)化處理后通過核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)或質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)技術(shù)檢測樣品中所有代謝物的種類和含量，從中收集原始光譜數(shù)據(jù)并通過多元統(tǒng)計分析以及各種聚類和分類技術(shù)對大量原始數(shù)據(jù)進行篩選，通過化合物數(shù)據(jù)庫與標準化合物進行比對，準確識別代謝物。然后以散點圖或氣泡圖等形式展示所得數(shù)據(jù)。代謝物是生物體內(nèi)各種酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物，代謝組學對體內(nèi)代謝物進行全面系統(tǒng)的分析，闡述生物體在各種因素刺激下的代謝變化[26]。

2.2代謝組學的檢測平臺 目前，代謝組學主要運用液相色譜(liquid chromatography，LC)-MS聯(lián)用、氣相色譜(gas chromatography，GC)-MS聯(lián)用和NMR等高通量、高分辨率和高靈敏度的代謝分析平臺[27]。鑒于每個檢測平臺各自的優(yōu)缺點，它們已單獨或組合應(yīng)用于非靶向和靶向代謝組學研究，檢測氨基酸、脂質(zhì)、碳水化合物等物質(zhì)[28]。MS法利用不同代謝物離子化后的化合物通過色譜柱的時間不同進行分離，根據(jù)不同化合物產(chǎn)生不同的峰值強度確定代謝物的分子量。MS法中LC-MS技術(shù)具有良好的靈敏度和廣泛的代謝物檢測范圍，其利用極性、離子質(zhì)荷比和分子大小的差異使代謝物分離，但穩(wěn)定性較差且化合物鑒定難度大，該技術(shù)可以對大量代謝物進行分離，提供較全面的代謝組學數(shù)據(jù)[29]。GC-MS技術(shù)性能穩(wěn)定且重現(xiàn)性好，主要用于分離低分子量揮發(fā)性化合物，但樣品制備操作煩瑣，且這種技術(shù)分析的代謝物必須熱穩(wěn)定性良好且呈非極性。目前通過衍生化增加分析物的揮發(fā)性，但操作耗時較長且生成的產(chǎn)物穩(wěn)定性較差，測量結(jié)果可能無法完全反映代謝物的原始濃度。由于揮發(fā)性和極性的限制，GC-MS識別代謝物的數(shù)量相對較少，目前GC-MS主要應(yīng)用于靶向代謝組學[30]。而NMR技術(shù)樣品制備容易，結(jié)果重現(xiàn)性高，但靈敏度較低且受pH值影響，考慮到尿液標本可能存在低豐度代謝物且尿液pH值變化較大，因此NMR不是尿液代謝組學生物標志物的理想分析技術(shù)[31]。目前，LC-MS是應(yīng)用最廣泛的尿液代謝組學分析技術(shù)，但在靈敏度、分辨率、檢測限等方面仍需要不斷改進，且較GS-MS缺乏成熟的商業(yè)化代謝物數(shù)據(jù)庫。

3 尿液代謝組學與SLE

尿液標本獲取方便、無創(chuàng)傷性、經(jīng)濟有效，身體大部分最終代謝物均集中在尿液。尿液代謝組學可定性或定量分析SLE患者內(nèi)源性小分子代謝物，衡量機體特定疾病或治療干預的細微代謝差異。經(jīng)大規(guī)模臨床研究驗證后，尿液代謝物可作為疾病診斷和病情評估的潛在生物標志物。近年來，尿代謝組學已成為發(fā)現(xiàn)非侵入性生物標志物的重要研究手段[32-33]。有學者已開展多項利用GC-MS、LC-MS和NMR等分析手段對SLE患者血液、尿液標本進行相關(guān)代謝組學分析的研究[34-35]。研究結(jié)果表明，尿液代謝組學在SLE鑒別診斷、藥物有效性評價等方面具有良好的效果，是一種在SLE及其并發(fā)癥早期診斷、早期治療和藥物研發(fā)方面具有廣闊應(yīng)用前景的新型檢測技術(shù)。

3.1尿液代謝組學在SLE診斷中的應(yīng)用 Alonso等[36]使用NMR技術(shù)對1 210例包括SLE在內(nèi)的6種免疫介導的炎性疾病患者和100例對照者尿液標本進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)這些患者(尤其是臨床癥狀相似的患者)表現(xiàn)出相似的尿液代謝變化；且與對照者相比，炎性疾病患者尿液中涉及三羧酸循環(huán)、苯丙氨酸代謝和甘氨酸-絲氨酸代謝途徑的代謝物含量增加，提示尿液代謝標志物在免疫介導的炎性疾病方面具有重要作用。Yan等[37]通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測28例SLE患者和47名健康受試者尿液代謝生物標志物發(fā)現(xiàn)，在包含氨基酸、核苷酸、脂肪酸、尿酸鹽等在內(nèi)的70種代謝物中，SLE患者尿液中23種代謝物水平顯著升高，代謝途徑涉及纈氨酸、亮氨酸以及異亮氨酸的降解和生物合成、嘧啶代謝、嘌呤代謝、三羧酸循環(huán)、肌醇磷酸代謝等，提示SLE會干擾能量代謝、核苷酸代謝、氧化應(yīng)激和腸道微生物代謝。當前LN的診斷是基于血清自身抗體和侵入性腎活檢檢測，有學者使用NMR技術(shù)比較14例LN患者、10例SLE患者和11名健康對照者的尿液代謝情況，通過主成分分析法和正交偏最小二乘判別分析法篩選差異代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-丙氨酸、2，2-二甲基水楊酸和3，4-二羥基苯基乙醛對LN的診斷具有很高的敏感性和特異性，是值得未來深入探究的3個候選標志物[38]。另一項早期研究使用NMR技術(shù)對LN患者和局灶節(jié)段性腎小球硬化患者尿液進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)與非膜性LN(Ⅲ/Ⅳ級)患者尿液代謝物相比，膜性LN(Ⅴ級)患者尿液代謝物中的檸檬酸水平下降，但牛磺酸水平升高，而檸檬酸和?；撬崾呛饬磕I小管細胞功能的指標[39]。未來這些尿液代謝物在大規(guī)模臨床研究中得到證實后，將有望作為潛在的診斷標志物，以幫助臨床區(qū)分不同類型的LN患者。

3.2尿液代謝組學在SLE藥物治療評價中的應(yīng)用 為了研究中藥復方解毒祛瘀滋陰方對SLE治療效果及分析代謝物特征，有學者應(yīng)用GC-MS法對使用解毒祛瘀滋陰方的SLE模型小鼠進行尿液代謝組學檢測。結(jié)果表明，解毒祛瘀滋陰方治療后的SLE模型小鼠的尿代謝物水平與正常對照小鼠接近[40]，且治療組SLE模型小鼠尿液中的檸檬酸、蘋果酸等11種代謝物與能量代謝和氨基酸代謝途徑有關(guān)，這些結(jié)果可為進一步探索中藥治療SLE的機制提供實驗依據(jù)。Ganguly等[41]使用NMR技術(shù)對18例經(jīng)腎活檢確診的LN患者和18名健康對照者進行尿液代謝組學檢測，以評估環(huán)磷酰胺治療前后尿液檸檬酸和乙酸的排泄水平。結(jié)果顯示，與健康對照者相比，LN患者尿液中的檸檬酸/肌酐比值顯著降低，乙酸鹽/肌酐比值升高；環(huán)磷酰胺治療6個月后，檸檬酸/肌酐比值顯著升高，而乙酸鹽/肌酐比值無明顯變化。且在LN患者尿液中檸檬酸水平的變化與SLE疾病活動度評分呈正相關(guān)，該研究表明尿液代謝物檸檬酸有望作為LN藥物治療評價的潛在標志物。

3.3尿液代謝組學在SLE應(yīng)用中的局限性 目前，尿液代謝組學在SLE疾病診斷、機制探討、臨床用藥等方面仍處于起步階段。雖然任何體液樣本均可以用作臨床生物標志物，但尿液標本含量豐富并可以通過非侵入性方式獲得，對于嬰幼兒、老年人等不能輕易提供足量血液樣本的患者是一個理想的選擇[13]。保持尿液中代謝物的穩(wěn)定性對于保證檢測結(jié)果準確可靠和后續(xù)分析至關(guān)重要，然而尿液代謝物很容易受溫度、儲存時間和細菌污染等因素的影響，因此尿液樣本收集和制備過程中需盡量保持原始樣本的代謝物狀態(tài)，并減少尿液代謝物損失和降解[42-43]。目前，關(guān)于尿液標本采集以及樣品制備等環(huán)節(jié)尿液代謝物穩(wěn)定性的研究較少，尿液代謝組學標本采集、樣品制備以及儲存尿液樣本的條件等尚缺少統(tǒng)一的標準操作程序[44]。此外，雖然近年來代謝組學相關(guān)檢測設(shè)備和生物信息學技術(shù)不斷發(fā)展，但是目前每種代謝組學檢測平臺均不能對樣品中所有代謝物進行全面的定性和定量檢測，且不同組學(基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學等)的數(shù)據(jù)沒有很好的整合，從一種組學方法獲得的測量結(jié)果很難與通過其他組學獲得的數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)。整合多組學數(shù)據(jù)集進行整體綜合分析，進而揭示SLE發(fā)生發(fā)展的復雜機制，還需今后不斷改進和發(fā)展基于MS的數(shù)據(jù)處理技術(shù)和生物信息學分析軟件[45]。

4 小 結(jié)

SLE是一種復雜的多系統(tǒng)自身免疫性疾病，早期臨床表現(xiàn)不明顯，診斷較為困難，當前臨床檢測手段雖然具有一定的敏感性和特異性，但通常會導致診斷延遲或漏診，因此急需尋找更好的用于SLE的診斷、監(jiān)測并闡明SLE發(fā)病機制的生物標志物。代謝組學研究可以在代謝水平發(fā)現(xiàn)疾病的標志物，輔助疾病的早期診斷，為臨床診療提供參考。隨著代謝組學相關(guān)檢測技術(shù)不斷發(fā)展，尿液代謝組學已被應(yīng)用于糖尿病、腫瘤等疾病領(lǐng)域并取得良好成果[46-47]。

與基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學相比，代謝組學是一門新興學科。代謝物可作為許多疾病的檢測生物標志物，它們是體內(nèi)合成代謝和分解代謝途徑的最終產(chǎn)物，提供個體生理狀態(tài)的準確表征[48]。目前代謝組學研究結(jié)果臨床轉(zhuǎn)化尚處于早期階段，此類技術(shù)的臨床廣泛應(yīng)用仍需進一步驗證[49]。未來隨著尿液標本規(guī)范性處理和檢驗技術(shù)進一步完善，尿液代謝組學在SLE發(fā)病機制研究、疾病預測、診斷分期和個性化治療等方面的應(yīng)用將具有廣闊前景。